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문제 정의
- 그러므로 천연물로부터 neurite outgrowth 증강작용과 더불어 신경활성을 갖는 저분자량화합물의 도출은 퇴행성뇌질환 치료제의 탐색방법으로 의미있다고 할 수 있겠다. 본 연구는 백강잠의 유용물질을 분리하여 그 구조를 규명하고 뇌신경세포성장 촉진효과를 검색코자 수행하였다.
제안 방법
- 1H- 및 13C-NMR spectrum은 Brucker AMX 500 spectrometer (VG Analytical, UK)로, MS spectrum은 VG70-VSEQ (VG Analytical, UK)으로 측정하였다. 주줄 및 column chromatography용 용매는 1급시약을, 기타 시약은 1급 또는 특급을 사용하였다.
- 배지로 교체하였다. 24시간이 지난 후부터 매일 일정한 시간에 위상차 현미경을 이용하여 cell body로부터 성장한 neurite의 정도를 관찰하였고 위상차 현미경을 이용하여 현미경 사진을 찍은 후에 인화된 사진을 이용하여그 길이를 측정하였다. neurite outgrowth에 미치는 효과느 neurite길이가 보이지 않으면 0으로, cell body의 직경과 그 길이가 같으면+로, cell body 직경의 2배길이로 성장하였으면 ++로 정하고, 그 이상의 길이가 되면 +++으로 수치화 하였다.
- 접종한 지 24시간 후에 화합물의 최종농도는 각각 10μM, NGF는 50ng/ml의 농도로 처리하였다. 5% CO2와 95% O2 혼합공기 하에서 온도와 습도가 일정하게 유지되는 배양기에서 6일동안 배양하면서 neurite outgrowth정도를 관찰하였고 2일에 한 번씩 새로운 배지로 가해주었다.
- 얻었다. H-13 분획(4.6 g)에 대하여 디클로로메탄-메단올(1:1)을 유출용매로 한 세파덱스 LH-20 크로마토그래피를 수행한 후 역상 Lobar® A 컬럼 크로마토그래프](90% MeOH)를 수행하여 화합물 1(3 mg), 2(5 mg), 3(15 mg) 및 4(17 mg)를 얻었다. 부탄올 분획 30g을 헥 산-초산에 틸 -증루수(8:5:2)에서 메탄올까지 순차적으로 용매극성을 높여가며 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 수행하여 4개의 소쿤획 B1-B4을 얻었다.
- ICR 마우스와 SD.rat을 각각 10마리씩 나누어 백강잠추출물을 100, 250, 500 및 1000 mg/kg의 용량으로 경구투여하였다. 경구투여 후 2주간 독성 여부를 관찰한 결과 모든 군에서 한 마리도 사망하지 않았으며 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다.
- 24시간이 지난 후부터 매일 일정한 시간에 위상차 현미경을 이용하여 cell body로부터 성장한 neurite의 정도를 관찰하였고 위상차 현미경을 이용하여 현미경 사진을 찍은 후에 인화된 사진을 이용하여그 길이를 측정하였다. neurite outgrowth에 미치는 효과느 neurite길이가 보이지 않으면 0으로, cell body의 직경과 그 길이가 같으면+로, cell body 직경의 2배길이로 성장하였으면 ++로 정하고, 그 이상의 길이가 되면 +++으로 수치화 하였다. 각 well당 10개의 세포를 선정하여 cell의 neurite outgrowth정도를 측정하였다.
- neurite outgrowth에 미치는 효과느 neurite길이가 보이지 않으면 0으로, cell body의 직경과 그 길이가 같으면+로, cell body 직경의 2배길이로 성장하였으면 ++로 정하고, 그 이상의 길이가 되면 +++으로 수치화 하였다. 각 well당 10개의 세포를 선정하여 cell의 neurite outgrowth정도를 측정하였다.
- 분획하여 각각 55g, 6g 및 30g을 얻었다. 각 분획으로부터 활성 성분 분리를 수행하였다.
- 감압농축된 메탄올 추출물을 H2O에 현탁시킨후 헥산(800 mlx3), 클로로포름 (800 mlx2) 및 부탄올 (800 ml X2)로 분획하여 각각 55g, 6g 및 30g을 얻었다. 각 분획으로부터 활성 성분 분리를 수행하였다.
