본 연구는 알긴산분해효소 활성이 뛰어난 세균을 확보하고 선정된 균주의 효소생산과 활성에 영향을 미치는 알긴산과 NaCl의 농도, 질소원 종류, 온도, pH 등을 파악하고자 하였다. 해조류 섭식 동물인 전복, 소라, 해삼, 멍게, 개불 등에서 유래한 총 5만여 콜로니 중 알긴산 분해효소 활성이 우수한 27개 균주를 분리하였고 최종적으로 전복 유래의 균주를 선정하였다. 16S rDNA 염기서열 분석으로 선정된 균주를 Methylobacterium sp. HJM27으로 명명하였고 알긴산 분해효소의 활성은 1.0% sodium alginate, 0.5% peptone, 0.3% yeast extract, 1.5% NaCl, $25^{\circ}C$, 48시간 배양에서 가장 높았다. 알긴산 분해효소의 활성은 $25^{\circ}C$, pH 9에서 최대로 0.8%(w/v) sodium alginate 용액에서 30분만에 1.217 g/L의 환원당을 생성하였다. 분리된 균주와 이 균주의 알긴산 분해효소를 이용하여 해조류를 바이오에너지와 식 의약 소재로 활용 할 수 있을 것으로 판단된다.
본 연구는 알긴산 분해효소 활성이 뛰어난 세균을 확보하고 선정된 균주의 효소생산과 활성에 영향을 미치는 알긴산과 NaCl의 농도, 질소원 종류, 온도, pH 등을 파악하고자 하였다. 해조류 섭식 동물인 전복, 소라, 해삼, 멍게, 개불 등에서 유래한 총 5만여 콜로니 중 알긴산 분해효소 활성이 우수한 27개 균주를 분리하였고 최종적으로 전복 유래의 균주를 선정하였다. 16S rDNA 염기서열 분석으로 선정된 균주를 Methylobacterium sp. HJM27으로 명명하였고 알긴산 분해효소의 활성은 1.0% sodium alginate, 0.5% peptone, 0.3% yeast extract, 1.5% NaCl, $25^{\circ}C$, 48시간 배양에서 가장 높았다. 알긴산 분해효소의 활성은 $25^{\circ}C$, pH 9에서 최대로 0.8%(w/v) sodium alginate 용액에서 30분만에 1.217 g/L의 환원당을 생성하였다. 분리된 균주와 이 균주의 알긴산 분해효소를 이용하여 해조류를 바이오에너지와 식 의약 소재로 활용 할 수 있을 것으로 판단된다.
This study was aimed to screen bacteria of high alginate-degrading activity, to select the nitrogen source and concentration of NaCl and sodium alginate for the production of alginate-degrading enzyme, and to determine reaction conditions of enzyme. A novel alginate-degrading bacterium was isolated ...
This study was aimed to screen bacteria of high alginate-degrading activity, to select the nitrogen source and concentration of NaCl and sodium alginate for the production of alginate-degrading enzyme, and to determine reaction conditions of enzyme. A novel alginate-degrading bacterium was isolated from abalone (Haliotis discus hannai) and named Methylobacterium sp. HJM27 by 16S rDNA sequence analysis. The optimum culture conditions for the production of alginate-degrading enzyme were 1.0% sodium alginate, 0.5% peptone, 0.3% yeast extract, 1.5% NaCl, $25^{\circ}C$ and 48 hours incubation time. The raw enzyme showed the highest activity at $25^{\circ}C$ and pH 9, and produced 1.217 g - reducing sugar per liter in 0.8% (w/v) sodium alginate for 30 minutes. Methylobacterium sp. HJM27 and its alginate-degrading enzyme would be useful for the production of bioenergy and biofunctional oligosaccharides from seaweed.
This study was aimed to screen bacteria of high alginate-degrading activity, to select the nitrogen source and concentration of NaCl and sodium alginate for the production of alginate-degrading enzyme, and to determine reaction conditions of enzyme. A novel alginate-degrading bacterium was isolated from abalone (Haliotis discus hannai) and named Methylobacterium sp. HJM27 by 16S rDNA sequence analysis. The optimum culture conditions for the production of alginate-degrading enzyme were 1.0% sodium alginate, 0.5% peptone, 0.3% yeast extract, 1.5% NaCl, $25^{\circ}C$ and 48 hours incubation time. The raw enzyme showed the highest activity at $25^{\circ}C$ and pH 9, and produced 1.217 g - reducing sugar per liter in 0.8% (w/v) sodium alginate for 30 minutes. Methylobacterium sp. HJM27 and its alginate-degrading enzyme would be useful for the production of bioenergy and biofunctional oligosaccharides from seaweed.
