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문제 정의
- 본 연구에서 파리지옥풀 first trap leaf에서만 특이적으로 발현하는 유전자군을 탐색하기 위하여 기내 배양 식물체와 포충능력을 가진 3년생 실생주을 이용하여 각각의 leaf base, flower tissue 및 first leave trap에서 발현량이 차이가 나는 유전자군을 FDD법으로 분리하여 그 특성을 조사하였다.
제안 방법
- Screening of first trap leaf specific transcripts by the FDD. After cDNA synthesis with GT15VA anchored primer (5'- GTTTTTTTTTTTTTTT(A, C, or G)A-3‘), the FDD-PCR was performed in combination with 32 arbitrary primers (Table 1). Organs were leaf base from plants grown in in vitro (A), leaf base from plants grown in in vivo (B), flower tissue (C), first trap leaf from plants grown in in vitro (D) and first trap leaves from plants grown in in vivo (E).
- 이들 중 leaf base 특이적인 band는 6개였으며, first trap leaf 특이적인 band는 17개로 나타났다. DD- PCR의 단점 중재현성 문제를 실험하기 위하여 1차 FDD- PCR을 수행하여 선발된 기관특이band들을 사용하여 2차 FDD-PCR를 수행하였다. 그 결과 first trap leaf에서만 강하게 발현되는 type (Figure 3A, 3C), leaf base에서는 약하게 발현되고, flower tissue에는 발현되지 않으나, first trap leaf에서는 강하게 발현되는 type (Figure 3B), first trap leaf에 d이ible band로 강하게 발현되는 type (Figure 3C)으로 나누어졌다 몇몇 연구자들은 FDD-PCR방법의 문제점으로 PCR의 low-stringency와 false positive의 선발 등을 지적하고 있다.
- FDD-PCR 분석에 의해 cloning된 15개의 cDNA fragment 를 대상으로 leaf base (LB), first trap leaf 중에서 기내 배 양식 물체 유래(TL, 讹 μ访0)와 3년생 실생주 유래(TL, 讹 忻μ°)로 부터 분리한 total RNA> 사용하여 Northern blot 분석을 실시하였다. 결과 7L5와 TL7은 모든 기관에서 발현되나 3년생 실생주의 f订st trap leaf에서 가장 강하게 발현되었으며 (Figure 5A), TU, TL8, TL13 및 TL15은 first trap leaf 특이적으로 발현되 었으며, (Figure 5B), TL1, TL3, TL9, TL11 및 TL12는 기내 배 양식물체 (TL, in mm?)와 3년생 실생주(TL.
- 그리고 fluorescent image analyzer에 한 번 더 scan- riing한 후 차이가 나는 단편과 동일한 band를 칼로 잘라 200 TE용액에 30분간 침적시켜 DNA를 분리하였다. Gel 조각은 15000rpm으로 5분간 원심분리하여 제거한 후, DNA는 에탄올으로 침전시켜 20“L 멸균수를 넣어 용해하였다 DNA 단편은 첫 번째 증폭에 사용하였던 primer로 증폭시켜 확인한 후, kit (Prep-A-Gene, Bio-Rad)로 정제하여 pGEM T-vector (Promega)에 이oning 하였다. 형질전환에 사용된 E.
- 1% SDS 용액을 넣고 60℃에서 2시간 동안 수행하였으며, 선발된 plasmid로부터 PCR(SP6, T7 primer)에 의해 증폭된 DNA를 3乍로 labelling한 probe와 overnight으로 hybridization시켰다. Membrane의 세척은 2XSSC, 0.1% SDS 용액으로 실온에서 5분씩 2회, 0.5XSSC, 0.1%SDS용액으로 65℃에서 15분간 0.1 XSSC, 0.1% SDS용액으로 65℃에서 15분간 세척한 후, X-ray film (Kodak)에 감광시켜 band를 확인하였다.