- 경구투여 ICR 마우스와 SD rat을 각각 10마리씩 나누어 백강잠 추출물을 25, 100, 250 및 500 mg/kg의 용량으로 복강투여하였다. 복강투여 후 24시간 독성 여부를관찰한 결과 500 mg/kg에서 2마리가 사망하였고 살아남은 동물의 경우 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼수 없었다.
- 6 g)에 대하여 디클로로메탄-메단올(1:1)을 유출용매로 한 세파덱스 LH-20 크로마토그래피를 수행한 후 역상 Lobar® A 컬럼 크로마토그래프](90% MeOH)를 수행하여 화합물 1(3 mg), 2(5 mg), 3(15 mg) 및 4(17 mg)를 얻었다. 부탄올 분획 30g을 헥 산-초산에 틸 -증루수(8:5:2)에서 메탄올까지 순차적으로 용매극성을 높여가며 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 수행하여 4개의 소쿤획 B1-B4을 얻었다. B2 분획에(1 g) 대하여 80% 메탄올을 유출용매로 하여 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그대피를 수행한 후 초산에틸-메탄올-증류수 (9:3:1)을 유 줄용 매로 한 아민 Sep-Pak으로 정제하여 화합물 5(100 mg) 을 얻었다.
- 90에서 아미드 탄소만이 관찰되었다. 분자식과 NMR 자료를 기초로 하여 화합물 7의 구조는 Urea로 추정하였으며, 표품과의 (Aldrich, 20, 888-4) 비교를 통하여 그 구조를 확정하였다.
- 25% trypsin-EDTA(Gobco BRL, USA)용액을 500 ㎕ 처리함으로써 세포들을 배양용기로부터 이탈시킨 후 10 ml의 신선한 배지로 trypsin-EDTA용액을 중화시키고 세포현탁액을 얻었다. 세포현탁액 20㎕에 0.4% tryphan blue (in PBS bufer) 10㎕을 가하여 염색한 후 hemocytometer를 이용하여 살아있는 세포수를 계산하였다. poly-D-lysin (Sigma, USA, 50 ug/ml)을 DPBS로 희석한 다음, 6well plate에 2 ml씩 가하여 37℃에서 1시간 이상 방치하였다.
- 4)로 washing한 다음 건조된 6well에 1 X 105 cells/well의 농도로 배양용기에 접종하여 배양하였다. 시료는 DMSO(Dimethylsulfoxide, Sigma, USA)에 녹여 이의 최종농도가 0.1% 이하가 되도록 한 후 0.22 nM 멸균용 필터를 이용하여 여과하였다. 접종한 지 24시간 후에 화합물의 최종농도는 각각 10μM, NGF는 50ng/ml의 농도로 처리하였다.
- 화합물 7은 녹는점 131。(2의 무색결정상 물질이다. 원소분석자료(C 20.4%, H 6.76%, N45.6%, O 27.24%)와 ESI MS 스펙트럼을 ([M+Na]+ m/z 83) 통하여 분자식을 CH4N2O 로 결정하였다. 화합물 7의 1H-NMR 스펙트럼에서는 55.
- 화합물 1에 염산 및 메탄올을 처리하여 얻어진 지방산 에스테르를 GC-MS로 분석한결과 octadecanoic acid methyl ester로 확인되었다. 이상의 자료를 통하여 화합물 1의 구조는(4E, 2S, 3R)-2-A, -octadecanoyl-4-tetradecasphingenine으로 확정하였다.
- 48에서 아미드의 탄소 피크를 관찰할 수 있었다. 이상의 자료를 통하여 화합물 6의 구조는 uracil로 추정하였으며 표 품과의 (Aldrich, 13, 078-8) 비교를 통하여 그 구조를 확정하였다.
- 접종한지 24시간 후에 1% FBS, 2% HS이 첨가된 신선한 배지로 교체하였다. 24시간이 지난 후부터 매일 일정한 시간에 위상차 현미경을 이용하여 cell body로부터 성장한 neurite의 정도를 관찰하였고 위상차 현미경을 이용하여 현미경 사진을 찍은 후에 인화된 사진을 이용하여그 길이를 측정하였다.
- 헥산분획 55 g에 대하여 헥산-초산에틸-메탄올 혼합용매로 메탄올 함량을 높여가며 실리카겔 크로마토그래피를 수행하여 4개의 소분획으로(H-l~H-4) 나눈 다음, H-1 분획(30 g)을 헥산-초산에틸(3:1)을 유출용매로 한 실리카겔컬럼 크로마토그래피에 적용하여 3개의 소분획을(H-11~H-13) 얻었다. H-13 분획(4.
