해양생물 및 토양으로부터 총 619주의 알긴산분해능을 나타내는 균주를 분리하여 이중 분해능이 강력했던 균주의 배양 조건 및 효소 생산 조건을 실험한 결과, 탄소원으로는 Na-alginate $2\%$, 질소원으로 nutrition broth $0.1\%$, NaCl 농도 $2\%$, pH 7.5, 배양 온도는 $30^{\circ}C$, 배양 시간은 $144\~150$ 시간이 최적 배양 및 효소 생산 조건이었다. 아울러 균체의 생리, 생화학적 특성을 분석한 결과, 본 실험 균주가 Bacillus licheniformis로 동정 되어 최종 Bacillus licheniformis AL-577로 명명하였다.
해양생물 및 토양으로부터 총 619주의 알긴산 분해능을 나타내는 균주를 분리하여 이중 분해능이 강력했던 균주의 배양 조건 및 효소 생산 조건을 실험한 결과, 탄소원으로는 Na-alginate $2\%$, 질소원으로 nutrition broth $0.1\%$, NaCl 농도 $2\%$, pH 7.5, 배양 온도는 $30^{\circ}C$, 배양 시간은 $144\~150$ 시간이 최적 배양 및 효소 생산 조건이었다. 아울러 균체의 생리, 생화학적 특성을 분석한 결과, 본 실험 균주가 Bacillus licheniformis로 동정 되어 최종 Bacillus licheniformis AL-577로 명명하였다.
For the purpose of oligosaccharide production from alginate, the main component in cell walls of brown algae, the alginate degrading bacteria have been screened from the seaweeds and soil. Among the isolated 69 strains, one strain showing the highest degrading activity was selected and identified as...
For the purpose of oligosaccharide production from alginate, the main component in cell walls of brown algae, the alginate degrading bacteria have been screened from the seaweeds and soil. Among the isolated 69 strains, one strain showing the highest degrading activity was selected and identified as Bacillus licheniformis strain. The adequate sodium alginate concentration for growing the Bacillus licheniformis was $2.0\%$. The effective nitrogen source is nutrient broth $(0.1\%)$, and optimum initial pH, NaCl concentration, temperature and incubation time to produce the alginate degrading enzyme were 7.5, $2\%,\;30{\pm}2^{\circ}C$, and 144 hrs, respectively.
For the purpose of oligosaccharide production from alginate, the main component in cell walls of brown algae, the alginate degrading bacteria have been screened from the seaweeds and soil. Among the isolated 69 strains, one strain showing the highest degrading activity was selected and identified as Bacillus licheniformis strain. The adequate sodium alginate concentration for growing the Bacillus licheniformis was $2.0\%$. The effective nitrogen source is nutrient broth $(0.1\%)$, and optimum initial pH, NaCl concentration, temperature and incubation time to produce the alginate degrading enzyme were 7.5, $2\%,\;30{\pm}2^{\circ}C$, and 144 hrs, respectively.
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문제 정의
본 연구는 효소를 이용하여 알긴산을 분해하여 유용한 올리고당을 제조할 목적으로 알긴산을 특이적으로 그리고 효율적으로 분해하는 효소를 미생물로부터 획득하기 위해 자연계로부터 본 효소의 생산 능이 우수한 세균검색을 행하여, 그중 알긴산 분해능이 높은 효소 생산 미생물을 동정함과 동시에 그 생육 특성을 구명하였다.
제안 방법
001%, MgSO4 . 7H2O 0.05%, KC1 0.05%, bacto-agar 2.0%, pH 7.5이었고, 상층 배지로 sodium alginate 0.1%, bacto- agar 2.0%, pH 7.5로 하였다 (8, 9). 분리한 균주의 알긴산 분해능 측정은 상기 하층 배지에서 bacto agar를 제외한 배지를 이용하였고, 배양 조건을 위한 기본 배지는 peptone 0.
