[논문]노랑하늘타리 추출물의 HL-60 혈액종양세포 Apoptosis 유도 효과

김상철; 박수영; 현재희; 이영기; 박덕배; 강사윤; 유은숙; 강희경

문제 정의

p data-page="1">천연물에는 항종양 효과를 비롯하여 다양한 생리활성을 나타내는 물질들이 포함되어 있으며, 이들 생리활성 물질의 작용기전에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다*3)이에 본 연구자 등은 천연물 유래의 물질을 이용하여 항암제를 개발하려는 노력의 일환 으로 제주에 자생하는 식물체들의 항암 효과를 검색하였다. 4" 그 결과, 특히 제주도의 산이나 들에 자생하는 노랑하늘타리의 잎이 혈액 종양 세포의 성장을 현저히 억제함을 확인하였다 空랑하늘타리는 우리나라 남부지방(제주도 .
& 이처럼 노랑하늘타리의 뿌리와 열매가 민간에서 오랫동안 사용되고 있으나, 노랑하늘타리의 각 부위별 성분 및 항종양 효과에 대한 연구는 매우 미흡하다.服) 본 연구에서는 노랑하늘타리의 잎을 비롯하여 부위별로 항종양 효과를 조사하여, 노랑하늘타리의성분을 암 치료제로 이용할 수 있는 근거를 마련하고자 하였다. 항종양 효과는 HL-60(급성 전골수성 백혈병세포)를 사용하여 노랑하늘타리의 각 부위별 추출물 처리에 의하여 HL-60 세포의 성장을 억제하는 효과가 있는가를 검색하여 알아보았으며, 노랑하늘타리의 HL-60 세포 성장 억제 효과가 apoptosis유도에 의한 것인지 그 기전을 조사하였다.
服) 본 연구에서는 노랑하늘타리의 잎을 비롯하여 부위별로 항종양 효과를 조사하여, 노랑하늘타리의성분을 암 치료제로 이용할 수 있는 근거를 마련하고자 하였다. 항종양 효과는 HL-60(급성 전골수성 백혈병세포)를 사용하여 노랑하늘타리의 각 부위별 추출물 처리에 의하여 HL-60 세포의 성장을 억제하는 효과가 있는가를 검색하여 알아보았으며, 노랑하늘타리의 HL-60 세포 성장 억제 효과가 apoptosis유도에 의한 것인지 그 기전을 조사하였다.
본 연구에서는 급성 전골수성 백혈병 세포주인 HL-60 세포를 이용하여 노랑하늘타리의 각 부위별 메탄올 추출물과 잎의 용매분획물이 HL-60 세포의 성장을 억제하는지 조사하고, 세포 성장 억제작용이 apoptosis 유도에 의한 것인지 알아보았다. 노랑 하늘타리에 의한 HL-60 백혈병 세포의 성장 억제 효과는 tetrx olium salt의 하나인 MTT를 사용하여 MTT의 환원에 의해 생성되는 formazan의 흡광도로 측정하였다.
그리고 노랑하늘타리의 뿌리, 잎, 줄기 및 과피 메탄올 추출물을 각각 10|ig/m/, 10ng/m/, 50 μg/m/ 및 100 μg/m/ 이상의 농도로 처리하였을 때 HL-60 세포 성장이 현저히 억제되었다(Table I). 이와 같은 노랑하늘타리의 HL-60 세포의 성장에 대한 억제 효과가 apoptosis 유도에 의한 것인지 알아보았다. Apoptosis는 세포질내 칼슘치가 증가 되 칼슘의존성 endonuclease가 활성화되어 핵내 DNA 분절이 일어나며, transglutaminase가 활성화되어 세포질내 단백질의 cross-linking이 일어나며 세포질 농축이 일어나고 수액이 세포 밖으로 빠져나가면서 apoptotic bodies를 형성하는 것으로 알려져 왔다.