대상 데이터
- 100 mm culture dish(TPP, Switzerland)에 3 X 104 PC 12 cells을 접종한 후, 2 g/L sodium bicarbonate, 5% horse serum, 10% fetal bovine serum(FBS) 및 penicillin-streptomycin (lOOOOU/ml) 1 %가 포함된 RPMI1640 배지 하에서 배양하였다. 이때 사용한 FBS는 사용하기 전 56℃에서 30분간 heat-inactivation시켜 사용하였다.
- 주줄 및 column chromatography용 용매는 1급시약을, 기타 시약은 1급 또는 특급을 사용하였다. Column chromatography용 silica gd은 Kiesel gel 60(70-230 and 230-400mesh, ASTM Art. 7734 and 9385, Merck)을 사용하였고, reverse phase column chromatography 용 충진제는 LiChroprep RP-18(40-63 μm, Art. 13900, Merck)를 사용하였다. TLC plate는 Kiesel gel 60 F254 precoated plate(Art.
- 또한 5% CO2와 O2 95% 배양기에서 70% 습도와 37℃ 온도 조건이 유지되게 한 후 배양하였다. 배지는 10 ml씩 매일 새로운 배지로 교체하였고, 세포 배양에 사용한 모든 시약은 GIBCO BRL 제품을 사용하였다.
- 화합물 1은 무정형 백색분말상으로서 EI-MS 스펙트럼에서 분자이온피크가 m/z 509에서 관찰되었다. IR 스펙트럼에서는 1650 cn"의 아미드 흡수대를 관찰할 수 있었다.
성능/효과
- 1H- NMR 스펙트럼에서는 53.3O(3H, s) 및 3.51(3H, s)에서 2 개의 NCH3 피크와 87.62( 1H, s)에서 이중결합수소 피크를 관찰할 수 있었고, 13C-NMR 스펙트럼에서는 829.17 및 30.23에서 2개의 NCI% 피크와 6116.72, 139.39, 150.76, 155.30 및 157.66에서 이중결합탄소의 피크들을 관찰할 수 있었다. 화합물 5의 'H- 및 '3C-NMR 스펙트럼은 dimethyl xanthine 유도체의 형태로서 화합물 5의 구조는 1, 7- dimethylxanthine으로 주정하였고 표품 1, 7-dimethylxanthine 의(Aldrich, 27, 151-9) 녹는점 및 NMR 자료와 비교하여완전히 일치함을 확인하였다.
- IR 스펙트럼에서는 3340 cm-1에서 수산기의 흡수대 및 1648 cm-1 에서 아미드기의 흡수대를 관찰할 수 있었다. 1H-NMR 스펙트럼에서 53.70( 1H, br.d, J=10.5 Hz), 3.89~3.96(2H, m) 및 4.39( 1H, br.s)의 피크들과 13C-NMR스펙트럼에서 555.16, 63.21 및 75.26의 피크들은 hydrocarbon chain에서 2-amino-l, 3-diol group의 전형적인 피 크로서 이 를 통하여 화합물 2는 sphingosine유도체와 유사한 구조를 가지는것으로 추정할 수 있었다. 상기한 피크를 제외하고 1H-NMR 스펙트럼에서는 50.
- s)에서 2개의 broad singlet 피크만이 관찰되었다. ”C-NMR 및 DEPT 스펙트럼에서는 653.8에서 아미노 메틸 탄소, 664.67에서 아미노메틸렌 탄소 및 6167.35에서카르보닐 탄소에 의한 피크를 관찰할 수 있었다. 이상의 자료를 통하여 화합물 8은 3개의 아미노 메틸기가 같은 자장 환경에 존재하며 한분자내에 암모늄 이온과 카르복실이온을 모두 가지는 양쪽성 이온(zwitterion>2로서 즉 N, N, N- trimethyl-amino acid 유도체임을 추정할 수 있었다.
- rat을 각각 10마리씩 나누어 백강잠추출물을 100, 250, 500 및 1000 mg/kg의 용량으로 경구투여하였다. 경구투여 후 2주간 독성 여부를 관찰한 결과 모든 군에서 한 마리도 사망하지 않았으며 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다.
