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문제 정의
- 예로, 젤 형성능의 경우 polyguluronate 조성이 높은 알긴 산으로 제조된 젤은 딱딱한 반면, polymannuronate 조성이 높은 알긴산을 사용한 경우 유연성이 우수한 젤을 제조 할 수 있다[1]. 본 연구에서는 생리활성 기능을 가진 알긴산 올리고당을 제조하기 기초 연구로써 알긴산 분해능이 있는 신규 미생물 균주를 선발하고 해양 미생물 유래의 alginase의 부분정제 및 분해 특성을 평가하고자 하였다
제안 방법
- 2에 제시되어 있다. 0.8%(w/v) Sodium alginate 기질에 대한 분해 활성이 있는 획분이 검출되었으며, 이 활성 획분을 모아 투석 및 농축시킨 다음, Sephacryl G-200 column을 사용하여 겔 여과 크로마토그래피를 실시하였다. Fig.
- Vibrio sp. AEBL-211를 0.8% (w/v) sodium alginate가 들어있는 액체배지에서 배양하여 제조한 조효소액을 이용하여 sodium alginate 기질에 대한 분해반응을 실시하여 알긴산 분해능을 평가하였다. 알긴산 분해과정에서 생성되는 환원당을 비교해 본 결과, Vibrio sp.
- Vibrio sp. AEBL-211의 균체외 및 균체내 alginase 효소의 활성 특성을 평가하기 위하여 효소를 부분적으로 정제하였다. 정제 방법 및 순서가 Fig.
- 우선, 알긴산 고체배지에서의 halo 크기가 크고 환원당 생성량이 가장 많은 해양 미생물을 선발하고, 생화학 및 영양적인 특성 분석 결과 등을 바탕으로 Vibro 속으로 동정하였다. DE 52-cellulose 및 Sephacryl G-200를 이용한 음이온 교환 및 gel permeation chromatography를 통해 부분 정제된 alginase 효소액을 얻었다. 부분 정제된 alginase 효소를 이용하여 guluronic acid에 대한 mannuronic acid의 비율이 다른 sodium alginate 시료에 대한 분해능을 평가한 결과, guluronic acid의 상대적 양이 많은 알긴산에 대한 활성이 상대적으로 우수하여 Vibrio sp.
- Fig. 1에 제시되어 있는 방법을 이용하여 상대적 alginase 활성이 높았던 균체내 조효소액으로부터 alginase의 부분정제를 실시하였다. 우선, 파쇄된 균체에서 얻은 상층액에 대하여 DE 52-cellulose를 사용한 이온교환 크로마토 그래피를 행한 결과가 Fig.
- 8%(w/v) Sodium alginate 기질에 대한 분해 활성이 있는 획분이 검출되었으며, 이 활성 획분을 모아 투석 및 농축시킨 다음, Sephacryl G-200 column을 사용하여 겔 여과 크로마토그래피를 실시하였다. Fig. 3과 같이 알긴산 분해능이 검출된 획분을 얻을 수 있었으며, 이러한 획분액을 투석 및 농축한 후 SDS-PAGE를 실시하였다. SDS-PAGE 젤의 30kDa 부근에서 band가 검출되어 Vibrio sp.
- 알긴산 분해 활성을 가지는 해양 미생물을 분리하기 위하여 부산 해운대 앞 바다에서 다양한 종류의 미역류를 채취하여 미생물 분리원으로 사용하였다. NaCl 2.5%(w/v), KH2PO4 0.1%(w/v), FeSO4·7H2O 0.05%(w/v), KCl 0.05% (w/v), NH4CI 0.1%(w/v), agar 2%(w/v)로 구성된 하층 평판위에 유일 탄소원으로 sodium alginate l%(w/v)을 첨가한 agar 2%(w/v)로 구성된 상층배지를 만든 다음, 무균의 homogenizer를 이용하여 균질화시킨 미역 샘플 0.1 ml를 spreading 하였다. 3~7일간 배양한 결과 알긴산을 유일탄소원으로 제공된 고체배지상에서 성장하는 콜로니를 다수 얻을 수 있었다.