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문제 정의
Fig. 3과 같이 세포성장에는 yeast extract가 가장 우수하였고 알긴산 분해효소 활성에는 peptone이 우수하여 peptone이 함유된 배지에 yeast extract를 첨가하여 이들이 효소활성 등에 어떠한 영향을 미치는가에 관하여 조사하였다. Fig.
따라서 본 연구에서는 해조류를 이용한 바이오에너지 개발과 식의약소재로 활용가능한 알긴산 올리고당을 효소적으로 제조하기 위한 기초 연구로서 알긴산 분해능이 우수한 새로운 미생물 균주를 해조류 섭식동물에서 선별하고, 선별된 균주의 성장과 알긴산 분해 특성을 알아보고자 하였다.
본 연구는 알긴산 분해효소 활성이 뛰어난 세균을 확보하고 선정된 균주의 효소생산과 활성에 영향을 미치는 알긴산과 NaCl의 농도, 질소원 종류, 온도, pH 등을 파악하고자 하였다. 해조류 섭식 동물인 전복, 소라, 해삼, 멍게, 개불 등에서 유래한 총 5만여 콜로니 중 알긴산 분해효소 활성이 우수한 27개 균주를 분리하였고 최종적으로 전복 유래의 균주를 선정하였다.
가설 설정
이는 균주가 성장하면서 floc을 형성하는 것에 의한 영향으로 판단되었다. 또한 환원당 생성능은 세포를 제거한 조효소액을 사용하여 세포들이 floc을 형성하여도 결과에 크게 영향을 미치지 않았겠지만 세포성장 측정에는 영향을 미쳤을 것이다. 따라서 NaCl이 1.
제안 방법
원심 분리된 상층액 500 µL 에 DNS용액 2 mL을 가한 후 10분간 가열하였고 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Mannuronic acid를 이용하여 작성한 표준 검량선을 이용하여 생성된 환원당을 정량하였으며 환원당 생성능을 알긴산 분해효소 활성과 비례하는 것으로 간주하였다. 효소 1 unit는 1분에 1 µmole의 환원당을 생산하는 효소량으로 정의하였고, 각 실험조건에서 최대 활성을 보인 것을 100%로 간주하고 다른 것들을 백분율로 비교하는 상대 활성으로 나타내었다.
Plate assay는 PS 한천배지(peptone 0.5%(w/v), sodium alginate 0.8%(w/v), agar 1.5%(w/v))에 배양한 균주 30 µL를 점적하고 25℃에서 2일간 정치 배양한 후 균주가 성장한 배지에 10% cetylpyridinium chloride monohydrate(CPC)를 배지가 잠길 정도로 투여하였고, 10분 후 알긴산 분해효소의 활성을 확인하였다[4].
분해능이 우수한 균주는 16S rDNA의 염기서열을 결정하기 위해 (주)마크로젠에 의뢰하여 16S rDNA의 염기서열을 구하였고 NCBI의 blast search를 통하여 동정하였다.
순수 분리된 각 균주를 PYS 배지(peptone 0.5%(w/v), yeast extract 0.3%(w/v), sodium alginate 1.0%(w/v), NaCl 1.5%(w/v), pH 7)에 접종하고 25℃에서 150 rpm 조건으로 24시간 진탕 배양한 후에, 알긴산 분해능의 1차적 확인은 plate assay로 하였다. Plate assay는 PS 한천배지(peptone 0.
알긴산 농도, 질소원 종류, yeast extract 첨가 유무, NaCl 농도의 영향(0~3%), 배양 온도(20~40℃), 배양 시간 등에 따른 알긴산 분해효소의 활성을 조사하기 위하여 PYS 배지를 기본으로 하여 물질을 첨가하거나 온도 등을 달리하여 균주를 배양하면서 DNS법으로 효소활성을 측정하였다.
알긴산 분해 세균의 분리를 위하여 다층평판배지를 이용하였다. 다층평판배지의 하층배지는 NaCl 2.
