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제안 방법
- 05. 0.1, 0.5, 1, 2 mg/L NAA와 0.1, 0.5, 1 mg/L BAP의 조합으로 구성된 18처리의 MSA 고체배지 (2% sucrose)에서 3반복으로 배양하여 캘러스 발생 및 생장의 최적조건을 규명하였다.
- 2g을 유리시험관에 넣고 저온수조를 이용하여 상온에서 2℃ 까지 2시간 동안 하강하고, 2℃에서 -2℃까지 30분에 걸쳐 온도를 하강한 후, 조직의 결빙을 유도하기 위해 400mg의 얼음 조각을 넣었다. 2℃/30분의 속도로 -2℃에서 -8℃까지 수조의 온도를 내리면서 -2, -4, -6, -8℃에서 각각 sample을 채취하였다. 시험관에 3mL의 증류수를 넣고 90rpm에서 2시간 진탕하였다.
- 0025 gBrilliant Blue R)를 넣고 다시 분쇄하였다. 30초 간격으로 vortexing과 얼음에 두는 과정을 5회 반복한 후, Sonic dismem- brator (Fisher scientific사)로 초음파 분쇄하였다. 이후 30초 간격으로 vortexing과 얼음에 두는 과정을 5회 반복한 후 4℃, 13000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 회수하고 -20℃에 보관하였다.
- 잎, 줄기, 뿌리에서 유도된 CLP 또는 Dhn5 형 질전환 세포주를 각각 선택하여 NPTII 유전자의 도입을 확인하기 위해 PCR을 수행한 결과 형질전환 캘러스에서 700 bp의 예상된 크기의 PCR 산물을 확인하였다 (Figure 3A). CLP 와 £>加5의 PCR에서도 마찬가지로 형질 전환 캘러스에서 예상된 크기인 430 bp와 1760 bp의 증폭된 PCR 산물들을 확인하였다 (Figure 3B, C).
- Dhn5 형질전환 캘러스에서 내건성의 변화를 확인하기 위해 배지에 PEG를 0%에서 40%의 농도로 첨가하여 28일간 생장을 관찰하였다 (Figure5). 형질전환 캘러스는 모든 처리구에서 비형질전환 캘러스에 비해 생육이 증가하였다.
- 5 mg/L BAP) 액체배지에서 2일간 25℃ 암 조건에서 진탕배양하였다.Mg 배지에서 2일간 37℃ 암 조건으로 배양한 Agrobacterium 30 mL를 침전 후 20 mL MSA 액체 배지에 희석한 다음 A. adam两의 잎, 줄기, 뿌리 절편과 10분 간 암 조건에서 공동배양하였다. 이후 MSA 배지에서 3일간 25℃의 암 조건에서 80rpm으로 진탕배양한 후 20 m皿의 kanamycin이 포함된 MSA 고체배지 (0.
- 1985)으로 DNA를 추출하여 spec trophotometer (UV/Vis spectrophotometer, ATI Unicam사)로 정 량하였다. PCR primers는 OligoLite ver 6.35 (Molecular Biology Insights, Inc.)를 이용하여 3종의 유전자를 대상으로 primer [NPT Ⅱ (정방향 5 '-GAG GCT ATT CGG CTA TGA CTG-3', 역 방향 5'-ATC GGG AGC GGC GAT ACC GTA-3'), CZF(정 방 향 5'-CCG CCT ACC AGT TCC ATT-3', 역방향 5'-GCC AAG CAT GCC GCA GTA-3'), D/m5(정방향 5'-CCC GAG TGA GAG GAT CCG CGC AAG-3', 역 방향 5 '-CGG TGT GTG CAT GCTGCCCA-3')]를 설계하였다.