Peptone 배지를 기본 배지로 하고 탄 소원 및 질소원의 종류, 탄 소원 및 질소원의 농도, NaCl 농도, 배양 온도, 초기 pH 및 배양 시간을 달리하면서 7일 배양한 후 원심분리(12, 000x^, 30 min)하여 상층 액을 조 효소액으로 하였다. 반응 기질은 0.
Peptone 배지를 기본 배지로 하고 탄 소원 및 질소원의 종류, 탄 소원 및 질소원의 농도, NaCl 농도, 배양 온도, 초기 pH 및 배양 시간을 달리하면서 7일 배양한 후 원심분리(12, 000x^, 30 min)하여 상층 액을 조 효소액으로 하였다. 반응 기질은 0.3 M NaCl, 50 mM Tris-HCl buffer(pH7.0) 용액에 sodium alginate(Sigma Co., USA)를 0.4 또는 0.8% 농도로 제조하였다. 반응은 기질 1 mL와 조효소 1 mL을 항온수조(30°C)에서 60분간 반응시킨 다음 그중 1 mL를 취하여 Somogyi-Nelson(24, 25) 법으로 정량하였다.
분리된 세균은 분해 활성 측정 배지에 접종하여 7일간 정치 배양(25°C±2)하였으며 배양 상층액의 환원당을 측정하여 알긴산 분해능으로 측정하였다. 환원당은 Somogyi~Ne]son (24, 25) 법에 따라 시료 용액 1 mLX CuSO(동) 시 약 1 mL를 test tube에 각각 취하고, water bath에서 20분간 가열하여 산화 제1동(CU2。)을 생성하였다.
5로 하였다 (8, 9). 분리한 균주의 알긴산 분해능 측정은 상기 하층 배지에서 bacto agar를 제외한 배지를 이용하였고, 배양 조건을 위한 기본 배지는 peptone 0.1% bacto peptone, 0.5% sodium alginate, 1.0% NaCl, pH 7.5인 것을 이용하였다.
알긴산분해 활성을 갖는 세균의 분리는 분리 배지 중 하층 배지를 멸균한 후 petri dish에서 완전히 굳힌 후, 상층 배지를 멸균하여 다시 얇게 부어 굳힌 후 균질화시킨 샘플을 단계별 희석시킨 후 시료를 1 mL 취하고, conradi stick으로도 말하여 25±2°C에서 5〜7일간 배양하여 형성된 독립 colony를 분리하고 다시 고체 배지 상에서 streaking 하여 분리된 독립 colony를 분해능 측정시험 균주로 하였다.
분리된 균의 알긴산 분해능을 환원당 생성 능으로부터 측정한 결과, 약 69종의 균주가 알긴산을 분해하는 활성이 있는 것으로 판단되었다. 환원당 생성 능이 0.899 mg/mL로 가장 높았던 균주를 알긴산 분해효소 생산 균으로 최종 결정하였다. 이는 Joo 등(21)이 고활성 균이라 분리하였던 균주 0.
대상 데이터
알긴산 분해균의 검색을 위한 시료는 2004년 3월부터 2004년 9월 사이에 강원도 동해시부터 고성군 사이의 동해안 바닷가에서 채취한 다양한 종류의 해조, 해수, 해양토양들로서 이들로부터 알긴산분해가능 균주를 선별하였다.
이론/모형
8% 농도로 제조하였다. 반응은 기질 1 mL와 조효소 1 mL을 항온수조(30°C)에서 60분간 반응시킨 다음 그중 1 mL를 취하여 Somogyi-Nelson(24, 25) 법으로 정량하였다. 효소 1 unit는 1분에 1 Pmole의 환원당을 생산하는 효소량으로 정의하였고, 상대 활성으로 나타내었다.
분리된 균주의 동정은 각종 생리, 생화학적 특성을 실험하고, 추가로 ID 32 GN Automatic Identification 시스템(Biomerieux, St. Louis, MO)을 이용하여 당의 이용성 등을 조사하였고, Bergey' s Mannual Systematic Bacteriolo- gy(26), Gibbs와 Skinner(27)의 분류 방법에 따라 동정을 행하였다.