알긴산 분해효소 활성이 확인된 분리 균주를 PYS 배지에 접종하여 진탕배양하면서(25℃, 150 rpm) 배양액의 원심분리(14,000×g, 4℃, 5 min) 상층액으로 제조한 조효소액이 나타내는 환원당 생성능을 시간별로 측정하여 분석하였다.
알긴산 분해 세균의 분리를 위한 시료는 2009년 5월에 부산광역시 기장군 기장읍 대변항과 경상남도 통영에서 구입한 해양 동물인 전복(Haliotis discus hannai), 소라(Batillus cornutus), 해삼(Stichopus japonicus), 멍게(Halocynthia roretzi), 개불(Urechis unicinctus)이였다. 이들 해양 동물의 내장을 잘게 잘라서 멸균된 희석액(NaCl 2.5 g, KH2PO4 0.1 g, FeSO4ㆍ7H2O 0.05 g, KCl 0.05 g, NH4Cl 0.1 g, 증류수 1 l, pH 7)을 이용하여 연속 희석하였다.
0% 까지만 균주의 성장과 효소활성이 증가한 Yonemoto 등[26]의 보고와 차이를 보이는 것이었다. 이후 연구에서는 알긴산 농도를 1.0%로 하였다.
분리된 균주의 알긴산 분해능을 plate assay로 1차 확인하고 DNS법으로 2차 측정한 결과, 27종의 콜로니가 알긴산을 분해하는 활성이 높은 것으로 판단되었다. 전복에서 분리한 균주가 알긴산 분해 효소 생산균 중 가장 활성이 높은 균주로 파악되어 이후 그 균주로 연구를 진행하였다.
효소 1 unit는 1분에 1 µmole의 환원당을 생산하는 효소량으로 정의하였고, 각 실험조건에서 최대 활성을 보인 것을 100%로 간주하고 다른 것들을 백분율로 비교하는 상대 활성으로 나타내었다.
대상 데이터
일반적으로 16S rDNA의 유사성이 97% 이상이면 동일한 종(species)으로 분류하므로[1] 분리한 균주를 최종적으로 Methylobacterium sp. HJM27로 명명하였다.
알긴산 분해 세균의 분리를 위한 시료는 2009년 5월에 부산광역시 기장군 기장읍 대변항과 경상남도 통영에서 구입한 해양 동물인 전복(Haliotis discus hannai), 소라(Batillus cornutus), 해삼(Stichopus japonicus), 멍게(Halocynthia roretzi), 개불(Urechis unicinctus)이였다. 이들 해양 동물의 내장을 잘게 잘라서 멸균된 희석액(NaCl 2.
본 연구는 알긴산 분해효소 활성이 뛰어난 세균을 확보하고 선정된 균주의 효소생산과 활성에 영향을 미치는 알긴산과 NaCl의 농도, 질소원 종류, 온도, pH 등을 파악하고자 하였다. 해조류 섭식 동물인 전복, 소라, 해삼, 멍게, 개불 등에서 유래한 총 5만여 콜로니 중 알긴산 분해효소 활성이 우수한 27개 균주를 분리하였고 최종적으로 전복 유래의 균주를 선정하였다. 16S rDNA 염기서열 분석으로 선정된 균주를 Methylobacterium sp.
HJM27 균주는 peptone과 sodium alginate만 첨가된 PS 배지보다 peptone과 sodium alginate 그리고 yeast extract가 첨가된 PSY 배지에서 세포성장 및 알긴산 분해활성이 2배 이상 큰 것으로 나타났다. 0일째 알긴산 분해 활성이 비교적 높은 이유는 1차 배양액을 2차 배양에 이용한 계대배양의 결과로 판단된다. B.
전반적으로 Methylobacterium sp. HJM27 균주는 peptone과 sodium alginate만 첨가된 PS 배지보다 peptone과 sodium alginate 그리고 yeast extract가 첨가된 PSY 배지에서 세포성장 및 알긴산 분해활성이 2배 이상 큰 것으로 나타났다. 0일째 알긴산 분해 활성이 비교적 높은 이유는 1차 배양액을 2차 배양에 이용한 계대배양의 결과로 판단된다.
