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문제 정의
- 그러므로, 본 연구는 무의 표지인자 개발을 위한 RAPD 분석조건을 최적화하고 이를 이용하여 무의 유전자지도를 작성하여 육종에 활용하기 위한 기술을 확립하고자 수행하였다.
- 활용될 수 있다. 따라서 본 연구에서는 무에서 양친인 835'와 B2'에서 유래한 여교잡 집단 82개체를 이용하여 RAPD 유전자군 지도를 작성하고 관련 마커를 탐색하여 육종에 이용하고자 연구를 수행하였다.
- 따라서, 작물 육종 과정에서 환경의 영향이나 다른 유전자의 상위효과 (epistasis)를 배제하고 선발의 정확성 및 효율성을 제고하기 위한 방법이 연구되었다. 그 중의 하나는 형태적인 마커와 isozyme 마커를 이용하는 것인데 이러한 마커들은 그 수가 제한되어 있고 대부분이 열악한 표현형을 나타내기 때문에 선발과정에 효율적으로 이용되지 못하였다.
- 본 연구에서는 여교잡 분리 세대를 유전자지도 작성용 재료로 이용하였으므로 모계 (회복친에서 일어난 조환을 뚜렷이 알 수 없기 때문에 부계친 (BJ의 게놈에서 일어난 조 환만을 가지고 연관거리를 추정하였다. BGF| (P, ) 82개체에서 scoring된 128개의 RAPD 표지 인자를 MAPMAKER/EXP 프로그램을 이용하여 LOD score 2.
제안 방법
- QIAGEN의 gel elution kit를 이용하여 DNA를 순수 분리한 다음 pGEM-Easy Vector (Promega)에 cloning하였다. Accu Prep Plasmid Extraction Kit (Bioneer)를 이용하여 plasmid DNA를 분리하고. Thermal Cycling Sequencing Kit (Amersham-Pharmacia Biotech)를 이용하여 분석한 염기서열로 STS분자 표지개발을 위한 primer를 제작하였다.
- 128개를 찾았다. BC]0 집단 조사를 통해 MAPMAK ER/EXP를 이용하여 연관군 지도를 작성하였다. 분리 분석된 RAPD 표지인자 128개 중 126개는 멘델의 이론 분리비 1:1 에 적합하였으며, 2개는 동형접합체 (모본형) 쪽으로 편중되어 분리되었다.
- MAPMAKER program을 이용하여 LOD 값3.0, X2을 근거로 하여, DNA 마커에 대한 상호간의 연관 관계를 분석한 바 9개의 연관된 군과 5개의 독립적인 군으로 구분되었다.
- PCR 반응은 4800 (Perkin-Elmer, USA) 을 사용하여 template DNA 40 ng, Taq polymerase 0.8 unit, primer 20 ng, dNTP 100 μM의 조성으로 5분간 denaturation한 다음 94℃ 에서 1분, 37℃ 에서 1부 72℃ 에서 2분간을 50 cycle로 반복하였다.
- 8 units으로 하였으며, PCR 조건은 처음에는 94'C에서 5분간 denaturation하였고, 연속적으로 94℃에서 30초 56℃ 에서 30초 72℃ 에서 60초의 조건으로 50회 반복한 후 72℃에서 10분간 안정화하였다. PCR 산물을 전기영동 하여 STS표지로 확인된 band 양상과 RAPD 분석에 의해 합성된 band 양상을 서로 비교하여 분리집단에서 co segregation 되는지 확인하였다.
- PCR 증폭 후 특이적으로 나타나는 DNA 단편을 잘라내어. QIAGEN의 gel elution kit를 이용하여 DNA를 순수 분리한 다음 pGEM-Easy Vector (Promega)에 cloning하였다. Accu Prep Plasmid Extraction Kit (Bioneer)를 이용하여 plasmid DNA를 분리하고.
- RAPD 결과 나타난 다형성 밴드 가운데 우성으로 표현된 마커들을 수치화 (2)하여 컴퓨터 프로그램 MAPMAK ER/EXP (ver. 2.0)을 이용하여 (Lander et al. 1987) LOD > 4.0, 조환가(theat) =025의 group 명령어로 연관된 일군의 마커들을 분리하였고. 공분리 하는 마커들 중 한 마커만을 기본유전자 지도에 위치시킨 후 프로그램의 order와 compare 명령어, rearrange 기능을 이용하여 정확한 마커의 배열순서를 결정하였으며 그 배열순서를 확인하기 위하여 ripple 명령어를 이용하였고 ripple시 LOD>2.