분리된 세균은 분해 활성 측정 배지에 접종하여 7일간 정치 배양(25°C±2)하였으며 배양 상층액의 환원당을 측정하여 알긴산 분해능으로 측정하였다. 환원당은 Somogyi~Ne]son (24, 25) 법에 따라 시료 용액 1 mLX CuSO(동) 시 약 1 mL를 test tube에 각각 취하고, water bath에서 20분간 가열하여 산화 제1동(CU2。)을 생성하였다. 여기에 몰리브덴 용액 1 mL 을 가하여 발색시킨 다음 520 nm에서 흡광도를 측정하여, 표준 당(mannuronic acid)을 사용, 작성한 표준 검량 선으로부터 환원당을 정량하였다.
성능/효과
그람 양성 간균으로 catalase# 생성하며 oxdiase는 생성하지 않았다. MaConky agar에서 성장하는 특성과 각종 당류의 이용성 등을 고려해 볼 때, Bacillus licheniformins로 분류할 수 있었고, DNA 염기 조성을 분석한 결과 99% 이상 Bacillus licheniformis의 유전자와 일치함을 확인할 수 있었다. 이 균주를 AL-577이 라고 명명하였다.
무기 질소원을 사용한 배지에서는 균체의 성장 및 효소 활성이 거의 나타나지 않았고, 유기 질소원의 경우 조금씩 차이를 보였으나 대부분 분해 활성이 있는 것으로 나타났다. 각 유기 질소원에 따라 농도를 달리하면서 배양한 결과(Table 5), peptone, yeast extract 및 nutrient broth가 질소원으로 이용될 수 있었지만 낮은 농도임에도 불구하고 성장과 분해능이 뛰어났던 nutrient broth가 가장 적절한 질소원으로 여겨졌다. 아울러 0.
질소원의 종류와 농도 : 질소원을 달리하면서 배양한 후 얻어진 조효소액의 환원당 생성 능을 측정한 결과는 Table 4와 같다. 무기 질소원을 사용한 배지에서는 균체의 성장 및 효소 활성이 거의 나타나지 않았고, 유기 질소원의 경우 조금씩 차이를 보였으나 대부분 분해 활성이 있는 것으로 나타났다. 각 유기 질소원에 따라 농도를 달리하면서 배양한 결과(Table 5), peptone, yeast extract 및 nutrient broth가 질소원으로 이용될 수 있었지만 낮은 농도임에도 불구하고 성장과 분해능이 뛰어났던 nutrient broth가 가장 적절한 질소원으로 여겨졌다.
배양 시간 : 앞에서 결정한 적정 배양조건에서 배양 시간을 달리하면서 균체의 성장과 분해 활성을 실험한 결과(Fig.2), 배양 144〜 150시간에서 균체 성장 및 조효소액의 알긴산분해 활성이 최대에 달하였고, 그 이후에는 천천히 감소하였는데 이는 배지의 영양성분의 고갈 및 세포 성장에 따른 대사 산물의 축척으로 사료된다.
pH: 균체 성장과 분해 활성에 미치는 초기 배지 pH의 영향은 Table 6과 같다. 본 균주는 미알칼리성 영역인 pH 7.5에서 분해 활성이 최대였고, pH 5.0 이하의 조건에서는 균체의 성장과 분해 활성이 거의 나타나지 않았다. 마찬가지로 pH 9.
NaCl이 첨가되지 않은 경우 균은 거의 생육하지 않음을 알 수 있었는데, 이는 해양에서 생육하는 미생물의 경우 성장 및 효소 생산에 적정 농도와 1가 또는 2가 이온이 필요하다고 하였는데, 이는 미생물의 삼투조절과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다(29). 본 실험에서도 NaCl 농도 2.0%까지는 균의 성장과 효소 활성이 증대하였으나 그 이상의 농도에서는 효소 활성이 급격히 저하하는 것을 확인하였고, 그 결과 본 균주의 경우 NaCl 2.0% 농도가 성장 및 효소 생산에 유리함을 알 수 있었다.
분리된 균의 알긴산 분해능을 환원당 생성 능으로부터 측정한 결과, 약 69종의 균주가 알긴산을 분해하는 활성이 있는 것으로 판단되었다. 환원당 생성 능이 0.