HJM27 균주의 16S rDNA 염기서열을 neighbor-joining method로 나타낸 계통수(phylogenetic tree)이다. Methylobacterium 속 세균들과 아주 높은 연관관계를 보이는 것을 알 수 있어 분리한 HJM27 균주가 Methylobacterium 속 세균임을 확인할 수 있었다. 일반적으로 16S rDNA의 유사성이 97% 이상이면 동일한 종(species)으로 분류하므로[1] 분리한 균주를 최종적으로 Methylobacterium sp.
갈조류를 섭식하는 5종의 해양동물 내장시료를 이용하였을 때 약 5만 개의 콜로니가 분리배지 위에서 성장하는 것이 확인되었다. 소라에서 가장 많은 수의 콜로니 성장이 확인되었고 크기가 1 mm 이상인 콜로니를 알긴산 분해능이 우수한 균주로 간주하고 분리하였다.
또한 환원당 생성능은 세포를 제거한 조효소액을 사용하여 세포들이 floc을 형성하여도 결과에 크게 영향을 미치지 않았겠지만 세포성장 측정에는 영향을 미쳤을 것이다. 따라서 NaCl이 1.5%일 때 단위 배양액당 가장 높은 알긴산 분해효소 활성을 보이는 것을 알 수 있었다. 이는 B.
899 g/L로 상업성이 있다고 보고하였다. 본 연구에서 분리한 HJM27 균주는 환원당 생성능이 1.217 g/L로 Joo 등[8]의 보고에 비해 343%, Uo 등[21]의 보고에 비해 35% 이상 높은 활성을 보여 상업적 활용 가능성이 높은 것으로 판단되었다. 전분, 카라기난, 펙틴, 한천 등의 다당류에 대한 분해활성을 측정하였으나 알긴산에 대해서만 분해활성을 보여 (data not shown) 분리한 균주는 알긴산 분해효소를 생산하는 것으로 판단되었다[21].
8에 나타내었다. 분리균주는 NaCl의 농도가 0%에서 3.0%까지 성장과 알긴산 분해 활성이 확인되었고 NaCl 2.5%에 비해 3.0%일 때 성장이 급격히 저하되었으므로 호염성이 아닌 내염성(halotolerant) 균주로 판단되었다.
소라에서 가장 많은 수의 콜로니 성장이 확인되었고 크기가 1 mm 이상인 콜로니를 알긴산 분해능이 우수한 균주로 간주하고 분리하였다. 분리된 균주의 알긴산 분해능을 plate assay로 1차 확인하고 DNS법으로 2차 측정한 결과, 27종의 콜로니가 알긴산을 분해하는 활성이 높은 것으로 판단되었다. 전복에서 분리한 균주가 알긴산 분해 효소 생산균 중 가장 활성이 높은 균주로 파악되어 이후 그 균주로 연구를 진행하였다.
HJM27 균주가 서로 다른 질소원에서 나타내는 알긴산 분해효소의 활성(bar)과 세포성장(-■-)을 나타내는 그림이다. 세포성장은 yeast extract(0.3%, w/v)에서 가장 좋았으며 효소활성은 peptone(0.5%, w/v)이 오차범위에서 가장 우수한 것으로 나타났다. 효소활성을 세포성장으로 나눈 백분율은 NH4Cl(39.
갈조류를 섭식하는 5종의 해양동물 내장시료를 이용하였을 때 약 5만 개의 콜로니가 분리배지 위에서 성장하는 것이 확인되었다. 소라에서 가장 많은 수의 콜로니 성장이 확인되었고 크기가 1 mm 이상인 콜로니를 알긴산 분해능이 우수한 균주로 간주하고 분리하였다. 분리된 균주의 알긴산 분해능을 plate assay로 1차 확인하고 DNS법으로 2차 측정한 결과, 27종의 콜로니가 알긴산을 분해하는 활성이 높은 것으로 판단되었다.
알긴산이 전혀 없는 경우에도 활성을 보여 알긴산 분해효소는 알긴산 유무에 상관없이 항시적으로 발현되는 것으로 판단되었다. 알긴산의 농도가 1.0%일 때 알긴산 분해능이 가장 높았지만, 효소활성을 세포성장으로 나눈 값은 0.7%와 1.0%가 오차범위내에서 1.0%가 우수한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 B.
