차가버섯에탄올 추출물과 에틸아세테이트 및 물 분획물 그리고 수용성 다당과 불용성 다당 I, II에 대하여 항돌연변이원성 실험과 암세포성장억제 실험을 행한 결과, 각 시료에서 돌연변이원성은 없는 것으로 나타났으며 직접변이원인 MNNG와 4NQO, 간접변이원인 B[a]P와 Trp-P-1 모두에서 시료농도 50$\mu\textrm{g}$/plate에서 불용성 다당 II가 90% 이상의 높은 억제효과를 나타내었다. 또한 암세포 성장 억제 실험에서는 에틸아세테이드 분획물에서 다른 분획이나 시료들보다 시료농도 4 mg/mL에서 A549, AGS, 그리고 MCF-7극 세포에 대하여 각각 90.8%, 94.3%, 83.5%의 높은 암세포 성장억제 효과를 나타내었다.
차가버섯 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 및 물 분획물 그리고 수용성 다당과 불용성 다당 I, II에 대하여 항돌연변이원성 실험과 암세포성장억제 실험을 행한 결과, 각 시료에서 돌연변이원성은 없는 것으로 나타났으며 직접변이원인 MNNG와 4NQO, 간접변이원인 B[a]P와 Trp-P-1 모두에서 시료농도 50$\mu\textrm{g}$/plate에서 불용성 다당 II가 90% 이상의 높은 억제효과를 나타내었다. 또한 암세포 성장 억제 실험에서는 에틸아세테이드 분획물에서 다른 분획이나 시료들보다 시료농도 4 mg/mL에서 A549, AGS, 그리고 MCF-7극 세포에 대하여 각각 90.8%, 94.3%, 83.5%의 높은 암세포 성장억제 효과를 나타내었다.
This study was performed to determine the antimutagenic and cytotoxic effects of ethanol extract, ethylacetate fraction, water fraction and water soluble and insoluble polysaccharides I and II isolated from Inonotus obliquus using Ames test and SRB assay. Each sample itself did not show mutagenic ef...
This study was performed to determine the antimutagenic and cytotoxic effects of ethanol extract, ethylacetate fraction, water fraction and water soluble and insoluble polysaccharides I and II isolated from Inonotus obliquus using Ames test and SRB assay. Each sample itself did not show mutagenic effect. Among samples, the water unsoluble polysaccharides II in the presence of 50 $\mu\textrm{g}$/plate showed the strongest antimutagenic effect with over 90% against MNNG, 4NQO, B(a)P and Trp-P-l. However, ethyl acetate fraction (1 mg/mL) which had 90.8%, 94.3% and 83.5% inhibitory effect against on MCF-7, A549, AGS showed the strong cytotoxic effect compared to other samples.
This study was performed to determine the antimutagenic and cytotoxic effects of ethanol extract, ethylacetate fraction, water fraction and water soluble and insoluble polysaccharides I and II isolated from Inonotus obliquus using Ames test and SRB assay. Each sample itself did not show mutagenic effect. Among samples, the water unsoluble polysaccharides II in the presence of 50 $\mu\textrm{g}$/plate showed the strongest antimutagenic effect with over 90% against MNNG, 4NQO, B(a)P and Trp-P-l. However, ethyl acetate fraction (1 mg/mL) which had 90.8%, 94.3% and 83.5% inhibitory effect against on MCF-7, A549, AGS showed the strong cytotoxic effect compared to other samples.
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문제 정의
이와 같이 차가버섯에 대해서는 오래전부터 여러 가지 생리 활성 연구가 이 루어져 왔다. 따라서 본 연구에서는 이와 같이 여러 가지 기능성 성분을 함유하고 있는 차가버섯에 대하여 좀더 구체적인 항암활성을 구명 하여 새로운 암예방 및 항암소재로서의 개발을 목적으로 항돌연변이활성 및 세포독성 효과를 실험하였으며 그 결과를 밝힌다.