- Plasmid DNA를 정제한 후, automatic DNA sequencer (AB1373)를 이용하여 dideoxynucleotide chain termination 방법 (ABI PRISM Dye Terminator)으로 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기 서열은 Blast (http://www.
- Plasmid내에 삽입된 DNA 단편이 기관 특이적으로 발현하는 것인지를 조사하기 위하여 probe를 DIG labellin영 kit (Boehringer Mannheim)^ 표식 하여 사용하였다 FDD-PCR 산 물과 이oning된 DNA를 전기영동한 후, 한쪽면의 glass plate# 떼어낸 다음 gel 표면에 nylon membrane (Hybond-N, Amersham)을 얹고, 그 위에 3장의 Whatman 3 MM filter paper와 한쪽면에서 떼어낸 glass를 올려 2시간 동안 DNA를 membrane에 transfer하였다. Hybridization 및 detectione DIG labelling kit의 설명 한 방법에 따라 실시하였다.
- RNA가 전이된 membrane을 filter paper 위에 올려놓고 UV transilluminator로 2분간 cross-linking시켰다. Pre-hybridizatiorie 60xSSC, 5% dextran sulfate, 0.1% SDS 용액을 넣고 60℃에서 2시간 동안 수행하였으며, 선발된 plasmid로부터 PCR(SP6, T7 primer)에 의해 증폭된 DNA를 3乍로 labelling한 probe와 overnight으로 hybridization시켰다. Membrane의 세척은 2XSSC, 0.
- Figure 4. Reamplification of DNA fragments screened by first FDD using GT15VA anchored primer (5 z-GTTTTTTTTTTITrTT(A, C, or G)A-3‘)and 32 arbitrary primers (Table 1). fifteen bands were selected for cloning.
- 5 “g의 total RNA, 역전사 효소 (Super Script Ⅱ, Gibico BRL), 그리고 oligo-dT primer를 사용하여 합성하였다. Second strand는 FDD-PCR의 첫 cyclee 임의로 제작된 primed (Table 1) 중 하나를 사용하여 PCR하였으며, 그 후의 cyclee rhodammieXisothiocyanate(XRITC〃r 표식 된 primer와 임의의 primer를 사용하여 FDD-PCR를 수행하였다. PCR 산물 10.
- Plasmid DNA를 정제한 후, automatic DNA sequencer (AB1373)를 이용하여 dideoxynucleotide chain termination 방법 (ABI PRISM Dye Terminator)으로 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기 서열은 Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 분석하 고, 아미노산 및 다중염기 배열의 비교는 GeneWorks system을 이용하여 수행하였다.
- 파리지옥 풀 (Di아典以 mi枯cipida) 의 leaf base, flower tissue 및 first trap leaf의 samplee first trap leaf에 곤충이 한 번도 접하지 않았던 기내 배양 식물체와 곤충을 접한 경험이 있는 3년생 실생주로부터 각각 분리하였다 (Figure 1). 곤충을 접했던 first trap leaf으로부터 곤충의 외피를 구성하는 비소화성물질을 제거하기 위해 트랩 부분을 떼어 멸균수에 3회 세척후, 물기를 제거하고 액체질소로 동결하여 totalRNA를 분리 하였다.
- 파리지옥풀 Hrst leave trap에서믄! 발현하는 유전자군을 분리하기 위한 FDD-PCR 조건을 정하기 위하여 같은 cDNA sample 을 이용하여 dNTP 농도, template cDNA량, extension 시간 등을 조사하였다. 그 결과 50 dNTP, 1 匹 cDNA template 그리고 1분의 extenskm 조건하에서 가장 안정적인 signal pattern 을 얻을 수 있었다 따라서 이 FDD-PCR 조건 하에서 실험을 수행하였다.
