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문제 정의
- 본 실험은 방사선 처리에서 유기된 벼 변이계통의 형태적 형질 및 RAPD 분석을 통하여 방사선이용 돌연변이 육종연구를 위한 기초적인 자료를 얻기 위하여 실시하였다. 형태적으로 다양한 변이를 보인 계통을 선발할 수 있었는데, 원 품종보다 이삭길이가 길고도복저항성을 나타낸 변이 계통을 선발할 수 있었다.
- 본 연구는 방사선을 처리하여 새로운 유전자원를 확보하기 위한 목적으로 변이체들의 주요 형질을 조사하였다. 또한, 변이체 중에서 내염성 계통의 선발을 통하여 내염성 육종을 위한 모본을 선발하였다.
제안 방법
- 방사선 처리에 의해 다양한 변이체를 선발하고 이로부터 유용한 유전자를 개발하기 위한 목적으로 농촌진흥청작물시험장으로부터 수원 345호를 분양받아 종자에 방사선(250 Gy)을 처리하였다. M2세대에서 선발한 변이계통들을 계통 당 30개체를 1본씩 정식 하여 M7세대까지 관찰하면서 분리된 계통은 제외하고, 고정된 13 계통(M8세대)들의 종자을 파종하여 한국원자력연구소 포장에 육묘하였으며, 사질 양토에 재식저리 30 cm×15 cm 간격으로 2열로 30주씩 정식 하였고, 비 배 관리는 표준재배법에 따랐다.
- RAPD분석을 위해서는 유묘시기에 본엽을 1 g씩 채취하여 DNA을 추출하였으며 20개의 operon primer를 사용하여 PCR 분석을 실시하였다. PCR 증폭 조건은 0.
- 각각의 polymorphic band와 표현형변이와 직접적으로 연계해서 설명이 불가능하기 때문에 polymorphic band를 기초로 하여 변이체들을 수치화하고, 이를 바탕으로 표현형과의 전체적인 관계를 구명하기 위하여 증폭된 단편 190개 중에서 monomorphic band 119개을 제외한 71개의 polymorphic band를 이용하여 각 계통간 Genetic Smulanty(GS) 분석을 통한 genetic distance(GD) 분석을 실시한 결과 변이계통은 모품종과 구분되어 크게 4 groups으로 분류되었다 (Figure 3). Group A에 속하는 48, 147 및 148계통은 대조구와 비교하여 공통적으로 이삭길이에 대해서 유의성 있는 형태적 돌연변이를 확인하였고, group B 에 속하는 49, 50, 95 및 96은 초장에 있어서, C에 속하는 44, 45, 46 및 47은 천립 중에서 유의성 있는 변화를 확인할 수 있었다.
- 계통들은 140일 동안 포장에서 재배되었으며, 생육 후기에 초장, 수장 및 도복 등의 형태적 특성을 조사하였고, 1000립중은 수분 13%까지 건조한 후 측정하였다. 이러한 형태적 특징은 5반복으로 조사하였으며, 도복은 자연 상태에서 달관 조사(0; 무도복, 1: 이 삭목 경사 30% 미만, 3: 이삭목 경사 31~45%, 5: 이삭목경사 45% 이상으로 이삭이 지면에 닿지 않음, 7:이삭의 일부가 지면에 닿음, 9:완전히 지면에 깔린 상태) 하있다.
- 본 연구는 방사선을 처리하여 새로운 유전자원를 확보하기 위한 목적으로 변이체들의 주요 형질을 조사하였다. 또한, 변이체 중에서 내염성 계통의 선발을 통하여 내염성 육종을 위한 모본을 선발하였다. 변이체를 대상으로 donor 품종과 DNA level에서 나타나는 차이를 보고자 RAPD 마커를 이용하여 다형성을 조사하였다.
- 또한, 변이체 중에서 내염성 계통의 선발을 통하여 내염성 육종을 위한 모본을 선발하였다. 변이체를 대상으로 donor 품종과 DNA level에서 나타나는 차이를 보고자 RAPD 마커를 이용하여 다형성을 조사하였다.
- 수원 345 및 M8세대 13계통의 종자를 24시간 소독한 후에 건실한 종자 30개씩을 선정하여 계통별로 9 pot tray(70×70×70 mm per pot)에 3반복으로 치상한 후 Hyponex 수용액을 10mm 높이로 하여 유묘기(본엽 3~4시기)까지 육성하였다. 이때 l% NaCl수용액에 침지하여 3주 동안 관찰하여, 모품종 인 수원 345와 비교하여 생육이 우수한 계통을 선발하였다.