- 뇌신경세포주(PC12)에 백강잠의 분획물(조추출물)을 10 ㎍/㎖의 농도로 처리한 결과 헥산분획층과 부탄올분획층에서 뇌신경세포성장을 촉진하는 활성을 나타내어 헥산 분획물로부터 화합물 4종(Fig.2: compound 1-4)과 부탄올분획물로부터 화합물 5종(Fig.2: compound 5-9)을 분리하여 각각의 화합물에 대하여도 검색한 결과 모두 뇌신경세포주 (PC 12)에 뇌신경세포 성장 촉진효과를 나타냈으며 특히이들중 3종(4E, 6E, 2S, 3R)-2-N-Eicosanoyl-4, 6-tetrade-casphingadienine, (4E, 6E, 2S, 3R)-2-N-Docosanoyl-4, 6-tetradecasphingadienine, Urea)의 화합물은 NGF보다 우수한 활성을 나타냈다. 또한 헥산분획물로부터 분리한 4종의 스핑고신 유도체는 천연에서 처음 보고되는 물질이다.
- 67, t) 만이 관찰되었다. 따라서 화합물 8는 N, N, N-trimetyl-glycine 구조로서 betaine임을 확인할 수 있었고 기존 문헌 자료를&⑹ 통하여 그 구조를 확정하였다.
- 80]. 따라서 화합물 9의 구조는 tyrosine 으로 추정하였고, 화합물 9의 NMR 자료와 표품 DL-tyrosine 의 (Aldrich, 14, 572-6) 자료를 비교하여 완전히 일치함을 확인하였다.
- IR 스펙트럼에서는 1650 cn"의 아미드 흡수대를 관찰할 수 있었다. 화합물 1에 염산 및 메탄올을 처리하여 얻어진 지방산 에스테르를 GC-MS로 분석한결과 octadecanoic acid methyl ester로 확인되었다. 이상의 자료를 통하여 화합물 1의 구조는(4E, 2S, 3R)-2-A, -octadecanoyl-4-tetradecasphingenine으로 확정하였다.
- 이중결합의 위치 및 geometry는 짝지음 상수 및 1H-1H COSY 자료를 통하여 확정할 수 있었다. 화합물 2의 acid methanolysis를 통하여 얻어진 지방산 에스테르는 GC-MS 분석결과 eicosanoyl methyl ester로 확인되었다. FAB-MS에서 화합물 2의 [M+Na]+ 이온의 CID(collision- induced dissociation) 스펙트럼은 m/z 318(296+Na-H)에서주이온 피크를 나타내었다.
- 1H 및 13C-NMR 자료는 화합물 3에는 단지 하나의 이중결합만이 존재하는 것을 제외하면 화합물 2과 매우 유사하였다. 화합물 3의 methanolysis를 통하여 얻어진 지방산 에스테르를 GC-MS로 분석한 결과 eicosanoyl methyl ester임을 확인할수 있었다. 화합물 3의 FAB-MS에서 [M+Na]+ 이온의 CID 스펙트럼은 m/z 320 (298+Na-H)의 주이온피크를 나타내었다.
- 화합물 4는 무정형 백색분말상으로서 HR-FAB-MS 스펙트럼을 통하여 분자량이 C40H77NO3임을 확인하였다. IR 스펙트럼에서는 3340 cnT’에서 수산기의 흡수대 및 1648cm- 1에서 아미드기의 흡수대를 관찰할 수 있었다.
- 1H 및 13C-NMR 자료는 화합물 2과 매우 유사하여 화합물 4는 화합물 2과 같은 구조를 가지며 단지 지방산 chain의 길이만이 차이가 있음을 추정할 수있었다. 화합물 4의 methanolysis를 통하여 얻어진 지방산에스테르를 GC-MS로 분석한 결과 docosanoyl methyl ester 임을 확인할수 있었다. 화합물 4의 FAB-CID MS 스펙트럼에서는 화합물 2에서와 같이 m/z 318의 이온피크가 관찰되었다.
- 66에서 이중결합탄소의 피크들을 관찰할 수 있었다. 화합물 5의 'H- 및 '3C-NMR 스펙트럼은 dimethyl xanthine 유도체의 형태로서 화합물 5의 구조는 1, 7- dimethylxanthine으로 주정하였고 표품 1, 7-dimethylxanthine 의(Aldrich, 27, 151-9) 녹는점 및 NMR 자료와 비교하여완전히 일치함을 확인하였다.
후속연구
- 이러한 결과로부터 백강잠 유래의 유효성분을 함유하는 추출물은 뇌졸중, 뇌허혈, 파킨슨, 노인성치매 및 헌팅턴질환을 포함하는 뇌질환 예방 및 치료를 위한 약학적 제제로 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
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