- 분리된 균주는 rod 형태의 Gram-negative 균으로 spore가 없으며, 알긴산 한천 및 TCBS 평판에서의 콜로니 색깔은 노란색이 었다. Oxidase 및 nitrase는 양성이고, glucose, maltose, mannitol, N-acetyl-glucosamine, sorbitol 등을 대사하여 산을 생성하였다. GC content는 약 43% 정도였으며, 생화학 및 영양적인 특성 분석 결과와 Bergey's manual 등에 의해 Vibro 속으로 동정되였으며, Vibrio sp.
- USA)을 표준단백질로 하여 얻은 검량 곡선으로부터 구하였다. 분자량은 SDS-PAGE (12% polyacrylamide gel electrophoresis)에 의하여 측정하였다.
- 0 M까지 농도구배를 주면서 단백질을 용출시켰다. 용출액을 10 ml/tube로 분획하였으며, 활성분획을 회수하여 ultrafilteration cell (Amicon Co., MWCO: 12,000)을 이용하여 농축시킨 다음, gel filteration chromatography인 Sephacryl G-200 column (1.5×1 m)을 이용하여 정제하였다. 각 분리단계에서의 각각의 획분액에 포함된 총단백질 농도는 Bradford법을 이용하여 결정하였으며, 기준 물질로는 bovine serum albumin을 사용하였다.
- AEBL-211을 분리하였다. 우선, 알긴산 고체배지에서의 halo 크기가 크고 환원당 생성량이 가장 많은 해양 미생물을 선발하고, 생화학 및 영양적인 특성 분석 결과 등을 바탕으로 Vibro 속으로 동정하였다. DE 52-cellulose 및 Sephacryl G-200를 이용한 음이온 교환 및 gel permeation chromatography를 통해 부분 정제된 alginase 효소액을 얻었다.
- 일반적으로 sodium alginate의 점도가 높을수록 guluronic acid에 대한 mannuronic acid의 비율이 낮아지는 것으로 알려져있다[3,5,8]. 이러한 알긴산 조성의 차이를 alginase의 분해특성 평가에 활용하기 위하여, 부분 분리한 alginase 조효소를 이용하여 guluronic acid에 대한 mannuronic acid의 비율이 다른 고점성, 중간 점성, 낮은 점성을 가진 3종류의 Na-alginate 시료에 대한 분해능을 평가하였다. 12시간의 반응시간동안 분해과정을 측정한 결과, guluronic acid에 대한 mannuronic acid의 비율이 가장 낮은 고점성 알긴산 시료에서 상대적 alginate 분해 효율이 가장 높아 Vibrio sp.
대상 데이터
- 부산 해운대 앞 바다에서 채취한 다양한 종류의 미역 시료로부터 알긴산 분해 균주를 선별하였다. 균주 분리용 다층 평판배지의 하층은 NaCl 25%(w/v), KH2PO4 0.1% (w/v), FeSO4·7H2O 0.05%(w/v), KCl 0.05%(w/v), NH4C1 0.1%(w/v), agar 2%(w/v), PH 7.0으로 구성하였고, 상층은 sodium alginate l%(w/v), agar 2%(w/v), PH 7.0으로 구성하였다[5,6]. 다층 평판 배지에 균질화시킨 미역 샘플 0.
- 부산 해운대 앞 바다에서 채취한 다양한 종류의 미역 시료로부터 알긴산 분해 균주를 선별하였다. 균주 분리용 다층 평판배지의 하층은 NaCl 25%(w/v), KH2PO4 0.
- 알긴산 분해 활성을 가지는 해양 미생물을 분리하기 위하여 부산 해운대 앞 바다에서 다양한 종류의 미역류를 채취하여 미생물 분리원으로 사용하였다. NaCl 2.