- RAPD 마커에 있어 기존에 문제시된 재현성 문제를 검정하. 기 위해 RAPD 마커를 STS 마커로 변환하였다.
- RAPD 마커에서 문제시되는 재현성 문제를 검정하기 위해 이를 STS 마커로 변환하고자 OPE10 primer에 의해 증폭된 특정 밴드를 클로닝하고 염기서열을 분석한 다음 얻어진 염기서열을 기본으로 하여 primer를 제작하여 PCR 하였다. 그 결과 lOmer인 OPE10을 이용하여 분석했을 때와 동일하였으며 목적 밴드 외 다른 밴드는 생성되지 않아 앞으로 분자 마커로서 충분히 이용될 수 있음을 보여주었다.
- RAPD 분석을 수행하여 찾아진 밴드가 BC.F, 분리 집단에서 안정적으로 유전되는지, 멘델의 분리비에 적합한지의 여부를 확인하였고, 연관 검정 및 연관군 지도 작성을 위하여 BC.F, 집단 82개체와 양친을 동시에 RAPD 분석한 후 전기영동 하여 각 개체의 유전형을 scoring 하였다.
- Accu Prep Plasmid Extraction Kit (Bioneer)를 이용하여 plasmid DNA를 분리하고. Thermal Cycling Sequencing Kit (Amersham-Pharmacia Biotech)를 이용하여 분석한 염기서열로 STS분자 표지개발을 위한 primer를 제작하였다.
- 0, 조환가(theat) =025의 group 명령어로 연관된 일군의 마커들을 분리하였고. 공분리 하는 마커들 중 한 마커만을 기본유전자 지도에 위치시킨 후 프로그램의 order와 compare 명령어, rearrange 기능을 이용하여 정확한 마커의 배열순서를 결정하였으며 그 배열순서를 확인하기 위하여 ripple 명령어를 이용하였고 ripple시 LOD>2.0인 경우에만 기본 분자 유전자지도 상에 위치시켰고, 새로운 마커를 첨가할 때에는 try 명령어를 이용하여 대략 위치를 결정한 후 계속 마커를 붙여갔다. 연관거리는 Kosambi (1944)의 계산 방법에 의한 cM으로 하였다.
- 교배모본 사이에 polymorphism을 보이고 유전자지도에 포함된 RAPD 분자표지 중에서 OPE10 primer를 이용하여 나타난 PCR product를 STS 표지로 전환하였다. PCR 증폭 후 특이적으로 나타나는 DNA 단편을 잘라내어.
- 그러나 무 genome 전체의 유전적 거리는 본 연구 결과와 일치하지는 않을 것이므로 이를 추정하기 위해 Lefebvre 등 (1996)이 발표한 자료를 참고하여 무 genome 전체의 유전적 거리를 계산하였다. Lefebvre 등 (1993)은 고추에서 유전자지도를 작성하여 고추 genome 전체의 유전적 거리를 추정하기 위해 연관군과 연관되지 않은 마커 사이에 35 cM, 즉 mapping 집단에서 검정할 수 있는 최대의 유전적 거리에 해당하는 염색체 단편이 존재한다는 가설을 세운 후 유전자 거리를 추정하였다.
- 검정하. 기 위해 RAPD 마커를 STS 마커로 변환하였다. 이를 위해 OPEIO primer에 의해 증폭된 DNA 단편 중 교배모본 P2에 특이적으로 존재하는 band를 cloning하여 염기서열 분석한 후 primer를 제작하였다.
- 무의 RAPD 분석을 하기 전에 무에 적합한 primer를 선발하고자 Operon사의 10-mer random primer 220종류, UBC 10-mer random primer 125, Wako 12-mer random primer 49 종류를 이용하여 일차 PCR을 수행하였다.
- 유전자지도 작성용으로 재현성 있는 RAPD 표지인자를 개발하기 위하여 375종류의 primer를 이용하여 양친의 RAPD를조사하였다.
- 유전자지도 작성을 위한 마커 개발 및 분리세대 분석을 위한 재현성 있는 마커를 개발하기 위하여 우선 많은 종류의 primer를 이용하여 양친간 다형화 밴드를 찾고자 하였으며, 이렇게 1차적으로 다형성을 보인 primer를 양친과 F, 개체에 대해 2차 분석하여 반복성이 있는지 확인하였다.