활성성분대무분 버섯 자실체나 액체 배양균사체로부터 추출된 다당 류들로서 대표적으로 표고버섯 자실체에서 분리한 순수 다 당게 lentinan이 sarcomaT80에 대하여 강한 항암작용을 나 타낸다고 보고되었다(17). 본 실험 결과에서는 차가버섯 추 출룰 다당류에서 부동한 암 세포에 대하여 비교적 높은 암세 포 성장 억제 효과를 나타내어 기능성 식품소재로서의 가능성을 제시하였다.
본 실험에서는 암세포로 인간 폐암세포 A549, 인간 유방암세포 MCF-7과 인간 위암세포 AGS를 이용하여 이들 암세포주에 대하여 SRB assay를 이용한 차가버 섯 분획 물의 저 해효과를 검토하였다. 그 결과 Fig.
제안 방법
배양하면서 실험에 사용하였다. A549, MCF-7, AGS 세 포주는 RPMI Medium 1640 복합배 지 를, 그리고 293 세포주는 MEM(minimum essential medium)을 이용하여 1C% fetal bovine serum을 첨가하여 37℃, 5% CO2에 적 응시켜 각각 배양시켰다. 실험에 사용한 Salmonella typhimurium LT-2의 histidine 영양요구성 변이주(auxotroph)는 TA98 TA100의 두 종류였으며, 미국 Califonia 대학의 B.
그■리 고 microsomal enzyme의 대 사활성 에 의해 서 만 돌연변 >1 원성을 나타내는 간접변이원으로서 실제로 식품을 통해 흡수될 수 있는 B(a)P과 아미노산 가열분해물인 Trp-PT을 사牛하여 실험을 수행하였다. Trp-P-l(0.
이것을 37℃에서 20분간 진탕배양한 다음 histidine/ biotin이 첨가된 top agar(45℃)를 2 ml/4] 가하여 잘 혼합후에 미리 조제 해 놓은 minimal glucose agar plate상에 도말하고 평 판고화시 켜 37℃ 배양기 에서 48시간 배양하여 생성 된 복귀돌연변이수를 측정하여 추출물의 돌연변이원성의 유무를 판정하였다. 그리고 항돌연변이원성 실험은 건열멸균시 킨 glass cap tube에 추출물 및 분획 물들을 각각의 농도별로 50 UL씩 첨 가하고 변이 원 물질을 각각 50 HL씩 첨가한 다음 대 사활성 물질이 필요한 경우에는 S-9 mix를 250 UL를 각각 첨가하였다. 여기에 전배양시킨 S.
열수추출 후 잔사를 10% ZnCb로 100℃에서 8시간 3회 추출한 후 5% NaOH 용액 으로 24시 간, 2회 추출하였다. 여 기 서 얻은 상등액을 99% 초산용액을 가하여 pH 5로 산성화하고 세척하여 불용성 조다당 분획 I, II를 얻었다.
2 M sodium phosphate buffer를 가하여 최종부피가 700 虬가 되도록 하였다. 이것을 37℃어' 서 20분간 진탕배양한 다음 상기의 돌연변이원성 실험과 i 은 방법으로 실험하여 생성된 복귀돌연변이 colony수를 측정하여 항돌연변이원성 유무를 판정하였다. 각 시료와 변。' 원 물질의 농도는 예비실험을 통하여 결정하였으며 항돌연변이 활성은 변이원물질의 활성에 대한 시료의 억제율(inhibition, %)로 나타내었다.
4)로 전체 량이 700 UL가 되 도록 하였다. 이것을 37℃에서 20분간 진탕배양한 다음 histidine/ biotin이 첨가된 top agar(45℃)를 2 ml/4] 가하여 잘 혼합후에 미리 조제 해 놓은 minimal glucose agar plate상에 도말하고 평 판고화시 켜 37℃ 배양기 에서 48시간 배양하여 생성 된 복귀돌연변이수를 측정하여 추출물의 돌연변이원성의 유무를 판정하였다. 그리고 항돌연변이원성 실험은 건열멸균시 킨 glass cap tube에 추출물 및 분획 물들을 각각의 농도별로 50 UL씩 첨 가하고 변이 원 물질을 각각 50 HL씩 첨가한 다음 대 사활성 물질이 필요한 경우에는 S-9 mix를 250 UL를 각각 첨가하였다.