각 유기 질소원에 따라 농도를 달리하면서 배양한 결과(Table 5), peptone, yeast extract 및 nutrient broth가 질소원으로 이용될 수 있었지만 낮은 농도임에도 불구하고 성장과 분해능이 뛰어났던 nutrient broth가 가장 적절한 질소원으로 여겨졌다. 아울러 0.1% 농도 수준으로 첨가할 경우에 가장 높은 활성을 보였으며, 그 이상 질소원의 농도를 높일 경우 균체의 성장은 0.5% 농도까지는 증가하였으나, 분해 활성은 0.1% 이상의 농도에서는 오히려 낮아지는 경향이었다.
5, 배양온도는 30°C, 배양 시간은 144-150시간이 최적 배양 및 효소 생산 조건이었다. 아울러 균체의 생리, 생화학적 특성을 분석한 결과, 본 실험 균주가 Bacillus Hcheniformis로 동정되어 최종 Bacillus licheniformis AL- 577로 명명하였다.
0 이상의 알카리성 영역에서도 분해 활성이 나타나지 않았다. 아울러 본 균주의 pH에 대한 민감도가 매우 큰 것으로 여겨졌는데, pH 7.5를 중심으로 pH 7.0과 8.0의 조건에서 알긴산분해 활성이 크게 낮아지는 특성을 확인할 수 있었다. 따라서 본 균주의 적절한 배양 배지 pH는 7.
탄소 원의 종류와 농도 : 알긴산 및 다른 종류의 탄소 원이 균체의 성장이나 알긴산 분해 효소 생산에 미치는 영향을 실험한 결과는 Table 2와 같다. 알긴산 대신에 동일 농도로 첨가된 탄소 원들은 분리 균의 성장과 분해 효소 생산에 효과적이지 못한 것으로 확인되었고, 특히 알긴산 이외의 다당류는 분해효소 생산을 위한 탄소원으로는 적당하지 못하다는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 알긴산 분해 효소 생산에 알긴산이 반드시 탄소 원으로 첨가되어야 한다는 것을 의미하는 것이다.
이러한 결과는 알긴산 분해 효소 생산에 알긴산이 반드시 탄소 원으로 첨가되어야 한다는 것을 의미하는 것이다. 한편, 알긴산 농도를 달리하면서 동일 실험을 행한 결과(Table 3), 알긴산 농도가 2%까지는 분해 활성이 증가하다가 그 이상의 농도에서는 분해 활성이 큰 차이를 나타내지 않았다. 이는 알긴산 농도가 높아짐에 따라 배지의 점도가 높아지고 일정 수준에 이르러서는 균의 성장을 오히려 저해하는 요소로 작용할 수 있다는 것을 의미한다.
해양생물 및 토양으로부터 총 619주의 알긴산 분해능을 나타내는 균주를 분리하여 이중분해능이 강력했던 균주의 배양조건 및 효소 생산 조건을 실험한 결과, 탄소원으로는 Na-alginate 2%, 질소원으로 nutrition broth 0.1%, NaCl 농도 2%, pH 7.5, 배양온도는 30°C, 배양 시간은 144-150시간이 최적 배양 및 효소 생산 조건이었다. 아울러 균체의 생리, 생화학적 특성을 분석한 결과, 본 실험 균주가 Bacillus Hcheniformis로 동정되어 최종 Bacillus licheniformis AL- 577로 명명하였다.
해조류, 해수 및 해양토양 등 37종의 분리 원으로부터 629 균주가 분리되었고(Table 1), 이 중에서 일부 균들은 알긴산 포함 평판 배지에서 투명 환을 보였고, 몇몇은 고체 배지를 분해하여 액화시키는 한천 분해 특징도 나타내었다. 한편 육상토양에서는 알긴산분해 활성 균주가 분리되지 않았고, 주로 해양에서 생육하는 해조류에서 많은 알긴산 분해능을 가진 균주들이 분리되었다.