- 8%(w/v) sodium alginate를 기질로 사용하여 37℃에서 1 hr 반응시킨 다음 반응 전후의 환원당량을 Somogy-Nelson법 또는 DNS법에 의해 550nm에서 흡광도를 측정하여 표준 검량선 (표준당은 maltose)으로부터 환원당량을 결정하여 활성을 분석하였다. 알긴산 효소활성을 측정하기 위한 기질로는 점성이 다른 sodium alginate를 사용하였다. 효소 1 unit는 1분간에 lμmol의 환원당을 생산하는 효소량으로 하였다.
이론/모형
- 5×1 m)을 이용하여 정제하였다. 각 분리단계에서의 각각의 획분액에 포함된 총단백질 농도는 Bradford법을 이용하여 결정하였으며, 기준 물질로는 bovine serum albumin을 사용하였다.
- 알긴산 분해효소 활성은 0.8%(w/v) sodium alginate를 기질로 사용하여 37℃에서 1 hr 반응시킨 다음 반응 전후의 환원당량을 Somogy-Nelson법 또는 DNS법에 의해 550nm에서 흡광도를 측정하여 표준 검량선 (표준당은 maltose)으로부터 환원당량을 결정하여 활성을 분석하였다. 알긴산 효소활성을 측정하기 위한 기질로는 점성이 다른 sodium alginate를 사용하였다.
- 효소 정제 과정중 단백질 획분은 분광광도계로써 280 nm에서 흡광도를 측정하여 검색하였고, 단백질 농도는 Bradford법을 이용하여 bovine serum albumin (sigma. Co. USA)을 표준단백질로 하여 얻은 검량 곡선으로부터 구하였다. 분자량은 SDS-PAGE (12% polyacrylamide gel electrophoresis)에 의하여 측정하였다.
성능/효과
- 1 ml를 spreading 하였다. 3~7일간 배양한 결과 알긴산을 유일탄소원으로 제공된 고체배지상에서 성장하는 콜로니를 다수 얻을 수 있었다. 성장을 보인 콜로니들은 성장을 위해 알긴산을 분해하여 탄소원 및 에너지원으로 활용하였으므로 고체 배지상에 halo가 형성되는 것을 관측할 수 있었다.
- Vibrio sp. AEBL-211 등의 균주에 대하여 pH, 온도, 탄소원 및 질소원이 세포 성장 및 alginase 생성에 미치는 영향을 분석하고 최적화시킨 조건에서 얻은 조효소액이 아님에도 불구하고, 상대적으로 높은 환원당 생성량을 보여주어 alginase 효소생산용 균주로써의 이용 가능성을 보여주었다. 또한, Vibrio sp.
- 12시간의 반응시간동안 분해과정을 측정한 결과, guluronic acid에 대한 mannuronic acid의 비율이 가장 낮은 고점성 알긴산 시료에서 상대적 alginate 분해 효율이 가장 높아 Vibrio sp. AEBL-211 유래의 균체내 alginase는 guluronic acid의 상대적 양이 많은 알긴산에 대한 활성이 우수함을 알 수 있었다.
- 3~7일간 배양한 결과 알긴산을 유일탄소원으로 제공된 고체배지상에서 성장하는 콜로니를 다수 얻을 수 있었다. 성장을 보인 콜로니들은 성장을 위해 알긴산을 분해하여 탄소원 및 에너지원으로 활용하였으므로 고체 배지상에 halo가 형성되는 것을 관측할 수 있었다. Table 1에서와 같이 콜로니가 성장함에 따라 알긴산 한천 배지에서 콜로니 주변에 halo가 형성되고 직경이 커지는 모습이 관측되어 균체외 알긴산 분해효소 생성능이 있음을 알 수 있었다.
- AEBL-211는 고체 agar plate 상에서 시간 경과에 따른 halo 크기도 가장 크게 형성되어 알긴산 분해능이 좋은 것으로 판단하였다 (Table 2). 이들 알긴산 분해균주들은 알긴산 이외에 다른 탄소원을 제공하여 배양한 경우에서는 알긴산 분해능이 저하되는 현상을 보여주어 alginase는 유도효소의 일종으로 판단되었다.
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