SRB assay의해 측정하였다(13). 즉, 10% fetal bovine serum 및 각각의 암세포(A549, MCF-7, AGS, 293)를 함유하는 RPMI 1640 배지를 5Xlb cells/mL 농도로 100 HL씩각 well에 첨가하여 24시간 동안 배 양(37℃, 5% CO2) 시 킨 후 0.2 M 이 하의 DMSO로 녹인 시료를 0.25, 0.5, 0.75, 1.0 mg/ mL 농도로 100 RL씩 첨가하여 48시간 동안 다시 배 양하였다. 그 후 상등액을 aspirator로 조심스럽 게 제거하고 냉장보관한 10%(w/v) TCA를 100 UL씩 첨가한 후 1시간 동안 4℃ 에서 방치한 후 증류수로 다섯번 정도 헹구었다.
차가버섯 분획물의 돌연변이원성 억제작용을 검토하기 위하여 Ames test에서 양성반응을 나타내며, 직접 변이원물질로 알려진 MNNG와 4NQO 그리고 대사활성을 필요로 하는 간접변이원물질인 B(a)P과 Trp-P-1 을 사용하여 각각의 농도에 따른 돌연변이원성 억제효과를 검토하였다.
차가버섯의 각 분획물에 대한 돌연변이원성 실험은 %/- monella typhimurium의 변이주인 TA98과 TA100을 이용하여 Ames test를 개량한 preincubation법(12)으로 실시하였으며, 대사 활성물질로서 S-9 mix를 첨가하였다. 차가버섯의 분획물들을 미리 건열 멸균시 킨 glass cap tube에 각각의 농도별로 50 (1L씩 을 가하고 여 기 에 전배 양시 킨 S.
차가버섯의 분획물들을 미리 건열 멸균시 킨 glass cap tube에 각각의 농도별로 50 (1L씩 을 가하고 여 기 에 전배 양시 킨 S. typhimurium 배양균액을 100 UL씩을 가한 다음 0.2 M sodium phosphate buffer(pH 7.4)로 전체 량이 700 UL가 되 도록 하였다. 이것을 37℃에서 20분간 진탕배양한 다음 histidine/ biotin이 첨가된 top agar(45℃)를 2 ml/4] 가하여 잘 혼합후에 미리 조제 해 놓은 minimal glucose agar plate상에 도말하고 평 판고화시 켜 37℃ 배양기 에서 48시간 배양하여 생성 된 복귀돌연변이수를 측정하여 추출물의 돌연변이원성의 유무를 판정하였다.
얻어진 잔사를 95℃, 8시간씩 3회 추출한 후, 상등액의 4배의 ethan이을 첨가하여 수용성 조다당을 침전시켰다. 침 전물을 30%의 (NH4)2SO4 용액으로 투석 하여 분자량 10.00C 이상의 수용성 조다당 분획을 얻었으며, 침전여액은 에틸 아세테이트 용액으로 분획하여 에틸 아세테이트 분획물과 물분획물을 얻었다.
대상 데이터
(DPPH), D-biotin, 。-NADP, glucose-6-phosphate(G-6- P) gentamycin sulfate, sulforhodamine B(SRB)는 미국 Si/ma사의 것을, benzo( a )pyrene (B( a )P)과 3-amino- 1/ -dimethyl- 5H -pyrido-(4, 3_b)indol (Trp P- 1), L-histi- dinee 일본 和光純藥 특급시약을 사용하였다. Nutrient bmth는 Difco laboratory(USA)사의 것을 사용하였다.
RPMI 16 40과 Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), min - irrum essential medium (MEM) 및 Hepes buffer, fetal bovine serum(FBS), Tripsin-EDTA는 Gibco사(USA) 제품을 사용하였다. Giemsa stain solution (Gurr 66)는 British drug hcuse(BDH)사의 제품을 사용하였으며 그외 일반시약은 특급시약을 사용하였다.
Nutrient bmth는 Difco laboratory(USA)사의 것을 사용하였다. RPMI 16 40과 Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), min - irrum essential medium (MEM) 및 Hepes buffer, fetal bovine serum(FBS), Tripsin-EDTA는 Gibco사(USA) 제품을 사용하였다. Giemsa stain solution (Gurr 66)는 British drug hcuse(BDH)사의 제품을 사용하였으며 그외 일반시약은 특급시약을 사용하였다.