참고문헌 (29)
Fisher FG, Dorfel H. 1955. The polyuronic acids of brown algae. Part I. Z Physiol Chem 302: 186-203
Hirst EL, Percival E, Wold JK. 1964. The structure of alginic acid. Part IV. Partial hydrolysis of the reduced poly-saccharide. J Chem Soc 8: 1493-1499
Hirst EL, Ress DA. 1965. The structure of alginic acid. Part V. Isolation and unambiguous characterization of some hy-drolysis products of the methylated polysaccharide. J Chem Soc 7: 1182-1187
Haug A, Larsen B, Smidsrod O. 1966. A study of con-stitution of alginic acid by partial acid hydrolysis Acta Chemica Scand 20: 183-190
Haug A, Larsen B, Smidsrod O. 1967. Studies on the se-quence of uronic acid residues in alginic acid. Acta Chemica Scand 21: 691-704
Penman A, Sanderson GR. 1972. A method for the deter-mination of uronic acid sequence in alginates. Carbohydrate Research 25: 273-282
Guven KC, Ozsoy Y, Ulutin ON. 1991. Anticoagulant, fibrinotic and antiaggregant activity of carrageenans and alginic acid. Biotanica Marina 34: 429-435
Joo DS, Lee JS, Park JJ, Cho SY, Kim HK, Lee EH. 1996. Preparation of oligosaccharides from alginic acid enzymeic hydrolysis. Korean J Food Sci Technol 28: 146-151
Joo DS, Lee JS, Park JJ, Cho SY, Ahn CB, Lee EH. 1995. Purification and characterization of the intracellular al-ginase from Vibrio sp. AL-145. Kor J Appl Microbiol Biotechnol 23: 432-438
Waksman SA, Allen MC. 1934. Decomposition of poly-uronides by fungi and bacteria. J Bacteriol 28: 213-220
Eller J, Payne WJ. 1960. Studies on bacterial utilization of uronic acid. IV. Alginolytic and nuronic acid oxidizing isolates. J Bacteriol 80: 193-199
Ando Y, Inoue K. 1961. Decompostion of alginic acid by microorganism-IV. On the Vibro-type bacteria newly iso-lated from the decaying Laminaria. Bull Jap Soc Sic Fish 27: 339-341
Dunne WM, Buckmire FL. 1985. Partial purification and characterization of a polymannuronic acid depolymerase produced by a mucoid strain of Pseudomonas aeroguinosa isolated from a patient with cystic fibrosis. Appl Environ Microbiol 50: 562-567
Kim BJ, Ha SD, Lim DJ, Song C, Kong JY. 1998. Production of agarase from marine bacterium Bacillus cereus ASK202. Korean H Biotechnol Bioeng 13: 524-529
Joo DS, Cho SY, Lee EH. 1993. Isolation of alginate- degrading bacteria and production of alginate degrading activities by the bacteria. Kor J Micorbiol Biotechnol 21: 207-211
Joo DS, Cho SY, Lee EH. 1998. Preparation of agar hy-drolysates by agarase and functionality of the hydrolysates. Korean J Biotechnol Bioeng 13: 378-382
Yang ST, Joo DS, Park JJ, Lee JS, Kim MS, Lee EH. 1996. Isolation and identification of carrageenan degrading bac-teria and optimization of enzyme production. Kor J Appl Microbiol Biotechol 24: 652-656
Nelson NJ. 1944. A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of glucose. J Biol Chem 153: 375-380
Somogyi M. 1952. Notes on sugar determination. J Biol Chem 195: 19-23
Baumann P, Furniss AL, Lee JV. 1984. Genus I. Vibrio. In Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Krieg NR, ed. Williams & Wilkins, Baltimore, MD. Vol 1, p 518-538
Gibbs BM, Skinner FA. 1966. Identification methods for microbiologist. Academic press, New York
Yonemoto Y, Mutata K, Kimura A, Yamaguchi H, Okayama K. 1991. Bacterial alginate lyase; characterization of alginate lyase-producing bacteria and purification of the enzyme. J Ferm Bioeng 72: 152-157
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