[논문]클로렐라 가수분해물의 생리활성 분석

강민숙; 채희정

문제 정의

In vitro 항균 실험에서 클로렐라 농도에 따라 장내 유해균의 발육저해 경향이 높아짐이 보고[12, 25]된 바 있음에 먼저 항균 활성을 분석하였다. 본 연구에서는 이와 유사한 효과가 클로렐라 가수분해물에도 있는 지를 검토하기 위하여 G(+)균으로는 B. subtillis ATCC₆₆33을, G(-) 균으로는 E. coli K112를 시험 균주로 하여 항균력을 테스트하였다. 실험 방법으로는 paper disc assay를 사용하였다.
미백제로 사용되는 화학약품의 부작용 유발로 인해 천연물을 이용한 미백제를 개발하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 본 연구에서는 클로렐라 가수분해물의 미백기능을 tyrosinase 활성법에 기반하여 정량적인 분석을 수행하였다.
본 연구에서는 클로렐라의 폐암에 대한 항암 생리활성과 미백 기능성을 확인하였다. 클로렐라 추출물을 trypsin으로 가수분해하여 얻은 Chlorella hydrolysate는 B.
연구되고 있다[16-20]. 클로렐라도 항암 및 면역기능 활성화에 기여한다는 보고[11, 21]가 있으며 본 연구에서는 클로렐라 추출물의 효소적 가수분해물이 항암 활성을 갖고 있는지에 대하여 조사하였다.
이러한 클로렐라 추출물의 세포 부활작용으로 클로렐라 추출물이 화장품 원료로 많이 사용된다[12]. 화장품의 원료로 세포부활기능 외에 미백의 활성을 알아보고자 하였다. 본 연구에서는 melanin 색소의 생합성 과정에서 tyrosinase가 dopa를 기질로 하여 초기 반응의 주요 과정을 촉매한다는 점에서 그 효소 활성의 저해도를 측정하는 검사법을 사용하였다.

