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문제 정의
- 로 하여 우선적으로 분자량 감쇄 기술을 고찰해 보고자 한다. 향후, 분리정 제 기술을 바탕으로 BBG의 분자량별 library를 구축하는데 일조를 하리라사료된다.
제안 방법
- 확인하였다. (주)태평양의 SC-Glucan111 에 대한 실험 결과에 이어서, 균류인 Botrytis 에서 추출된 BBG인 Cinerean 에 대한 초음파 처리 결과를 조사하였다. 천연 상태로는 Cinerean의 분자량이 SC-Glucan珈보다 1/10 수준이다.
- 고분자 다당류에 대한 물리적인 저분자화법으로서 실험실수준에서 널리 이용되어온 초음파 처리법을 이용하여, BBG의저 분자화를 시도하였다. 초음파 처 리 강도 2 intensity에서 시 간에 따른 분자량의 변화를 gel filtration chromatography로 측정한 결과는 Fig.
- 따라서, 우선, 분지도가 낮은 Cinerean을 대상으로, 본 연구자들이 확보하고 있는 endo-B-(l, 3)-glucanase를 이용하여 가수분해 반응을 조사하였다. 최적의 효소 반응 조건에서 일정 시간의 반응 후어〕, 열처리를 통하여 효소를 불활성화 시킴으로서 반응을 중지하였으며, 반응의 산물은 GFC-HPLC를 통하여분리하고 RI detector 검측을 통하여 산물의 분자량 분포를 계측하였다.
- 이 반응 시간과 온도가 가수 분해정도를 결정하게 되며 마련되는 저분자 SC-Glucan™의 분자량을 결정하게 된다. 반응이끝난 후, 반응액 대비 약 1.5배 용량의 ethanol을 첨가하여가수 분해된 SC-Glucan™을 침전시키고, 원심분리 등의 방법으로 회수하였다. 초순수를 첨가하여 다시 용해시킨 후, 3시간 동안 끓이는 방법으로 잔류된 formic acid를 제거하였다.
- 본 연구에서는, 산 처리를 통하여 BBG의 분자량을 감소시켰으며, alkaline 조건을 가하여 triple helix인 3차 구조를 dissociation시키고 alkaline 조건을 유지하면서 저분자 량의 P -(l, 3)-glucans을 분리하였다. 이것을 적정한 pH와 온도의 조건에서 다시 annealing 시켜서 triple helix 구조를 되찾도록 하였다.
- Alcaligenes faecalis 유래 의 curdlan은 Megazyme (아일 랜드) 사에서, Umbilicaria papullosa 유래의 pustulan 은 미국 Calbiochem사에서 구입하였다가 Cinereal^ Botrytis cinereaS. 부터 생산되는 extracellular polysaccharide로서, 본 연구에서는 균주를 직 접 배 양하여 수득하였다. 20g/L 농도의 포도당을 단일 탄소원으로, 1.
- 분자량이 1 MDa 이상인 6-(l, 6)-branched g-(l, 3)-glucan의 효과적인 저분자화 방법을 물리적인 방법, 화학적인 방법, 효소적인 방법으로 나누어 고찰하였다. 물리적인 방법인 초음파처리의 경우엔, 저분자화가 진행됨에 따라 감소하는 저분자 화의 효율로 인하여 산업적으로 일정 수준이하의 BBG을 수득하기에 난점이 있으며, 또한 3차 구조의 변성 문제도 주목해야 할 것이다.
- 분지도가 낮은 Cinerean의 경우와 달리, 분지도 DB=0.3에 달하는 SC-Glucan퍼에 대해서도 효소에 의한 분자량 감쇄 여부를 조사하였다. 상업적으로 시판되고 있거나 본 연구자들이 취득하고 있는 십 여 가지 B-(l, 3)-glucanase를 이용하여 효소 반응을 수행하여 보았으나 효과적 인 가수분해 반응이 관찰되지 않았다.
- 생화학적 방법에 사용된 효소는 endo-6-(l, 3)-glucanase와 0 -(l, 6)-glucanase로서, 상업적으로 시판 (미국 Megazyme사, SIGMA-Aldrich사 등)되고 있거나 본 연구자들이 확보하고있는 P-glucanase 효소들을 이용하여 B-(l, 3)-glucan 의 저분 자화 가능성을 조사 및 고찰하였다.
- 3)-glucans을 분리하였다. 이것을 적정한 pH와 온도의 조건에서 다시 annealing 시켜서 triple helix 구조를 되찾도록 하였다. 상기된 실험 방법에 따라 가수분해 되고 저분 자화된 SC~GhicaiP 용액에 NaOH를 첨가하여 pH를 12.