- 전기영동한 후, acrylamide gel로부터 발현양이 차이나는 DNA 단편들을 분리하기 위하여 plate와 같은 크기로 gel을 인쇄하여 부착한 후, signal pattern을 찾아 붉은 매직 펜으로 표식하였다. 그리고 fluorescent image analyzer에 한 번 더 scan- riing한 후 차이가 나는 단편과 동일한 band를 칼로 잘라 200 TE용액에 30분간 침적시켜 DNA를 분리하였다. Gel 조각은 15000rpm으로 5분간 원심분리하여 제거한 후, DNA는 에탄올으로 침전시켜 20“L 멸균수를 넣어 용해하였다 DNA 단편은 첫 번째 증폭에 사용하였던 primer로 증폭시켜 확인한 후, kit (Prep-A-Gene, Bio-Rad)로 정제하여 pGEM T-vector (Promega)에 이oning 하였다.
- 이를 극복하기 위하여 first trap leaf 특이적인 band를 template로 사용하여 같은 조건 하에서 재증폭시킨 결과 선발된 17개의 band 중 2개는 증폭되지 않았다 (Figure 4). 따라서 증폭된 DNA fragment들을 E. c湖에 형질전환시켜 cloning하였다 또한 cloning된 특이적인 단편이 원래 FDD- PCR에 나타났던 산물과 단편의 크기가 같은지를 알아보기 위해 co-migration test를 실시하여 본 결과 선발된 크기의 단편과 동일함을 확인하고 염기서열을 조사하였다. Ito 등(1996)은 이론적으로 잎 조직에서 발현되는 유전자가 15,000~ 20, 000정도로 추정했을 때, FDD-PCR 한lane에서 증폭되는 band가 100개를 계산하여 150~200개 FDD-PCR를 수행하여 야 100% cover 할 수 있다고 하였다.
- 파리지옥풀 Hrst leave trap에서믄! 발현하는 유전자군을 분리하기 위한 FDD-PCR 조건을 정하기 위하여 같은 cDNA sample 을 이용하여 dNTP 농도, template cDNA량, extension 시간 등을 조사하였다. 그 결과 50 dNTP, 1 匹 cDNA template 그리고 1분의 extenskm 조건하에서 가장 안정적인 signal pattern 을 얻을 수 있었다 따라서 이 FDD-PCR 조건 하에서 실험을 수행하였다.
- L를 같은 양의 dye 용액과 혼합하여 90℃에서 3분간 변성시킨 후, 얼음에 즉시 넣어 냉각시켰다. 이 중 3 川」를 4.5% polyacrylamide g이에 loading하여 1600V로 2.5시간 전기영동하였다 전기영동조(Biocraft)로부터 떼어낸 plate를 fluorescent image analyzer (FM-Bio, TAKARA) 에 고정하여 scanning하였다. Gel image는 software (FM-Bio analysis ver 5QTAKARA)로 분석하였다.
- 전기영동한 후, acrylamide gel로부터 발현양이 차이나는 DNA 단편들을 분리하기 위하여 plate와 같은 크기로 gel을 인쇄하여 부착한 후, signal pattern을 찾아 붉은 매직 펜으로 표식하였다. 그리고 fluorescent image analyzer에 한 번 더 scan- riing한 후 차이가 나는 단편과 동일한 band를 칼로 잘라 200 TE용액에 30분간 침적시켜 DNA를 분리하였다.
대상 데이터
- Signals were detected by the FM-BIO image analyzer at the 16-times reading mode. After 32 trials of FDD-PCR, 17 bands were selected for further analysis. Arrowheads represent specific bands in first trap leaf.
- Reamplification of DNA fragments screened by first FDD using GT15VA anchored primer (5 z-GTTTTTTTTTTITrTT(A, C, or G)A-3‘)and 32 arbitrary primers (Table 1). fifteen bands were selected for cloning. DNA fragments were eluted from excised gel slices, and reamplified under same condition used first FDD.
데이터처리
- 5시간 전기영동하였다 전기영동조(Biocraft)로부터 떼어낸 plate를 fluorescent image analyzer (FM-Bio, TAKARA) 에 고정하여 scanning하였다. Gel image는 software (FM-Bio analysis ver 5QTAKARA)로 분석하였다.