), Colony counter(Protos plus, Synoptics Co.), CO? incubator(KMC -8409C, Vision Co.), Freeze dryer(VD- 16, T aitec Co.), Optical density (ANA 1, Tokyo photoelec trie Co.) 그리고 Centrifuge(HmT50 IV, Hanil Industrial C<>.)를 사용하였다.
본 실험에 이용된 암세포주는 인간 폐암세포 A549(lung carcinoma, human), 인간 유방암세포 MCF-7(breast ade- nc carcinoma, pleural effusion, human), 인간 위 암세포 AGS (s:omach adenocarcinoma, human)가 이용되었고, 정상세포로는 293(transformed primary human embryonal kid- ney)을 Korea Cell Line Bank(KCLB)로부터 구입하여 본 실험실에서 배양하면서 실험에 사용하였다. A549, MCF-7, AGS 세 포주는 RPMI Medium 1640 복합배 지 를, 그리고 293 세포주는 MEM(minimum essential medium)을 이용하여 1C% fetal bovine serum을 첨가하여 37℃, 5% CO2에 적 응시켜 각각 배양시켰다.
A549, MCF-7, AGS 세 포주는 RPMI Medium 1640 복합배 지 를, 그리고 293 세포주는 MEM(minimum essential medium)을 이용하여 1C% fetal bovine serum을 첨가하여 37℃, 5% CO2에 적 응시켜 각각 배양시켰다. 실험에 사용한 Salmonella typhimurium LT-2의 histidine 영양요구성 변이주(auxotroph)는 TA98 TA100의 두 종류였으며, 미국 Califonia 대학의 B.N. Ames 로부터 제공 받았다.
실험에 사용한 차가버섯은 러시아에서 수입한 것으로, 건조, 분말화한 후 -20℃ 냉동실에 보관하면서 실험에 사용하였다. 차가버 섯을 분말화한 후 Mizuno 등(11)의 방법에 따라 추출, 분획하였다.
이론/모형
SRB assay의해 측정하였다(13). 즉, 10% fetal bovine serum 및 각각의 암세포(A549, MCF-7, AGS, 293)를 함유하는 RPMI 1640 배지를 5Xlb cells/mL 농도로 100 HL씩각 well에 첨가하여 24시간 동안 배 양(37℃, 5% CO2) 시 킨 후 0.
차가버 섯을 분말화한 후 Mizuno 등(11)의 방법에 따라 추출, 분획하였다. Fig.
성능/효과
MNNG(0.4 pg/plate)의 경우 S. typhimurium TA100 균주에 서 시 료농도 501ig/plate에서 수용성 다당과 불용성 다당- II 가 각각 99.1% 및 91.0%로 높은 억 제효과가 나타났다. 그외의 분획물들은 저분자 물질, 에틸 아세테이트, 물 분획물 및 불용성 다당T이 각각 86.
8%의 억 제효과를 보였다. TA100 균주의 경우, 저분 자 물질, 에 틸 아세테이트, 물 분획 물, 수용성 다당, 불용성다당-:[은 시료농도 20 ug/plate에서 각각 53%, 79%, 81%, 92.4% 그리고 93.0%의 억제효과를 나타내었으며 불용성 다당』는 시료농도 50 Ug/plate에서 85.3%의 강한 억 제효과를 보였다.
대하여 SRB assay를 이용한 차가버 섯 분획 물의 저 해효과를 검토하였다. 그 결과 Fig. 6에서와 같이 A549 세포에 대한 분획물들의 억제효과에서는 4 mg/mL 첨가시 물 분획물과 수용성 다당과 불용성 다당口 그리고 저분자 물질이 각각 83.3%, 82.2%, 78.6%, 및 68.4%의 비교적 높은 억 제효과를 보였으며, 에 틸 아세 테 이 트 분획 물과, 불용성 다당 Ie 1 mg/ mL 첨가시 90.8%와 81.8%의 높은 억 제효과를 나타내었다. AGS 세포의 경우 Fig.