- 28μM primer, 1 unit Taq polymerase 및 25 ng의 DNA를 첨가하여 반응액을 만들었다. 온도 조건은 94℃ 1분, 37℃ 5분, 72℃ 10분으로 50 cycle로 증폭시켰으며 처음 denaturatioiie 5분, 마지막 extensione 10분간으로 하였다. 증폭된 DNA는 1.
- 세대 13계통의 종자를 24시간 소독한 후에 건실한 종자 30개씩을 선정하여 계통별로 9 pot tray(70×70×70 mm per pot)에 3반복으로 치상한 후 Hyponex 수용액을 10mm 높이로 하여 유묘기(본엽 3~4시기)까지 육성하였다. 이때 l% NaCl수용액에 침지하여 3주 동안 관찰하여, 모품종 인 수원 345와 비교하여 생육이 우수한 계통을 선발하였다.
- 계통들은 140일 동안 포장에서 재배되었으며, 생육 후기에 초장, 수장 및 도복 등의 형태적 특성을 조사하였고, 1000립중은 수분 13%까지 건조한 후 측정하였다. 이러한 형태적 특징은 5반복으로 조사하였으며, 도복은 자연 상태에서 달관 조사(0; 무도복, 1: 이 삭목 경사 30% 미만, 3: 이삭목 경사 31~45%, 5: 이삭목경사 45% 이상으로 이삭이 지면에 닿지 않음, 7:이삭의 일부가 지면에 닿음, 9:완전히 지면에 깔린 상태) 하있다. 대조구와 비교하여 선발된 변이계통의 유의성은 t-test (1%, 5%)를 이용하여 확인하였다.
- 온도 조건은 94℃ 1분, 37℃ 5분, 72℃ 10분으로 50 cycle로 증폭시켰으며 처음 denaturatioiie 5분, 마지막 extensione 10분간으로 하였다. 증폭된 DNA는 1.2% agarose gel로 전기영동 후 EtBr로 염색시킨 후 UV에서 RAPD 밴드 양상을 비교하였다. 증폭된 DNA 단편은 각각 3회 반복하여 안전성을 보여준 주요 band가 나타나면 1을, band가 없을 경우에 0을 입력하였고, cluster 분석은 UPGMA(unweighted pair-group method, arthmetic average method)로 dendrogram을 얻었다(Ludwig and Reynolds 1988).
- 형태적인 분석에 의해 변이체를 선발하였고, 이들에 대한 유전적 변이의 조사는 RAPD를 통하여 실시하였다.Table2에서 요약한 것처럼 20개의 random primer를 이용하여 PCR 분석한 결과 전체 190개의 band를 얻었는데 그중 monomrophic band는 119개였고 polyniorphic band는 71개로 조사되었으며, Figure 2에서는 대조구에는 없지만 변이체에서 만 나타난 band를 확인할 수 있었다.
대상 데이터
- Figure 3. Dendrogram from UPGMA cluster analysis based on Similarity Coefficient Matrix using 190 RAPD markers of 14 entries. Con: Suwon 345.
- 방사선 처리에 의해 다양한 변이체를 선발하고 이로부터 유용한 유전자를 개발하기 위한 목적으로 농촌진흥청작물시험장으로부터 수원 345호를 분양받아 종자에 방사선(250 Gy)을 처리하였다. M2세대에서 선발한 변이계통들을 계통 당 30개체를 1본씩 정식 하여 M7세대까지 관찰하면서 분리된 계통은 제외하고, 고정된 13 계통(M8세대)들의 종자을 파종하여 한국원자력연구소 포장에 육묘하였으며, 사질 양토에 재식저리 30 cm×15 cm 간격으로 2열로 30주씩 정식 하였고, 비 배 관리는 표준재배법에 따랐다.
- 수원 345호 벼 종자에 감마선 250 Gy를 처리한 후 고정도가 높은 돌연변이 계통을 선발하기 위하여 M7세대까지 분리 양상을 조사하여 최종적으로 분리되지 않은 계통을 선발하였다. 변이계통의 형태적 특성은 M8세대에서 조사하였는데, Table 1과 Figure 1(A)에서 보는 바와 같이 초장은 계통 번호 95가 대조구보다 25% 증가하였고, 44는 18% 감소하여 가장 적었다.