제안 방법

따라서, 클로렐라의 세포 내에 있는 여러 가지 생리활성 물질을 수집하기 위하여 EDTA와 증류수를 이용하여 세포막을 느슨하게 하였으며, 세포 밖으로 유도된 활성 물질을 인체 내의 단백질 분해효소인 trypsin으로 분해하여 클로렐라의 가수분해물을 생리활성 분석과 분리정제의 출발물질로 이용하였다. In vitro 항균 실험에서 클로렐라 농도에 따라 장내 유해균의 발육저해 경향이 높아짐이 보고[12, 25]된 바 있음에 먼저 항균 활성을 분석하였다. 본 연구에서는 이와 유사한 효과가 클로렐라 가수분해물에도 있는 지를 검토하기 위하여 G(+)균으로는 B.
그 위에 시료 30)1僵 멸균된 paper disc에 점적하고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. Paper disc 주위의 투명환(clear zone) 크기에 따라 항균 활성을 확인하였다.
건조 분말상태의 클로렐라를 3차 증류수와 혼합하여 10%(w/v)의 현탁액 (200 ml)을 조제하고 0.5%(w/v)의 EDTA를 첨가하였다. 클로렐라 현탁액을 충분히 교반한 후, 얼음에 담그어 15초간 1분 간격으로 초음파 처리를 3회 반복하여 막을 파쇄하였고, 4℃에서 24시간 진탕교반한 후, 30분간 원심분리 (4℃, 3, 000 xg)하여 상등액을 얻었다.
단백질계 생리 활성 소재는 in 에서 생리활성을 보일지라도 체내의 단백질 분해효소에 의해 그 활성을 잃을 수 있으므로 체내의 효소에 의해 미리 가수분해를 한 다음 얻어지는 가수분해물에서 생리활성 물질을 탐색하는 것이 바람직하다. 따라서, 클로렐라의 세포 내에 있는 여러 가지 생리활성 물질을 수집하기 위하여 EDTA와 증류수를 이용하여 세포막을 느슨하게 하였으며, 세포 밖으로 유도된 활성 물질을 인체 내의 단백질 분해효소인 trypsin으로 분해하여 클로렐라의 가수분해물을 생리활성 분석과 분리정제의 출발물질로 이용하였다. In vitro 항균 실험에서 클로렐라 농도에 따라 장내 유해균의 발육저해 경향이 높아짐이 보고[12, 25]된 바 있음에 먼저 항균 활성을 분석하였다.
화장품의 원료로 세포부활기능 외에 미백의 활성을 알아보고자 하였다. 본 연구에서는 melanin 색소의 생합성 과정에서 tyrosinase가 dopa를 기질로 하여 초기 반응의 주요 과정을 촉매한다는 점에서 그 효소 활성의 저해도를 측정하는 검사법을 사용하였다. 현재 화장품 시장에서 가장 두드러진 성장을 보이는 미백 화장품의 원료로 arbutin, korgic acid 및 cysteine0] 가장 많이 사용되고 있다.
현재 화장품 시장에서 가장 두드러진 성장을 보이는 미백 화장품의 원료로 arbutin, korgic acid 및 cysteine0] 가장 많이 사용되고 있다. 본 연구에서는 양성 대조군으로 이 3가지 정제된 미백활성 물질을 갖고 tyrosinase 활성 저해율을 측정하였다. 실험결과 정제된 korgic acid와 cysteinee 농도가 0.
클로렐라 현탁액을 충분히 교반한 후, 얼음에 담그어 15초간 1분 간격으로 초음파 처리를 3회 반복하여 막을 파쇄하였고, 4℃에서 24시간 진탕교반한 후, 30분간 원심분리 (4℃, 3, 000 xg)하여 상등액을 얻었다. 상등액인 클로렐라 추출물(Chlorella extract, CE)에 체내 단백질분해효소인 pancreas trypsin (6.0 S saltfree, Novo Nordisk, Denmark)을 0.2%(w/v) 첨가하여 항온수조에서 38℃로 12시간 진탕하였다. 가수분해 후 90P에서 3분간 열처리하여 효소반응을 정지시켰다.
정량적으로 분석하였다. 암세포의 생존율은 MTT(3-[4, 5-Dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyl-tetra-zolium bromide)< 이용하여 570 nm에서 흡광도로 분석 [24] 하였으며, MTT 용액은 phosphate buffered saline(PBS) 0.1 %에 2 mg/ml의 농도로 MTT를 용해 한 것을 사용하였다.
coli K112< 항균 시험균주로 사용하였다. 우선 NA배지 (nutrient agar: enzymatic digest of gelatin 5 g, beef extract 3 g, agar 15 g, per liter, pH 6.8)를 한천(agar)을 제외한 액체배지와 한천을 포함하는 고체배지로 만들어 액체배지 200 ml에 두 가지 균을 각각 1 ml씩 첨가한 후 37℃에서 24시간 동안 진탕 배양하였다. 배양된 균을 미리 준비해 둔 고체배지에 200 以씩 도말하였다.
지금까지의 클로렐라와 관련된 연구는 클로렐라의 열수 추출물(hot water extract)을 이용하였으나, 본 연구에서는 클로렐라 가수분해물을 이용하여 클로렐라의 여러 가지 생리활성 중 항균, 미백, 항암 활성을 검토하였다.
한국세포주은행에서 분양받은 폐암세포 A-549를 이용하여 96-well plate에서 항암 물질로 알려진 indole-3-carbinol[23]을 대조구를 사용하고 trypsin 가수분해물 및 여러가지 크로마토그래피 분획을 이용하여 항암 활성을 정량적으로 분석하였다. 암세포의 생존율은 MTT(3-[4, 5-Dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyl-tetra-zolium bromide)< 이용하여 570 nm에서 흡광도로 분석 [24] 하였으며, MTT 용액은 phosphate buffered saline(PBS) 0.

대상 데이터

Ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)는 Sigma Chemical Co.(St. Louis, US A)로부터 구입하였고, L-3, 4-dihydroxy-phenylanine(L-dopa)은 Across Organics (Japan)에서 구입하여 사용하였다. 다른 시약들은 일급시약을 사용했으며, B.
Gram (+)균과 Gram (-)균으로 각각 B. subtillis ATCC6633과 E. coli K112< 항균 시험균주로 사용하였다. 우선 NA배지 (nutrient agar: enzymatic digest of gelatin 5 g, beef extract 3 g, agar 15 g, per liter, pH 6.
Louis, US A)로부터 구입하였고, L-3, 4-dihydroxy-phenylanine(L-dopa)은 Across Organics (Japan)에서 구입하여 사용하였다. 다른 시약들은 일급시약을 사용했으며, B. subtillis ATCC 6633과 E. coli K112은 한국미생물보존센터 (KCCM)에서 분양받아 사용하였다.
본 연구에서 사용한 원료인 클로렐라는 단백질 함량이 약 60%로 생리활성을 나타낼 수 있는 여러 성분 중에서도 단백질 계열의 물질에 주목하였다. 단백질계 생리 활성 소재는 in 에서 생리활성을 보일지라도 체내의 단백질 분해효소에 의해 그 활성을 잃을 수 있으므로 체내의 효소에 의해 미리 가수분해를 한 다음 얻어지는 가수분해물에서 생리활성 물질을 탐색하는 것이 바람직하다.
실험재료로 사용한 클로렐라(C况ore% sp.) 원말 분말은 대상(주) 군산공장(한국)으로부터 제공받았으며 trypsine Novo Nordisk사(Denmark) 제품을 사용하였 匸}. Ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)는 Sigma Chemical Co.
가수분해 후 90P에서 3분간 열처리하여 효소반응을 정지시켰다. 이 클로렐라 가수분해물(CMv히Za hydrolysate, CH)을 생리활성분석 및 분리정제 실험의 시작물질로서 사용하였으며, 고형분 농도는 굴절계 (Tokyo Co., Japan)# 이용하여 측정하였다.

