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제안 방법
- 이 용액에 포화 KI 용액 1 mL를 첨가하고 1분간 진탕 후 5분간 암소에서 방치한 다음 증류수 50 mL 및 1% 전분 지시 약을 2~3방울 첨가하고 0.01 N 博 0。3으로 적정하여 항산화활성을 구하였다.
- HPLC에서 최종 정제한 시료의 아미노산 서열 결정은 protein sequencer(Shimadzu PSQ-1 Protein Sequencer, Japan)를 사용하여 아미노산 서열을 분석하였다.
- 본 논문에서는 나타내지 않았지만 1차 HPLC 정제에서 peak 1은 5개(peak 1- A-E), peak 2는 9개(2-A-J)의 세부 분획을 나타내었다. 그 중 항산화활성이 높은 1-A 분획을 HPLC로 2차 정제하여 11개의 분획(「XI)을 얻었으며, 2-B는 9개의 분획 (ITX)을 나타내 었다(Fig. 4). 이 중 항산화활성이 높은 1- A-II분획은 HPLCS.
- 따라서 본 연구에서는 천연 숙성 멸치액젓의 숙성 기간별 생성되는 다양한 형태의 기능성 biocompound (pep- tide)를 분리 . 정 제하여 항암, 항산화 및 ACE 저해 효과를 분석하였으며, 또한 가장 시장성이 큰 숙성 5년 액젓 제품의 항산화물질의 구조를 분석하였다.
- 멸치액젓에 존재하는 항산화물질의 구조를 분석하기 위하여 숙성 5년 멸치액젓에서 Bio-RadP-2gtd로 분획한획분 중 항산화활성이 가장 높은 peak 1 및 2를 HPLC로 단계별로 정제하였으며, 그 중 대표적인 2차 HPLC 정제분석 결과를 Fig. 4에 나타내었다. 본 논문에서는 나타내지 않았지만 1차 HPLC 정제에서 peak 1은 5개(peak 1- A-E), peak 2는 9개(2-A-J)의 세부 분획을 나타내었다.
- 암세포 SNUT 은 100unit/mL의 penicillin- streptomycin 및 10% fatal bovine serum (FBS)이 함유된 RPMI 1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배 양하였다. 배양된 각각의 암세포는 일주일에 2~3회 배지를 교환해주며 75 mL cell culture flask에 5 mL씩 분할하여 주입하고 6~7일마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였다. 동물 세포에 대한 시료의 암세포 성장저해효과를 측정하기 위하여 Carmichael 등(4)의 방법에 따라 항암활성은 3-(4, 5- dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazoliumbromide 분석(MTT assay)방법으로 측정하였다.
- 분획된 액은 40℃에서 감압 농축한 다음 Bio-Rad P-2 gel을 충진 한 column (2.6x70 cm)에서 0.5 mL/min의 유속으로 용출하여 280nm에서 흡광도를 측정하였다 흡광계의 흡광도를 초과하는 농도의 fractione 증류수로 희 석하여 흡광도를 측정한 다음 희석배수를 곱하여 농도를 표시하였다. 최대 흡광도의 50% 이상의 fraction을 pooling 하여 실험에 사용하였다.
- Blank는 시료용액 대신 증류수 5 mL를 사용하였다. 실온에서 2시간 반응시킨 후 545 nm에 서 흡광도를 측정하여 peptide-nitrogen 함량을 구하였다.
- 아미노산(glutamic acid 및 lysine) 함량은 표준품(Sigma Co., St. Louis, MO, USA)으로 측정한 표준곡선(농도 vs 항산화활성)으로부터 구하였다.
- 3) 200 uL를 사용하였다. 여기에 0.3 M NaCl을 함유하는 0.1 M sodium borate buffer(pH 8.3)에 기질인 hippury-L-histidyl-L- leucine(HHL) 0.5 M을 녹인 용액 200 虬을 혼합하여 37℃ 에 서 30분간 반응시 키 고 1 N HC1 25011L를 가하여 반응을 중지 시킨 뒤 2 mL의 ethylacetate 층으로부터 용매를 증류 시 킨 잔사에 1 M NaCl 3 mL를 첨가하여 추출된 hi* ppuric acid 농도를 228 nm에서 흡광도를 측정하여 ACE 저해활성을 계산하였다.
- 5x 250 mm, Shiseido, Japan)으로 다음과 같은 분리조건으로 정제하였다. 용매, 유속, 파장은 1차 정제와 동일하며, B 용액의 농도구배는 0— 15%(45min)로 하였다. 2차 정제에 서 활성이 나타난 peak를 다시 Capcell Pak Ciscolumn (4.