데이터처리
- 이러한 형태적 특징은 5반복으로 조사하였으며, 도복은 자연 상태에서 달관 조사(0; 무도복, 1: 이 삭목 경사 30% 미만, 3: 이삭목 경사 31~45%, 5: 이삭목경사 45% 이상으로 이삭이 지면에 닿지 않음, 7:이삭의 일부가 지면에 닿음, 9:완전히 지면에 깔린 상태) 하있다. 대조구와 비교하여 선발된 변이계통의 유의성은 t-test (1%, 5%)를 이용하여 확인하였다.
이론/모형
- 2% agarose gel로 전기영동 후 EtBr로 염색시킨 후 UV에서 RAPD 밴드 양상을 비교하였다. 증폭된 DNA 단편은 각각 3회 반복하여 안전성을 보여준 주요 band가 나타나면 1을, band가 없을 경우에 0을 입력하였고, cluster 분석은 UPGMA(unweighted pair-group method, arthmetic average method)로 dendrogram을 얻었다(Ludwig and Reynolds 1988).
성능/효과
- 인위적으로 선택한 10-mer primer의 염기 서열이 미세한 차이를 보여줌에도 불구하고 Table 2 및 Figure 2에서 볼 수 있듯이 18개의 primer에서 1개에서 9개의 polymorphic band를 얻을 수 있음은 10-mer primer로 변이의 분류가 가능하다는 것을 의미한다고 하겠다. 18개의 primer 중에서 변이체에서만 특이적으로 나타난 밴드를 확인할 수 있었는데, 그 중 polymorphic band가 약 70%인 F-16 과 G-07은 각각 6개 및 4개 밴드가 변이체에서만 특이적으로 나타난 밴드였다. 변이체와 대조구의 RAPD 마커를 비교한 결과 polymorphic band가 많고 변이체에서만 특이적으로 나타난 밴드가 많다는 것은 표현형적으로 돌연변이 유발 가능성이 높다는 것을 의미한다.
- Group A에 속하는 48, 147 및 148계통은 대조구와 비교하여 공통적으로 이삭길이에 대해서 유의성 있는 형태적 돌연변이를 확인하였고, group B 에 속하는 49, 50, 95 및 96은 초장에 있어서, C에 속하는 44, 45, 46 및 47은 천립 중에서 유의성 있는 변화를 확인할 수 있었다. GD상에서 groupD인 계 통 번호 98이 모 품종과 비교하여 가장 큰 원연관계를 보여 다론 유전자원들보다는 높은 유전적 변이를 가진 것으로 추정된다. 그러나 이 계통은 조사한 형태적 형질 중 초장이 약 16%(10cm) 증가한 것이외에는 나머지 형질이 모품종과 비슷하였다.
- Primer 20개를 이용하여 PCR 한 결과, 총 190개의 band가 나타났는데 그 중 71개는 polymorphic band였고, 119개는 monomorphic band로 조사되어 DNA 수준에서 변이를 확인하였다. Genetic similarity 분석을 통한 유전적 거리를 조사한 결과 변이계통은 4 group으로 분류되었는데 A groupe 이삭길이에 있어서 돌연변이를 보였고, B groupe 초장 및 C groupe 천립 중에 있어서 유의성 있는 변이를 보였다. 내염성을 나타내는 돌연변이 계통을 선발할 수 있었는데, 이들 계통은 내염성 육종을 위한 재료로 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 05), 계통번호 96은 모품종에 비해 2배 이상 증가하여 염분에 매우 민감함을 알 수 있었다 (Figure4). MDA 함량이 감소한 46은 dendrogram에서 대조구와 원연관계임을 cluster에서 알 수 있었으며, 147은 상대적으로 대조구와 유전적 유사성이 높음을 알 수 있었다. MDA는 염분 stress에서 식물체의 지질산화를 나타내는 지표로 이용되는데 (Screenivasulu et al.
- 형태적으로 다양한 변이를 보인 계통을 선발할 수 있었는데, 원 품종보다 이삭길이가 길고도복저항성을 나타낸 변이 계통을 선발할 수 있었다. Primer 20개를 이용하여 PCR 한 결과, 총 190개의 band가 나타났는데 그 중 71개는 polymorphic band였고, 119개는 monomorphic band로 조사되어 DNA 수준에서 변이를 확인하였다. Genetic similarity 분석을 통한 유전적 거리를 조사한 결과 변이계통은 4 group으로 분류되었는데 A groupe 이삭길이에 있어서 돌연변이를 보였고, B groupe 초장 및 C groupe 천립 중에 있어서 유의성 있는 변이를 보였다.