데이터처리

모든 활성 분석 실험에서는 각 시료별로 3회 반복 실험하였고, 이를 평균 ± 표준오차(mean ± standard error)로 그래프에 표시하였다.

이론/모형

coli K112를 시험 균주로 하여 항균력을 테스트하였다. 실험 방법으로는 paper disc assay를 사용하였다. 실험 결과, B.

성능/효과

3은 클로렐라 가수분해물(CH)의 고형분 농도별 항암 활성을 MTT법으로 분석한 결과이다. Fig. 3에서 보는 바와 같이 , Tris-HCl 완충액의 72 시간에서의 OD 값을 기준으로 백분율로 환산한 결과 0.15%의 클로렐라 가수분해물(CH)은 88.2%의 높은 억제율을 보였으며 클로렐라 가수분해물이 in Wg에서 인체 폐암 세포인 A-549의 증식을 억제시키는 작용이 있는 것으로 나타났다. 보고에 의하면 클로렐라로부터 분리된 이ycerogiycolipid인 monogalactosyl diacylgycerol의 일종이 종양을 억제한다고 한다[4].
1). 비교적 높지 않은 항균력을 보이는 것으로 확인되었다.
실험 방법으로는 paper disc assay를 사용하였다. 실험 결과, B. su버illis와 E. c湖에서 l~2mm의 투명 환이 확인되었다(Fig. 1). 비교적 높지 않은 항균력을 보이는 것으로 확인되었다.
본 연구에서는 양성 대조군으로 이 3가지 정제된 미백활성 물질을 갖고 tyrosinase 활성 저해율을 측정하였다. 실험결과 정제된 korgic acid와 cysteinee 농도가 0.2mg/ml 정도만 되어도 100 %에 가까운 저해율을 보였다(데이터 제시 생략). 클로렐라 가수분해 추출물의 농도에 따른 tyrosinase 저해 활성을 측정한 결과는 Fig.
미백 기능성을 확인하였다. 클로렐라 추출물을 trypsin으로 가수분해하여 얻은 Chlorella hydrolysate는 B. subtillis ATCC₆₆33와 E. coli KI 12에 대하여 항균 활성을 보이지 않았으나 tyrosinase inhibition assay를 이용한 미백활성 분석 결과 IC₅O(50% inhibitory concentration)0] 12%이었고 인체 폐암세포인 A-549에 대한 항암활성 분석에서는 0.15%의 농도에서 88.2%의 높은 폐암세포 증식 저지율을 보였다.
2와 같다. 클로렐라의 tyrosinase 활성 IC₅o (50% inhibitory concentration)은 약 12%로 나타났다. Kim 등[28]의 연구에서 얻은 녹차 추출물의 IC50 값은 2000mg/ml임에 비하여 높은 활성을 보였지만, Lee 등[29]의 연구에서 박태기나무 잎 추출물의 IGo 값이 20-50mg/ml인 것에 비하면 낮은 활성을 보이고 있다.

후속연구

Kim 등[28]의 연구에서 얻은 녹차 추출물의 IC50 값은 2000mg/ml임에 비하여 높은 활성을 보였지만, Lee 등[29]의 연구에서 박태기나무 잎 추출물의 IGo 값이 20-50mg/ml인 것에 비하면 낮은 활성을 보이고 있다. 분리되지 않은 물질인 것을 감안한다면 향후 추가 분리 정제 공정을 통하여 우수한 미백 기능성 소재의 발굴이 가능할 것으로 판단된다.
보고에 의하면 클로렐라로부터 분리된 이ycerogiycolipid인 monogalactosyl diacylgycerol의 일종이 종양을 억제한다고 한다[4]. 클로렐라의 제암 효과로서 암의 면역 성립에 주요한 역할을 하는 helper-T 세포를 강하게 활성화하는 실험결과가 보고된 바 있다[30, 31], 위의 결과들로 미루어 클로렐라는 면역계를 활성화하여 암전이 억제효과를 나타내므로 항암보조제로 중요한 역할을 할 것으로 기대된다[21, 32-34], 또한 클로렐라 추출물은 마크로파아지의 interleukin과 interferon mRNA 발현수준을 올리고 L. monocytogenes 김.염 후 MAIDS (murine retrovirus induced aguired immunodeficiency syndrome)를 갖는 쥐와 정상 쥐의 비장 기능을 향상시킨다고 보고되어 있다[10].

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