1%로 높은억 제효과를 나타내었다. 그 외의 저분자 물질과 에틸 아세테이트 및 물분획물이 각각 84.0%, 81.5%, 87.9%의 억제효과를 보였다(Fig. 5).
억 제 효과를 나타내었다. 또한 암세포 성 장 억 제 실험 에 서는 에틸아세테이드 분획물에서 다른 분획이나 시료들보다 시 료농도 4 mg/mL에서 A549, AGS, 그리고 MCF-7 세 포에 대 하여 각각 90.8%, 94.3%, 83.5%의 높은 암세포 성 장억 제효과를 나타내었다.
에 탄올 추출물을 10, 15, 20, 50 Rg/plate의 여러 농도를 첨가하여 시험한 결과, 집락수가 음성대조군에 비하여 농도변화에 따른 집 락수의 큰 변화를 나타내지 않으므로 차가버섯 분획물 자체로는 돌연변이원성을 나타내지 않은 것으로 판단되었다.
typhimurium TA98 균주에서 는 시 료농 도 20 Ug/plate에서 저 분자 물질, 에 틸 아세 테 이 트, 물 분획물. 수용성 다당 및 불용성 다당 I 및 !! 에서 각각 55%, 46.5%, 58%, 36.3%, 43% 그리고 64.5%의 순으로 억 제효과를 나타냈 으나, TA100 균주의 경우, 시 료농도 50 Ug/plate에서 에 틸아세테이트 분획물 및 수용성 다당과 불용성 다당 I과 II에서 각 각 90.7%, 84.9%, 91.3%, 75.9%로 대부분의 시 료들이 80% 이 상의 억 제효과를 보였으며, 저분자 물질, 물 분획물이 각각 59 3% 및 9.6%의 억 제 효과를 나타내었다. 또한 B(tf )P(10 jug/plate)에 서 는 TA98 균주의 경우, 50 Ug/plate의 시 료농도에서 저분자 물질, 에틸 아세테이트, 물 분획물, 수용성 다당 및 불용성 다당 I과 n 에서 각각 63.
9%를 보였으며 , 저 분자 물질. 에틸 아세테이트 분획물, 불용성 다당-1은 각각 40.5% 및 72.0%, 84.8%의 억 제효과를 보였다. TA100 균주의 경우, 저분 자 물질, 에 틸 아세테이트, 물 분획 물, 수용성 다당, 불용성다당-:[은 시료농도 20 ug/plate에서 각각 53%, 79%, 81%, 92.
차가버섯 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 및 물 분획물 그리고 수용성 다당과 불용성 다당 I, Ⅱ에 대하여 항돌연변이원성 실험과 암세포성장억제 실험을 행한 결과, 각 시료에서 돌연변이원성은 없는 것으로 나타났으며 직접변이원인 MNNG와 4NQO, 간접변이원인 B[a]P와 Trp-P-1 모두에서 시료농도 50 Jig/plate에서 불용성 다당 II가 90% 이상의 높은 억 제 효과를 나타내었다. 또한 암세포 성 장 억 제 실험 에 서는 에틸아세테이드 분획물에서 다른 분획이나 시료들보다 시 료농도 4 mg/mL에서 A549, AGS, 그리고 MCF-7 세 포에 대 하여 각각 90.
2). 한편, Fig. 3은 4NQO(0.15 Ug/plate)에 대 환 항돌연변이성 을 나타낸 결과로서 TA98 균주에서 시료농도 50ug/plate에서 불용성 다당-日 이 96.2%의 높은 억 제효과를 보였으나, 수용성 다당, 물 분획물의 경우, 시료농도 20 μg/plate에서 각각 98.3%와 95.9%를 보였으며 , 저 분자 물질. 에틸 아세테이트 분획물, 불용성 다당-1은 각각 40.
후속연구
또한 Miyazaki 등(15)은 다당류인 글루칸을 동충하초로 부터 분리해 내어 항종양 효과를 마우스를 가지고 실험한 결과 매우 높은 효과를 나타내었다. 이러한 결과로부터 추후 차가버섯에 대한 더 세부적인 연구가 필요한 것으로 사료되었다.
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