- Table2에서 요약한 것처럼 20개의 random primer를 이용하여 PCR 분석한 결과 전체 190개의 band를 얻었는데 그중 monomrophic band는 119개였고 polyniorphic band는 71개로 조사되었으며, Figure 2에서는 대조구에는 없지만 변이체에서 만 나타난 band를 확인할 수 있었다.Primer당 평균 9.5개의 band가 증폭되었으며, 크기는 0.4 kb에서 3 kb 사이의 DNA 단편으로 E-03에서 최저 6개에서 최고 14개(H-12)까지 DNA 단편을 얻었다. Donor cultivar와 변이체 및 변이체 간의 polymorphic band율은 G-10의 10%에서 G-07의 70%까지 나타났으며 E-03과 12 primers에서는 polymorphic band를 관찰할 수 없었다.
- 형태적인 분석에 의해 변이체를 선발하였고, 이들에 대한 유전적 변이의 조사는 RAPD를 통하여 실시하였다.Table2에서 요약한 것처럼 20개의 random primer를 이용하여 PCR 분석한 결과 전체 190개의 band를 얻었는데 그중 monomrophic band는 119개였고 polyniorphic band는 71개로 조사되었으며, Figure 2에서는 대조구에는 없지만 변이체에서 만 나타난 band를 확인할 수 있었다.Primer당 평균 9.
- Zhang 등(1999)은 내염성 야생콩에서 dendrogram을 작성한 결과 내염성을 보인 야생콩끼리 같은 그룹을 형성하여 내염성 기작에 관한 molecular origin을 탐색하는데 유용한 재료가 된다고 하였다. 그러나 본 결과에서 내염성을 나타낸 46과 147계통은 같은 cluster을 이루지 못하고 유전적 저리가 상대적으로 먼 계통임을 알 수 있었다. 이것으로 두 계통은 내염성과 직접적으로 연관이 있는 유전자에 돌연변이 발생한 것으로 생각한다.
- 내염성 확인을 위한 생리적 지표로 이용되는 MDA 함량을 분석한 결과 46 및 147계통은 대조구과 비교하여 유의성 있는 감소를 나타냈고 (p<0.05), 계통번호 96은 모품종에 비해 2배 이상 증가하여 염분에 매우 민감함을 알 수 있었다 (Figure4). MDA 함량이 감소한 46은 dendrogram에서 대조구와 원연관계임을 cluster에서 알 수 있었으며, 147은 상대적으로 대조구와 유전적 유사성이 높음을 알 수 있었다.
- 세대까지 분리 양상을 조사하여 최종적으로 분리되지 않은 계통을 선발하였다. 변이계통의 형태적 특성은 M8세대에서 조사하였는데, Table 1과 Figure 1(A)에서 보는 바와 같이 초장은 계통 번호 95가 대조구보다 25% 증가하였고, 44는 18% 감소하여 가장 적었다. 수장은 148번 계통이 대조구보다 약 10% 증가하였으며 47번 계통은 28% 감소하여 가장 작았다.
- 이것으로 두 계통은 내염성과 직접적으로 연관이 있는 유전자에 돌연변이 발생한 것으로 생각한다. 이상의 결과로 볼 때 감마선 처리에 의해 유기된 변이계통를 대상으로 실시한 형태적 분석에서 모품종과 다른 변이 계통이 관찰되어 벼 육종에 있어서 방사선을 이용한 돌연변이 육종의 이용 가능성을 제시하고 있다. 이러한 변이 계통은 allelism test를 통하여 유전자의 대립성 여부를 판단하는 데 중요한 유전자원이 되며, 유전자 발현기작을 해석하는 데 이용되고, DNA 및 단백질 분석 등으로 형태적인 특성에 관여하는 유전인자를 찾는 소재로 이용가치가 높고, 내염성을 나타낸 계통은 직접 품종으로도 활용할 수 있을 것으로 생각되며 또한 내염성 육성을 위한 교배모본으로도 활용할 수 있을 것으로 판단된다.
- 1999), 이것의 함량이 낮으면 염분 stress을 적게 받았다는 것을 암시한다. 이와 같은 연관성을 관찰하기 위하여 MDA의 함량을 조사한 후 동일염분 농도에서 2주 동안 더 생육한 결과 대조구는 완전히 고사하고, 변이체(M-147)는 여전히 생존하고 있어 MDA와 내염성은 연관성이 있음을 알 수 있었다(Figure 5). Zhang 등(1999)은 내염성 야생콩에서 dendrogram을 작성한 결과 내염성을 보인 야생콩끼리 같은 그룹을 형성하여 내염성 기작에 관한 molecular origin을 탐색하는데 유용한 재료가 된다고 하였다.