이론/모형
- Plasmid내에 삽입된 DNA 단편이 기관 특이적으로 발현하는 것인지를 조사하기 위하여 probe를 DIG labellin영 kit (Boehringer Mannheim)^ 표식 하여 사용하였다 FDD-PCR 산 물과 이oning된 DNA를 전기영동한 후, 한쪽면의 glass plate# 떼어낸 다음 gel 표면에 nylon membrane (Hybond-N, Amersham)을 얹고, 그 위에 3장의 Whatman 3 MM filter paper와 한쪽면에서 떼어낸 glass를 올려 2시간 동안 DNA를 membrane에 transfer하였다. Hybridization 및 detectione DIG labelling kit의 설명 한 방법에 따라 실시하였다.
- Northern blot 분석을 위한 total RNA는 ATA방법 (Gonzalez이 al. 1980)으로 분리하였다. 20의 total RNA를 1% formaldehyde/agarose gel에서 전기영동한 nylon membrane (Hybond-N, Amersham)에 transfer.
- 형광 differential display (FDD)는 If。등 (1996)이 보고한 방법을 약간 변형시켜 수행하였다. Total RNA는 ATA방법 (Gonzalez et al. 1980)으로 분리하였으며, DNase 처리 후 LiCl 로 정제하였다. cDNA는 2.
- Gel 조각은 15000rpm으로 5분간 원심분리하여 제거한 후, DNA는 에탄올으로 침전시켜 20“L 멸균수를 넣어 용해하였다 DNA 단편은 첫 번째 증폭에 사용하였던 primer로 증폭시켜 확인한 후, kit (Prep-A-Gene, Bio-Rad)로 정제하여 pGEM T-vector (Promega)에 이oning 하였다. 형질전환에 사용된 E. coli 균주는 XL 1-Blue로 heat shock 방법으로 형질전환시켰다'Insert의 확인은 colony PCR로 수행하였으며, 적당한 M기를 가진 plas- mid는 alkaline lysis 방법으로 추출하여 사용하였다.
성능/효과
- 2002). 75의 E 말단 부분의 220 bp의 부분 염기배열은 allatotropin에 관련된 유전자와 상동성이 매우 높았 匸h 아미노산 배열에서도 Spodoptera frugiperdae} allatotropin유전자와 90%의 상동성을 보였다. Allatotropin는 곤충에서 methyl famesoatee] 전구체 물질로 hormone 생합성 에 관여하는 것으로 알려져 있다.
- 분리한 15개의 DNA의 염기서열을 조사하여 GenBank내에 EMBL 및 dbEST data bases와 비교한 결과 6개의 유전자는 기존에 알려진 유전자와 유사성을 보였으며, 나머지 9개 clone들은 전혀 알려지지 않았거나 중요match부분이 없었다 (Table 2). TL2^\ 부분 염기 서열은 3’ 말 단부분의 270 bp의 단편으로 membrane bound O-acyl transferase 유전자와 높은 상동성을 보였으며, 아미노산 배열에서 Arabidopsis, 벼의 membrane bound O-acyl transferase 유전자와의 상동성은 각각 86%, 80%로 나타났다. Membrane bound O-acyl transferase 유전자는 세포골격을 구성하는 단백질로 알려져 있다(Micchelli et al.
- 따라서 71$ 유전자는 식충 식물인 파리지옥풀의 first trap leaf 에 걸려든 곤충들로부터 양분 흡수에 중요한 역할을 하는 단백질로 사료된다. TL8 DNA의 3’ 말단 부분의 310 bp는 lipocalin-type postaglandin D synthase와 매우 유사하였으며, 아직 기능 및 작용에 대하여 전혀 알려진 바 없다 77/DNA의 3’말단부분의 275 bp는 inosit이 생합성 경로에서 glucose-6- phosphate (G-6-P)를 myo-inositol-1 -phosphate (Insol-1-P)로 바꾸는 myo-inositol-1 -phosphate synthase 유전자와 높은 상동성을 보였다. Insol-1-P는 phospholipid을 형성하는 데 필요하며, plasma membrane phosphoinositide기질로 이용된다.