- 여 기 에 5 mg/mL MTT용액 20 UL 를 첨가하고 다시 상기와 같은 조건에서 4시간 더 배양하였다. 이것을 원심분리(&000xg, 10 min)하여 상 등 액을 제 거하고 각 well당 dimethylsulfoxide( DMSO) 150 虬를가하여 30분간 교반한 후 ELISA reader로 550 nm에서 흡광도를 측정하여 항암활성을 구하였다.
- 분리 . 정 제하여 항암, 항산화 및 ACE 저해 효과를 분석하였으며, 또한 가장 시장성이 큰 숙성 5년 액젓 제품의 항산화물질의 구조를 분석하였다.
- 정제하였으며, 분리조건은 다음과 같다. 즉, A 용매: 0.1% TFA 를 포함하는 H2O(pH 2.2), B 용매 : 0.1% TFA를 포함하는 100% CH3CN, B 용액의 농도구배: 0—20%(40min), 유속: 2.0 mL/min, 파장: 220 nm, 온도: 40℃로 분획하였다. 활성을 나타낸 peak는 다시 Capcell Pak Cis column(7.
- 지표로 삼았다. 즉, methan이로 농도를 조정 한시료 4 mL를 취하고, 0.15mM DPPH 1 mL와 혼합하여 실온에서 30분간 방치한 다음 520nm에서 흡광도를 측정하여, DPPH radical 소거활성 [Reduction of DPPH(%) = (시료 처리구의 흡광도 /대조구의 흡광도)乂 100]을 구하였다.
- 측정하였다. 즉, 시료를 두 개의 시험관에 각각 0.5 mL씩 취하고 증류수 4.5 mL씩을 가한 다음, 한 시험관에는 biuret 시약 1(0.4% CuSO4, 8% NaOH, 0.2% glycerin)를 5 mL 첨가하여 A 반응구로, 다른 시 험관에는 biuret 11(8% NaOH, 0.2% glycerin) 5 mL를 첨가하여 B 반응구로 하였다. Blank는 시료용액 대신 증류수 5 mL를 사용하였다.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용된 액젓 시료는 풍미식품(속초)에서 제조된 멸치액젓 제품으로 멸치 20 ton에 중량당 30%의 식염을 가하여 15±3"C에서 각각 1, 3 및 5년 숙성한 것을 실험의 시료로 사용하였다. 숙성 동안 숙성 tank 상부로 모여지는 기름은 주기적으로 제거하였으며, 숙성 1년 후에는 잔사를 제거한 멸치액젓을 별도의 tank로 옮겨 숙성하였다.
- 숙성 동안 숙성 tank 상부로 모여지는 기름은 주기적으로 제거하였으며, 숙성 1년 후에는 잔사를 제거한 멸치액젓을 별도의 tank로 옮겨 숙성하였다. Biocompound 정제에 사용된 수지는 Bio-Rad P-2 gel (Bio-Rad Co., California, USA)를 사용하였으며 , 항산화 작용 측정용 지방산은 linoleic acid (Sigma Chemical Co., St Louis, MO)이며 실험에 사용된 나머지 시약은 모두 특급을 사용하였다.
- In vitro 항암실험을 위해 사용된 암세포주는 인체에서 유래한 SNU-1(서울대학교, 한국)이며 한국세포주은행 (서울, 한국어】서 구입하여 실험에 사용하였다. 암세포 SNUT 은 100unit/mL의 penicillin- streptomycin 및 10% fatal bovine serum (FBS)이 함유된 RPMI 1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배 양하였다.
- 0 mL/min으로 하였다. 정제에 사용한 HPLC는 Waters Model 486 (Waters Associates, Miliford, MA, USA)을 사용하였으며 HPLC-grade용 water와 acetonitrilee TEDIA Co. (Ohio, USA) 제품을 사용하였다.
이론/모형
- Linoleic acid를 사용하여 Hayase and Kato 방법 (5) 으로 측정하였다. 즉 linoleic acid 1 g를 ethanol 20 mL에 용해하고 일정 농도로 조정된 시료 1 mL 및 0.
- Peptide-nitrogen 함량의 측정은 Umemoto의 개량 biuret법(40)으로 측정하였다. 즉, 시료를 두 개의 시험관에 각각 0.
- 배양된 각각의 암세포는 일주일에 2~3회 배지를 교환해주며 75 mL cell culture flask에 5 mL씩 분할하여 주입하고 6~7일마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였다. 동물 세포에 대한 시료의 암세포 성장저해효과를 측정하기 위하여 Carmichael 등(4)의 방법에 따라 항암활성은 3-(4, 5- dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazoliumbromide 분석(MTT assay)방법으로 측정하였다. 즉, 동물세포를 96 well plate에 1 x 104 cell/well이 되 게끔 분주하고 일정 농도의 시료 20 虬를 첨가하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 96시간 배 양하였다.
- 시료의 NaCI 함량 측정은 Mohr 법(41)으로 측정하였다.
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