- 기 위해 RAPD 마커를 STS 마커로 변환하였다. 이를 위해 OPEIO primer에 의해 증폭된 DNA 단편 중 교배모본 P2에 특이적으로 존재하는 band를 cloning하여 염기서열 분석한 후 primer를 제작하였다. 5℃ 부위의 sequence는 OPEIO primer sequence (5'~CACCAGGTGA-3‘)를 포함하는 20 bp 크기 (5℃-CACCAGGTGAGGAGACGGTC-3')로 제작하였고 3℃ 부위의 primer sequence는 OPEIO primer 주변에 AT sequence가 많아 5℃ 방향으로 17 bp 앞쪽에서 존재하는 21 bp (5'-CGGCTAGATACTACACTTACT-3z< primer로 제작하였
대상 데이터
- 본 연구에서는 여교잡 분리 세대를 유전자지도 작성용 재료로 이용하였으므로 모계 (회복친에서 일어난 조환을 뚜렷이 알 수 없기 때문에 부계친 (BJ의 게놈에서 일어난 조 환만을 가지고 연관거리를 추정하였다. BGF| (P, ) 82개체에서 scoring된 128개의 RAPD 표지 인자를 MAPMAKER/EXP 프로그램을 이용하여 LOD score 2.0 분석을 한 결과 128개의 표지인 자가 유전자지도 작성에 이용되었으며, 14개의 연관 군으로 그룹이 지어졌다.
- Primer 375종류를 이용하여 양친, 835와 B2 사이의 다형화밴드 128개를 찾았다. BC]0 집단 조사를 통해 MAPMAK ER/EXP를 이용하여 연관군 지도를 작성하였다.
- Ten-mer random primers는 Operon Technologies와 University of British Columbia의 제품을 이용하였다. Operon 사의 제품은 OPA, OPB, OPC, OPD, OPE, OPF, OPG, OPH.
- 또한, Wako사의 12-mer primer도 이용하여 시 험하였는데, WA-1 set 12종. WA-3 set 5종, WA-4 set 12종 WB-4 set 9종 및 WB-5 set 3종 등 총 49종을 이용하였다.
- 다형화 밴드를 생성한 primer는 전체 조사된 것 중 약 24.3%인 82개였으며, primer당 1 개에서 4개까지 다형화 밴드가 생성되었고 총 128개의 밴드가 생성되었다. 그리고 선발된 primer에서 다형화 현상을 보인 primer에서 평균 1.
- 본 연구에 공시된 유전자지도 작성용 식물재료는 노바티스 종묘회사에서 무 위황병 저항성품종 육성을 위하여 시험 중인 835'와 B2 계통 간의 #을 835'에 여교잡하여 얻은 82 개체를 이용하였다.
- 양친 간 다형화 현상을 보인 밴드 중 분리집단에서 안정적으로 분리된 128개를 연관군 지도 작성에 이용하였다. 연관 군 지도 작성에 이용된 128개 중 126개는 멘델의 분리비 1:1에 적합하게 분리되었으며 두 개는 동형접합체 (모본형) 쪽으로 편향된 분리비를 보였다.
- 유전자지도 작성에 총 122개의 마커가 이용되었고 유전자지도의 전체 거리는 L688.3 cM이었고. 마커 간의 평균 거리는 13.
- OPI, OPJ 및 OPK의 11 set에서 각 set마다 20종씩. 총 220종의 primers를 이용하여 시험하였고, University of British Columbia사의 제품은 UBC 301부터 425까지 총 125종의 primers를 이용하였다. 또한, Wako사의 12-mer primer도 이용하여 시 험하였는데, WA-1 set 12종.
이론/모형
- Total DNA를 분리, 정제는 Chen과 Delaporta (1993)의 방법과 예 (1994)의 방법에 준하여 하였다.
- 0인 경우에만 기본 분자 유전자지도 상에 위치시켰고, 새로운 마커를 첨가할 때에는 try 명령어를 이용하여 대략 위치를 결정한 후 계속 마커를 붙여갔다. 연관거리는 Kosambi (1944)의 계산 방법에 의한 cM으로 하였다.
성능/효과
- 33% 함량에서는 1개의 primer로 1.2%, 41% 함량에서는 3개의 primer로 3.6%, 50% 함량에서는 5개 primer로 6.1%, 60% 함량에서는 35개의 primer로 42.7%, 70% 함량에서는 32개 primer로 39%를 각각 나타내었으며, 80% 함량에서는 6개의 primer로 7.3%로 나타났다. GC 함량이 60~70%인 primer들에서 전체의 81.
- 3%로 나타났다. GC 함량이 60~70%인 primer들에서 전체의 81.7%를 나타내 가장 효율성이 높은 것으로 나타났다.
- Primer 간의 GC 함량을 비교해 보면, Operon primer Kit에서 선발된 47개의 primer 중에서 GC 함량이 60%인 것은 28 개, 1개의 다형성 밴드를 나타낸 것은 18개, 2개의 다형성 밴드를 나타낸 것은 8개, 3개의 다형성을 나타낸 것은 2개로 나타났다.