- FDD-PCR 분석에 의해 cloning된 15개의 cDNA fragment 를 대상으로 leaf base (LB), first trap leaf 중에서 기내 배 양식 물체 유래(TL, 讹 μ访0)와 3년생 실생주 유래(TL, 讹 忻μ°)로 부터 분리한 total RNA> 사용하여 Northern blot 분석을 실시하였다. 결과 7L5와 TL7은 모든 기관에서 발현되나 3년생 실생주의 f订st trap leaf에서 가장 강하게 발현되었으며 (Figure 5A), TU, TL8, TL13 및 TL15은 first trap leaf 특이적으로 발현되 었으며, (Figure 5B), TL1, TL3, TL9, TL11 및 TL12는 기내 배 양식물체 (TL, in mm?)와 3년생 실생주(TL. in Wi切)의 first trap leaf 특이적으로 발현되었다 (Figure 5C). TL2, TL6r TL10 및 TL14는 기내 배양 식물체 유래 first trap leaf에서는 발현되지 않는 반면, 3년생 실생주의 first trap leaf에서 만 특이적으로 발현 양상을 보였다 (Figure 5D).
- 분리한 15개의 DNA의 염기서열을 조사하여 GenBank내에 EMBL 및 dbEST data bases와 비교한 결과 6개의 유전자는 기존에 알려진 유전자와 유사성을 보였으며, 나머지 9개 clone들은 전혀 알려지지 않았거나 중요match부분이 없었다 (Table 2). TL2^\ 부분 염기 서열은 3’ 말 단부분의 270 bp의 단편으로 membrane bound O-acyl transferase 유전자와 높은 상동성을 보였으며, 아미노산 배열에서 Arabidopsis, 벼의 membrane bound O-acyl transferase 유전자와의 상동성은 각각 86%, 80%로 나타났다.
- 파리지옥풀 leaf base, flower tissue 및 first trap leaf로부터 분리한 RNA와 XRITC으로 표식된 oligo-dT primer와 32개의 임의로 제작한 primer을 조합하여 FDD를 실시하여 signal를 검출한 결과 기관 특이적으로 존재하는 cDNA fragment들이 증폭되었다 (Figure 2).이들 중 leaf base 특이적인 band는 6개였으며, first trap leaf 특이적인 band는 17개로 나타났다.
후속연구
- TL2, TL6r TL10 및 TL14는 기내 배양 식물체 유래 first trap leaf에서는 발현되지 않는 반면, 3년생 실생주의 first trap leaf에서 만 특이적으로 발현 양상을 보였다 (Figure 5D). First trap leaf에서만 강한 signal를 보이는 DNA fragment는 5’RACE법으로 full length cDNA를 cloning하여 유전자의 구조 분석 및 세포 내에서 어떤 기능을 하는지를 조사한다면 식물 세포가 곤충의 몸체 내의 물질을 어떻게 분해시켜 흡수하는지에 대한 기초자료가 될 것으로 생각된다. 이와 같이 FDD pattern과 Northern blot 결과가 상이하게 나타난 이유로는 pseudo-transcripts 와 FDD-PCR의 증폭산물 양 차이로부터 일어날 가능성을 생각할 수 있다.
- 이와 같이 FDD에 의해 분리된 DNA들을 기존에 알려진 유전자와의 상동성으로 비교 검토하였다 식물세포가 어떻게 곤중세포를 분해시켜 양분을 흡수하는지를 이해하기 위해서는 지금까지 기능이 밝혀지지 않고 있는 9개 유전자에 대한 연구와 first trap leaf에서 의 역할 등에 대한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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