- PCR 반응은 NPTU 는 95℃ 에서 5분간 반응 후 95℃ 1분, 68℃ 1분, 72℃ 1분간 30회, CLP는 95℃ 5분간 반응 후, 95℃ 1분 55℃ 1분, 72℃ 1 분간 30회, Dhn5는 95℃ 1분, 63℃ 倦, 72℃ 1분간 30회 반복 실시하였다. 얻어진 PCR 산물은 1%TAE agarose gel을 이용하여 전기영동하였다.
- 고비사막 접경지역의 식물인 Artemisia adamsii의 내건성 및 내동성 증진을 위해 조직배양과 CLP 및。饥5 유전자의 형질 전환을 수행하였다. 다양한 호르몬 농도 조건에서의 성장을 확인한 결과, 0.
- 내건성을 측정하기 위해 동량의 캘러스 조직을 0, 10, 20, 30, 40%의 PEG가 포함된 MSA agar 배지에서 3반복으로 28일간 암 상태에서 배양하였다. 이후 캘러스의 생체중 및 건물중을 측정하여 스트레스 하에서 생장률로 상대적인 내건성을 비교 하였다.
- 도입된 유전자의 발현을 확인하기 위해 CLP 형질전환 캘러스의 전체 단백질을 대상으로 western 분석을 실시하였다. 동 보리 1호로부터 분리한 각 유전자를 E.
- 무균상태에서 발아하여 3주간 자란 유식물체를 MS 고체배지 (MS, hormone free, 3% sucrose)에서 12주간 생육시킨 후,잎, 줄기, 뿌리를 긱기 0.3 cm로 절단하여 MSA (MS, 2% sucrose, 0.05 mg/L NAA, 0.5 mg/L BAP) 액체배지에서 2일간 25℃ 암 조건에서 진탕배양하였다.Mg 배지에서 2일간 37℃ 암 조건으로 배양한 Agrobacterium 30 mL를 침전 후 20 mL MSA 액체 배지에 희석한 다음 A.
- 일차항체는 본 실험실에서 토끼로부터 제작한 CLP, Dhn5 항혈청을 1 : 10, 000의 비율로 이차항체는 anti-rabbitIgG-AP conjugate (PromegaA})> 1 : 7, 500의 비율로 TBST용액에 희석하여 사용하였다. 반응 후 AP system (NBT, BCIP; Promega사)을 사용하여 상온의 암 조건에서 발색반응을 진행하였다
- 3% Gelrite 고체배지에 치상하여 25℃ 암 조건에서 발아시켰다. 배축을0.5 cm로 절단하고 MS 고체배지 (5 mg/L 2.4-D, 3% sucrose)에 서 배양하여 캘러스를 유도하였고, 유도된 캘러스를 0.01, 0.05. 0.
- 시험관에 3mL의 증류수를 넣고 90rpm에서 2시간 진탕하였다. 세포 유출물은 Spectrophotometer (ATI Unicam사)를 이용하여 흡광도 (265 nm)를 측정하였다. 이후 시험관을 auto- clave(1.
- adamsii의 종자를 현지에서 직접 채집하였다. 실험실 내에서 전처리 없이 토양에서 발아시켜 식물을 유도하였고 실온, 8/16시간의 광/암 조건에서 재배하였다 (Figure 1). 종자를 70% EtOH에 30초간 4 회 표면살균 후, 멸균 증류수로 5회 수세한 다음 0.
- adam两의 잎, 줄기, 뿌리 절편과 10분 간 암 조건에서 공동배양하였다. 이후 MSA 배지에서 3일간 25℃의 암 조건에서 80rpm으로 진탕배양한 후 20 m皿의 kanamycin이 포함된 MSA 고체배지 (0.3% Gelrite)로 옮겨 형질전환 캘러스를 선발하였다.
- 세포 유출물은 Spectrophotometer (ATI Unicam사)를 이용하여 흡광도 (265 nm)를 측정하였다. 이후 시험관을 auto- clave(1.5기압, 20분)한 후 동일한 방법으로 흡광도 (265 nm) 를 측정하여 이를 100% 이온 유출로 보고, 저온처리 시 유출된 이온의 양을 상대적인 양으로 계산하여 캘러스 간의 가능한 차이를 보정하여 비교하였다.