- Primer의 GC 함량에 따라 구분하였을 때 60~70%의 GC 함량을 가진 것이 증폭 효율이 좋은 것으로 나타났다. 33% 함량에서는 1개의 primer로 1.
- 70%인 primer는 3개로써, 1개의 다형성밴드를 형성한 것이 2개, 2개의 다형성 밴드를 형성한 것은 1개로 나타났다. Primer의 종류에 따른 증폭 효율은 primer 염기서열의 무 게놈 내 공통성과 primer 염기 중 차지하는 GC 함량에 좌우되는 것으로 판단되었다.
- UBC primer 3번 세트 100종류와 4번 세트 25종류의 primer를 이용하여 26개의 primer가 선발되어 20.8%의 선발효율을 나타내었다 선발된 26개의 primer에서 44개의 다 형성밴드가 생성되었으며 선발된 primer 당 1.69개의 다형화 밴드가 생성되는 것으로 나타났다. (Table 1).
- 각 세트 20종류의 primer 중에서 A. B 세트와 같이 효율이 낮은 세트에서는 2종류의 primer가 선발되었고 효율이 높은 세트인 K세트에서는 14종류의 primer가 선발되었다. 최소한 1개의 다형화 표지인자를 개발하기 위해서는 3개의 primer를 조사해야 하는 것으로 분석되었다.
- 8 cM으로 Lefebvre 등 (1996)이 발표한 자료를 참고하여 무 genome 전체의 유전적 거리를 계산한.결과 무의 유전자지도는 무 genome전체의 68.7%~80.1%를 포함하는 것으로 추정할 수 있었다.
- 그 결과 Operon primer A, B. C, D, E, F, G, H, I. J 및 K 세트 220 종류의 primer 중에서 47 개의 primer가 선발되어 21.4%의 선발효율을 나타내었으며. 70개의 다형화 밴드가 생성되어 선발된 primer 당 1.
- 그 결과 lOmer인 OPE10을 이용하여 분석했을 때와 동일하였으며 목적 밴드 외 다른 밴드는 생성되지 않아 앞으로 분자 마커로서 충분히 이용될 수 있음을 보여주었다.
- 그 결과, GC 함량 50%를 가진 primer는 평균 2.8개의 밴드와 03개의 다형화 밴드를 생성하였으나 70%와 80%의 GC 함량을 가진 primer는 평균 7개의 밴드와 0.8개의 다형화 밴드를 생성하였다. Fritsch 등 (1993)은 600종류의 random decamers를 이용하여 세 가지 종류의 식물 종을 분석했을 때 primer의 증폭 효율은 세 종 간에 대체로 일치하였으며, 증폭 효율은 GC 함량과 대체로 비례한다고 하였다.
- 문제가 있다는 지적을 받아 왔었다. 그러나 본 연구에서 선발한 RAPD 표지를 STS 표지로 전환하여 두 마커가 분리되는 양상을 비교해 본 결과 분리집단에서 같은 유전자형을 가지는 것으로 보아 RAPD 마커에 의해 제작된 연관 군 지도 작성의 정확성이 있는 것으로 판단되었다 (Figure 3).
- 7%로 가장 많았다. 다형성 밴드를 생성한 UBC primer 중에서 GC 함량이 50%인 primer는 3개로써 1개의 다형화 밴드를 나타낸 것, 2 개의 다형성 밴드를 나타낸 것, 3개의 다형성 밴드를 형성한 것이 각각 1개씩이었으며, GC 함량이 60%인 primer는 7개로써 1개의 다형성밴드는 2개의 primer, 2개의 다형성 밴드는 4 개의 primer, 3개의 다형성밴드는 1개의 primer로 나타났다. GC 함량이 70%인 primer는 10개로서 1개의 다형화밴드는 6 개, 2개의 다형성 밴드는 4개로 나타났다.
- 무 genome의 물리적 거리가 총 526 Mbp인 것으로 보고되어 있으므로 본 연구에서 제작한 유전자 지도의 유전적 거리 1 cMe 312 kb의 물리적 거리에 해당하는 것을 알 수 있었다. 그러나 무 genome 전체의 유전적 거리는 본 연구 결과와 일치하지는 않을 것이므로 이를 추정하기 위해 Lefebvre 등 (1996)이 발표한 자료를 참고하여 무 genome 전체의 유전적 거리를 계산하였다.