- 반응을 조사하였다. 최적의 효소 반응 조건에서 일정 시간의 반응 후어〕, 열처리를 통하여 효소를 불활성화 시킴으로서 반응을 중지하였으며, 반응의 산물은 GFC-HPLC를 통하여분리하고 RI detector 검측을 통하여 산물의 분자량 분포를 계측하였다. 일정 시간의 효소 반응에 따른 가수분해 산물은 정규 분포적인 분자량 분포를 나타내었으며, 반응 시간에 따라평균 분자량이 감소함을 확인할 수 있었다(Fig.
- 제조된 저분자 SC-Glucan™의 평 균 분사량은 gel filtration chromatograph로부터 으扌 90, 000으로 확인되었다. 화학적 처리 후의 conformation 변화를, 전형적인 triple helix 구조의 잉 ucan 인 curdlan 과 전형적인 non-ordered 구조의『(l, 6)-glucan인 pustulan을 control sample로 하여, aniline blue complexing fluorescence 방법(5)으로 측정하였다. 정상적인 BBG의 경우 높은 fluorescence를 보이게 되지만, NaOH를 농도별로 첨가하게 되 면 triple helix의 dissociation 에 따라 fluorescence 가 감소하게 된다.
대상 데이터
- 0-(l, 3)-glucan로는 SC-Glucan01 을 주로 사용하였으며, 기타 cinerean, curdlan, pustulan 둥을 사용하였다. (주)태평양에서 skin care 용 화장품의 원료로 생산되는 SC-Glucan111 은 치마버섯 인 Schizophyllum commune Fr.
- 5 g/L 의 KNO3를 단일 질소원으로 하여 minimal salt 배 지 에 서 Botrytis cinerea를 배 양하였으며, 기타 배양 조건과 다당류의 침전 조건은 Stahmann 등에 의해 기술된 바와 같다(6). Aniline Blue Fluorochrome은 BioSupplies사 (미국)에서 구입하였다. 기타 시약 및 소모품은 분석급을 사용하였다.
- 따라서, 본 연구에서는 몇 가지 고분자량의 BBG을 소재 . 로 하여 우선적으로 분자량 감쇄 기술을 고찰해 보고자 한다.
- 물리 적 인 분자량 조절 방법 에 사용된 초음파 처 리 기는 미국 Sonics 사의 VC-130 (130 watt) 기기를 사용하였다. 화학적 가수분해 반응에 의한 분자량 조절 방법은 다음과 같다.
- 전형적인 버pie helix 구조의 8-(1, 3)- glucan인 curdlan과 전형적인 non-ordered 구조의 B-(l, 6)・glucan인 pustulan을 표준 물질로서 이용하였다' Triple helix 구조인 경우, aniline^ BBG가 효과적으로 complex를 이루게 되 어 높은 fluorescence# 나타내 게 되며, triple helix 구조가 사라짐 에 따라 fluorescence?]- 감소하게 된다. 형광광도계는 일본 Shimadzu 사의 RF-5301 을 사용하였다
이론/모형
- BBG 의 3차 구조의 변화는 aniline blue complexing fluorescence 방법(5)을 이용하여 간접적으로 측정하였다. 전형적인 버pie helix 구조의 8-(1, 3)- glucan인 curdlan과 전형적인 non-ordered 구조의 B-(l, 6)・glucan인 pustulan을 표준 물질로서 이용하였다' Triple helix 구조인 경우, aniline^ BBG가 효과적으로 complex를 이루게 되 어 높은 fluorescence# 나타내 게 되며, triple helix 구조가 사라짐 에 따라 fluorescence?]- 감소하게 된다.
- 하였다. HPLC 시스템은 영린기기의 ACME model을 이용하였으며, GFC column 은 미 국 Waters 사의 Ultrahydrogel-linear, Ultrahydrogel-1000, Ultrahydrogel-2000 등과 Ultrahydrogel guard column을 사용하였다. 분자량 standard 로는 역시 미국 Waters사의 polyethyleneoxide2]- pullulan kit를 사용하였다.
- 분자량은 HPLC system과 refractive index detector를 이용하여 흠el filtration 나iromatography (GFC)의 방법으로 측정 하였다. HPLC 시스템은 영린기기의 ACME model을 이용하였으며, GFC column 은 미 국 Waters 사의 Ultrahydrogel-linear, Ultrahydrogel-1000, Ultrahydrogel-2000 등과 Ultrahydrogel guard column을 사용하였다.