- 내도 복성의 경우 계통번호 45, 47 및 49가 강한 편이었고 46, 95, 96 및 148이 약한 것으로 조사되었으며, Figure 1 (B)에서 대조구의 종자는 타원형이지만 변이체(47 및 49)의 종자는 구형인 것을 알 수 있었다. 조사된 형태적 형질(초장, 수장, 1,000립증 및 도복)에 대해서 변이체들과 모품종을 비교하여 통계분석(t-검정)을 한 결과, 모든 변이계통에서 한 개 이상의 형질에 대해서 증가하거나 감소하여 5% 및 1% 신뢰 구간에서 통계적 유의성이 인정되었다(Table 1). 변이계통의 초장이 대조구와 비교하여 단간화 방향 그리고 1,000립중은 감소하는 분포 양상을 보인 것으로 보아 방사선 조사가 생육형질에 역방향으로 작용한 것으로 생각되며, 이와 같이 생육형질이 평균치보다 증가하가 나 감소한 것으로 유전적 변이성이 있음을 알 수 있었으며 이로서 감마선에 의해 돌연변이 계통의 선발이 가능함을 알 수 있었는데 Lee 등(1996)도 들깨에서 방사선 조사에 의해 다양한 변이계통을 선발하였다.
- 본 실험은 방사선 처리에서 유기된 벼 변이계통의 형태적 형질 및 RAPD 분석을 통하여 방사선이용 돌연변이 육종연구를 위한 기초적인 자료를 얻기 위하여 실시하였다. 형태적으로 다양한 변이를 보인 계통을 선발할 수 있었는데, 원 품종보다 이삭길이가 길고도복저항성을 나타낸 변이 계통을 선발할 수 있었다. Primer 20개를 이용하여 PCR 한 결과, 총 190개의 band가 나타났는데 그 중 71개는 polymorphic band였고, 119개는 monomorphic band로 조사되어 DNA 수준에서 변이를 확인하였다.
후속연구
- Genetic similarity 분석을 통한 유전적 거리를 조사한 결과 변이계통은 4 group으로 분류되었는데 A groupe 이삭길이에 있어서 돌연변이를 보였고, B groupe 초장 및 C groupe 천립 중에 있어서 유의성 있는 변이를 보였다. 내염성을 나타내는 돌연변이 계통을 선발할 수 있었는데, 이들 계통은 내염성 육종을 위한 재료로 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 이러한 변이 계통은 분자생물학 기술에 적용되어 식믈대사기구를 해석하는 데 이용되는데, Fujisawa 등(2001)는 벼의 돌연변이 계통을 이용하여 hetero-tumeric G protein의 기능을 해석하였다. 방사선 영향으로 변형된 염색체 종류에 따라 세포의 고정이 다르게 발생하여 돌연변이의 종류와 양상이 달라지는데(Durante et al. 1998), 변형된 염색체의 재배열이 일어나기 전에 DNA에서 변이가 먼저 발생하면 고정이 빨리 되지만, 염색체 재배열 이후에 DNA 에서 변이가 발생하면 후기 세대에서도 분리가 계속 발생할 것으로 생각하는데, 본 연구의 M7 세대에서도 분리되는 계통은 후자의 원인에 의한 것으로 생각하나 이러한 가설을 뒷받침하기 위해서는 본 실험에 이용된 재료에 대해서 정확한 핵형 분석이 이루어져야 할 것으로 생각한다.
- 이상의 결과로 볼 때 감마선 처리에 의해 유기된 변이계통를 대상으로 실시한 형태적 분석에서 모품종과 다른 변이 계통이 관찰되어 벼 육종에 있어서 방사선을 이용한 돌연변이 육종의 이용 가능성을 제시하고 있다. 이러한 변이 계통은 allelism test를 통하여 유전자의 대립성 여부를 판단하는 데 중요한 유전자원이 되며, 유전자 발현기작을 해석하는 데 이용되고, DNA 및 단백질 분석 등으로 형태적인 특성에 관여하는 유전인자를 찾는 소재로 이용가치가 높고, 내염성을 나타낸 계통은 직접 품종으로도 활용할 수 있을 것으로 생각되며 또한 내염성 육성을 위한 교배모본으로도 활용할 수 있을 것으로 판단된다.
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