이는 알긴산 농도가 높아짐에 따라 배지의 점도가 높아지고 일정 수준에 이르러서는 분비되는 효소의 양을 오히려 저해하는 요소로 작용할 수 있다는 것을 의미하였다[21]. 알긴산이 전혀 없는 경우에도 활성을 보여 알긴산 분해효소는 알긴산 유무에 상관없이 항시적으로 발현되는 것으로 판단되었다. 알긴산의 농도가 1.
5%, w/v)이 오차범위에서 가장 우수한 것으로 나타났다. 효소활성을 세포성장으로 나눈 백분율은 NH4Cl(39.3%), urea(32.9%), (NH4)2SO4(16.8%), peptone(5.7%), yeast extract(2.1%)로 나타났지만 무기물 질소원들은 아주 낮은 효소 활성값을 보였다. 이러한 결과는 B.
후속연구
MET 0515의 경우 배양 72시간째가 효소 활성이 최대라는 보고[12]와 비교하여 볼 때 Methylobacterium sp. HJM27 균주는 생장과 최대효소활성이 빠른 시간에 이루어지므로 응용 가능성이 높다고 판단할 수 있었다.
향후 Methylobacterium sp. HJM27에서 알긴산 분해 효소의 분리와 함께 yeast extract 농도 등을 이용한 효소생산 최적화가 이루어진다면 해조류를 이용한 바이오에너지 개발 분야[18] 및 식의약 산업에서 유용한 알긴산 분해효소의 생산과 응용에 아주 유용할 것으로 판단되었다.
217 g/L의 환원당을 생성하였다. 분리된 균주와 이 균주의 알긴산 분해효소를 이용하여 해조류를 바이오에너지와 식ㆍ의약 소재로 활용 할 수 있을 것으로 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
알긴산이란 무엇인가?
알긴산(alginic acid)은 D-mannuronic acid와 L-guluronic acid가 α-1,4 결합 또는 β-1,4 결합으로 이루어진 hetero형 다당류로 주로 갈조류의 세포벽을 구성한다[3, 6]. 또한 알긴산은 비만 억제효과, 장의 연동운동 촉진을 통한 변비 치유, 항콜레스테롤 억제 작용, 체내의 중금속 흡수와 제거, 유해물질의 독성을 억제하는 효과[15] 등의 다양한 생리활성으로 기능성 식품소재로 활용이 가능할 뿐만 아니라 상처를 보호하는 창상피복재 및 지혈[14] 등의 생리활성효과를 가지고 있어 의약품 소재로도 응용될 수 있다.
알긴산은 주로 어떤 것을 구성하는 성분인가?
알긴산(alginic acid)은 D-mannuronic acid와 L-guluronic acid가 α-1,4 결합 또는 β-1,4 결합으로 이루어진 hetero형 다당류로 주로 갈조류의 세포벽을 구성한다[3, 6]. 또한 알긴산은 비만 억제효과, 장의 연동운동 촉진을 통한 변비 치유, 항콜레스테롤 억제 작용, 체내의 중금속 흡수와 제거, 유해물질의 독성을 억제하는 효과[15] 등의 다양한 생리활성으로 기능성 식품소재로 활용이 가능할 뿐만 아니라 상처를 보호하는 창상피복재 및 지혈[14] 등의 생리활성효과를 가지고 있어 의약품 소재로도 응용될 수 있다.
알긴산 분해효소 활성이 뛰어난 세균을 확보하고 그 특성을 알아보고자 한 실험에서 선정된 전복 유래의 균주의 알긴산 분해 특성은 무엇인가?
해조류 섭식 동물인 전복, 소라, 해삼, 멍게, 개불 등에서 유래한 총 5만여 콜로니 중 알긴산 분해효소 활성이 우수한 27개 균주를 분리하였고 최종적으로 전복 유래의 균주를 선정하였다. 16S rDNA 염기서열 분석으로 선정된 균주를 Methylobacterium sp. HJM27으로 명명하였고 알긴산 분해효소의 활성은 1.0% sodium alginate, 0.5% peptone, 0.3% yeast extract, 1.5% NaCl, 25℃, 48시간 배양에서 가장 높았다. 알긴산 분해효소의 활성은 25℃, pH 9에서 최대로 0.8%(w/v) sodium alginate 용액에서 30분만에 1.217 g/L의 환원당을 생성하였다. 분리된 균주와 이 균주의 알긴산 분해효소를 이용하여 해조류를 바이오에너지와 식·의약 소재로 활용 할 수 있을 것으로 판단된다.
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