- SC-Glucan"™이 Cinerean보다 6 -(l, 6)-branch들이 많고 따라서 triple helix의 3차 구조가 좀 더 강하므로, 분자량 감소의 효율이 낮은 것이라 추정된다. 초음파 처리에 따르는 SC-Glucan퍼과 Cinerean의 3차 구조 변화를 aniline blue complexing fluorescence 방법(5)으로 조사하였다. 초음파 처 리 에 따라 aniline complex의 fluorescence가 점차로 감소하는 것을 관찰하였으며 , 이 는 BBG의 triple helix 3차 구조에 명확한 변화를 일으키는 것으로 판단되고 있다.
성능/효과
- 정상적인 BBG의 경우 높은 fluorescence를 보이게 되지만, NaOH를 농도별로 첨가하게 되 면 triple helix의 dissociation 에 따라 fluorescence 가 감소하게 된다. Table 1의 결과로부터, 마련된 저분자 SC-Glucan现이 화학적 처리에도 불구하고 효과적으로 triple helix 구조를 유지하고 있음을 확인할 수 있다. 그러 나 annealing 기술에 의 한 triple helix 구조의 유지 에 도 불구하고, ]3-(l, 3)-ghican의 약리적 효능에 필수적인 0-(L6)-bTanch의분지도는 화학적 처리에 의해 상당량 감소되었음이, 현재 진행되는 실험에서 확인되고 있다.
- 3). 또한, 낮은 분자량까지 SC-Glucan™보다는 효율적 인처리 결과를 보여주었다. SC-Glucan"™이 Cinerean보다 6 -(l, 6)-branch들이 많고 따라서 triple helix의 3차 구조가 좀 더 강하므로, 분자량 감소의 효율이 낮은 것이라 추정된다.
- 4). 또한, 낮은효소량 (0.01 unit/mL)을 투여하여 반응을 서서히 진행시킴으로써, oligomeric fragment 의 생성을 억제할 수 있었다. 효소 반응 산물은 비교적 넓은 범위의 정규적 분자량 분포를 보였으나, aniline blue complexing fluorescence 조사 결과 3차 구조의변화는 관찰되 지 않았다.
- 최적의 효소 반응 조건에서 일정 시간의 반응 후어〕, 열처리를 통하여 효소를 불활성화 시킴으로서 반응을 중지하였으며, 반응의 산물은 GFC-HPLC를 통하여분리하고 RI detector 검측을 통하여 산물의 분자량 분포를 계측하였다. 일정 시간의 효소 반응에 따른 가수분해 산물은 정규 분포적인 분자량 분포를 나타내었으며, 반응 시간에 따라평균 분자량이 감소함을 확인할 수 있었다(Fig. 4). 또한, 낮은효소량 (0.
- 0으로 맞주고, 60°C 에서 20분간 고온처리하며 triple helix 구조로 re-annealing 시켰다' 이후 cut-off 20, 000 UF membTane을 통하여 잔류한 NaCl을 제거하고 농축하였다. 제조된 저분자 SC-Glucan™의 평 균 분사량은 gel filtration chromatograph로부터 으扌 90, 000으로 확인되었다. 화학적 처리 후의 conformation 변화를, 전형적인 triple helix 구조의 잉 ucan 인 curdlan 과 전형적인 non-ordered 구조의『(l, 6)-glucan인 pustulan을 control sample로 하여, aniline blue complexing fluorescence 방법(5)으로 측정하였다.
- 초음파 처리에 따르는 SC-Glucan퍼과 Cinerean의 3차 구조 변화를 aniline blue complexing fluorescence 방법(5)으로 조사하였다. 초음파 처 리 에 따라 aniline complex의 fluorescence가 점차로 감소하는 것을 관찰하였으며 , 이 는 BBG의 triple helix 3차 구조에 명확한 변화를 일으키는 것으로 판단되고 있다. 이러한 구조변화의 문제는 향후 저분자화 된 BBG의 효능에 있어서 천연의 경우와 큰 차이를 나타낼 가능성 이 있다.
- 초음파 처리에 따라 분자량의 감소가 이루어짐을 관찰 할 수 있었으나, 분자량 감소에 따라 처리 시간에 따른 효율 역시 낮아짐을 확인하였다. (주)태평양의 SC-Glucan111 에 대한 실험 결과에 이어서, 균류인 Botrytis 에서 추출된 BBG인 Cinerean 에 대한 초음파 처리 결과를 조사하였다.
후속연구
- 로 하여 우선적으로 분자량 감쇄 기술을 고찰해 보고자 한다. 향후, 분리정 제 기술을 바탕으로 BBG의 분자량별 library를 구축하는데 일조를 하리라사료된다.
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