- 내건성을 측정하기 위해 동량의 캘러스 조직을 0, 10, 20, 30, 40%의 PEG가 포함된 MSA agar 배지에서 3반복으로 28일간 암 상태에서 배양하였다. 이후 캘러스의 생체중 및 건물중을 측정하여 스트레스 하에서 생장률로 상대적인 내건성을 비교 하였다.
- 13% 의 형질전환율을 보여, 비형질전환 조직의 캘러스 유도와는 다르게 두 배지에서 모든 절편체로부터 일정 수준 이상의 캘러스 유도율을 확인하였다 (Table 3). 잎, 줄기, 뿌리에서 유도된 CLP 또는 Dhn5 형 질전환 세포주를 각각 선택하여 NPTII 유전자의 도입을 확인하기 위해 PCR을 수행한 결과 형질전환 캘러스에서 700 bp의 예상된 크기의 PCR 산물을 확인하였다 (Figure 3A). CLP 와 £>加5의 PCR에서도 마찬가지로 형질 전환 캘러스에서 예상된 크기인 430 bp와 1760 bp의 증폭된 PCR 산물들을 확인하였다 (Figure 3B, C).
대상 데이터
- 2(X)1 년 10월 몽골국립농과대학 B. Buyanchimeg 교수의 자문을 받아 몽골 고비사막에서 자생하는 A. adamsii의 종자를 현지에서 직접 채집하였다. 실험실 내에서 전처리 없이 토양에서 발아시켜 식물을 유도하였고 실온, 8/16시간의 광/암 조건에서 재배하였다 (Figure 1).
- 05% Tween 20)에 10분간 washing한 후, TBST에 5% nonfat dry milkz]- 포함된 용액으로 45분간 blocking하였다. 일차항체는 본 실험실에서 토끼로부터 제작한 CLP, Dhn5 항혈청을 1 : 10, 000의 비율로 이차항체는 anti-rabbitIgG-AP conjugate (PromegaA})> 1 : 7, 500의 비율로 TBST용액에 희석하여 사용하였다. 반응 후 AP system (NBT, BCIP; Promega사)을 사용하여 상온의 암 조건에서 발색반응을 진행하였다
이론/모형
- 0.2 g의 캘러스를 액체질소로 급속냉각한 후 마쇄하여 CTAB 방법 (Rogers et al. 1985)으로 DNA를 추출하여 spec trophotometer (UV/Vis spectrophotometer, ATI Unicam사)로 정 량하였다. PCR primers는 OligoLite ver 6.
- 내동성의 경우는 Park 등(2000)의 방법을 이용하여 캘러스 0.2g을 유리시험관에 넣고 저온수조를 이용하여 상온에서 2℃ 까지 2시간 동안 하강하고, 2℃에서 -2℃까지 30분에 걸쳐 온도를 하강한 후, 조직의 결빙을 유도하기 위해 400mg의 얼음 조각을 넣었다. 2℃/30분의 속도로 -2℃에서 -8℃까지 수조의 온도를 내리면서 -2, -4, -6, -8℃에서 각각 sample을 채취하였다.
- 황 등(2000)이 내동성이 강한 동보리 1호로부터 분리한 CLP 유전자와 Dhn5 유전자를 HindUl 와 Cla I, Sea I 과 Xho I 을 이용하여 절단 후 pGA748에 삽입하여 35S promoter와 NOS 3' terminator 사이에서 이들의 조절에 의해 발현하도록 하였고 (Figure 2), NPTn 유전자를 통해 형질전환체를 선발하였다. 재조합된 DNA/는 freeze-thaw 방법을 이용하여 Agrobac terium 効zc如s LBA4404에 도입하였다.
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