- 본 연구에서는 BC.F, (P, ) 집단을 유전자지도 작성용 재료로 이용하였기 때문에 B, (부계) 특이 표지인자를 선발하였으며, 이런 128개의 표지인자는 분리집단에서 밴드의 생성 유무로 뚜렷이 분리되었다. 반면, 모계 특이 밴드가 부계 특이 밴드와 비슷한 크기로 생성되어 두 밴드가 상호 영향을 받는 10개의 공우성 밴드 쌍이 관찰되었다.
- Fritsch 등 (1993)은 600종류의 random decamers를 이용하여 세 가지 종류의 식물 종을 분석했을 때 primer의 증폭 효율은 세 종 간에 대체로 일치하였으며, 증폭 효율은 GC 함량과 대체로 비례한다고 하였다. 본 연구에서도 GC 함량에 따른 분석효율에서 50% 이하로 존재할 경우 분석 효율이 떨어지는 것으로 나타났다 (Table 2).
- 연관 군 지도 작성에 이용된 128개 중 126개는 멘델의 분리비 1:1에 적합하게 분리되었으며 두 개는 동형접합체 (모본형) 쪽으로 편향된 분리비를 보였다. 특이적으로 증폭된 DNA의 종류는 양친 중 한쪽에서만 특이성을 보이는 우성마커와 다른 크기의 밴드가 양쪽친에 동시에 생겨 BCiF, 집단에서 두 밴드가 공통으로 분리되는 공우성 마커로 구분할 수 있었다.
- 이 시험 결과 Operon primer에서 보인 다형성 밴드 패턴 중에서 1개의 다형화 밴드를 보이는 형태가 61.7%로 가장 많았다. 다형성 밴드를 생성한 UBC primer 중에서 GC 함량이 50%인 primer는 3개로써 1개의 다형화 밴드를 나타낸 것, 2 개의 다형성 밴드를 나타낸 것, 3개의 다형성 밴드를 형성한 것이 각각 1개씩이었으며, GC 함량이 60%인 primer는 7개로써 1개의 다형성밴드는 2개의 primer, 2개의 다형성 밴드는 4 개의 primer, 3개의 다형성밴드는 1개의 primer로 나타났다.
- 이러한 결과로 볼 때 본 연구에서 제작된 무의 유전자 지도는 무 genome 전체의 68.7%~80.1 %를 포함하는 것으로 추정할 수 있다.
- 다. 이를 이용하여 교배모본과 82개체의 BC1F1 집단을 이용하여 분리양상을 확인한 결과 교배 모본에서는 RAPD에서차이난 형태로 차이가 나는 band 양상을 보였고 분리집단 BCjF|에서도 RAPD를 이용하였을 경우와 똑같은 band 양상을 보이는 것으로 보아 RAPD에 의해 나타난 band 양상은 정확한 primer의 annealing에 의해 합성된 것을 확인할 수 있었다 (Figure 3).
- 연관 군 지도 작성에 이용된 128개 중 126개는 멘델의 분리비 1:1에 적합하게 분리되었으며 두 개는 동형접합체 (모본형) 쪽으로 편향된 분리비를 보였다. 특이적으로 증폭된 DNA의 종류는 양친 중 한쪽에서만 특이성을 보이는 우성마커와 다른 크기의 밴드가 양쪽친에 동시에 생겨 BCiF, 집단에서 두 밴드가 공통으로 분리되는 공우성 마커로 구분할 수 있었다.
후속연구
- 무가 우리나라의 채소작물에서 차지하는 중요성에 비추어볼 때 이런 생명공학적 기초 연구가 활발히 진행되어 무의 육종에 유용하게 이용될 수 있는 기반을 제공하여야 할 것이다. 그러므로, 본 연구는 무의 표지인자 개발을 위한 RAPD 분석조건을 최적화하고 이를 이용하여 무의 유전자지도를 작성하여 육종에 활용하기 위한 기술을 확립하고자 수행하였다.
- 본 실험에서는 RAPD 마커를 이용한 유전자연관군지도 작성으로 실험과정이 간편하고 마커의 탐색이 용이하였지만, pirmer 당 충분한 다형성 밴드를 보이지 않아 어려움이 있었기에 앞으로 많은 다형성밴드를 생성할 수 있는 AFLP를 이용하여 밀도 높은 유전자지도 작성으로 복잡한 유전양상을 보이는 무의 위황병 저항성 연관 마커의 개발로서 품종육성의 기초자료로 이용할 수 있을 것으로 사료된다.
- I세트에서 18번은 4개의 다형성 밴드를 나타내었다. 앞으로 K세트처럼 선발효율이 높은 세트를 선발할 경우 더 많은 다형화밴드를 찾을 수 있을 것으로 생각되었다.
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