제안 방법

갈아 미세말로 하였다. 잎(312 g), 줄기 (45 g), 뿌리 (42 g), 과피 (31g), 씨 (35 g)의 미세말 시료에 80% 메탄올을 시료무게의 3배에 해당하는 양을 가한 후 상온에서 24시간 동안 교반 하였으며, 진공여과에 의해 상층액을 회수하였다. 이 과정을 3회 반복하여 상층액을 모으고 감압농축하여 노랑하늘타리의 각 부위별 메탄올 추출물로 사용하였다.
이 과정을 3회 반복하여 상층액을 모으고 감압농축하여 노랑하늘타리의 각 부위별 메탄올 추출물로 사용하였다. 그리고 노랑하늘타리 잎의 메탄올 주줄 물 44.89 g을 증류수 卩에 현탁시킨 후에 헥산(1冰3), 에틸아세테이트(1冰3), 부탄올(1以3)로 순차적으로 추출하였으며, 각각의 분획물을 진공 건조하여, 노랑하늘타리 잎의 용매 분획물로 사용하였다(Fig. 1).
이용하였다.'" HL-60 세포(2.5X 10%旬)를 95 well plate 의 각 well에 넣고, 노랑하늘타리의 각 부위별 메탄올 추출물 또는 잎의 용매 분획물을 농도별로 첨가하였다. 이를 4일간 배양한 다음, MTT(Sigma) 100 瞎을 첨가하고 4시간 동안 더 배양하였다.
INC) 를사용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 성장 억제 정도를 조사하였다.
5x10%m)에 노랑하늘타리의 각 부위별 메탄올 추출물 또는 잎의 용매 분획물을 처리한 다음 24시간 동안 배양하였다. 세포를 수집 한 후 Promega Wizard® Genomic DNA Purification Kit를 사용하여 DNA> 분리하였다. 분리한 DNA를 1.
세포를 수집 한 후 Promega Wizard® Genomic DNA Purification Kit를 사용하여 DNA> 분리하였다. 분리한 DNA를 1.5% agarose gel에서 30분(100 V) 동안 전기영동을 한 다음 ethidium bromide로 염색하고 UV transilluminator同에서 DNA 단편화 현상을 관찰하였다
5X 1()5/购에 노랑하늘타리의 각 부위별 메탄올 추출물 또는 잎의 용매 분획물을 처리한 다음 24시간 동안 배양한 후, HL-60 세포를 수확하여 phosphate buffered saline(PBS, Sigma)로 세척하였다. HL-60 세포를 -20°C에서 70% 에탄올로 30 분 동안 고정시킨 후, PBS로 세척하고, RNase A(1 m以mZ)를 처리한 다음에 propidium iodide(PI, Sigma)로 염색하고, COULTER® EPICS®XL™ Flow Cytometer(BECKMAN COULTER)로 세포주기를 분석하였다.⑵
1% Tween 20) 용액을 이용하였으며, 상온에서 2시간 동안 실시하였다. Poly(ADP-ribose) polymerase(PARP)의 발현 양을 검토하기 위한 항체로 anti-FARP(l: 1000)(Santa-Cruz)와 caspase- 35] 활성형 발현을 검토하기 위한 항체로 cleaved caspase-3 Ab (1:1000)(Cell Signaling)를 TTBS 용액으로 희석하여 사용하였으며, 반응은 상온에서 2시간 동안 진행하였다. 2차 항체로는 Horseradish Peroxidase(HRP) 가 결합된 anti-rabbit IgG (Amersham Co.
Poly(ADP-ribose) polymerase(PARP)의 발현 양을 검토하기 위한 항체로 anti-FARP(l: 1000)(Santa-Cruz)와 caspase- 35] 활성형 발현을 검토하기 위한 항체로 cleaved caspase-3 Ab (1:1000)(Cell Signaling)를 TTBS 용액으로 희석하여 사용하였으며, 반응은 상온에서 2시간 동안 진행하였다. 2차 항체로는 Horseradish Peroxidase(HRP) 가 결합된 anti-rabbit IgG (Amersham Co.)를 1: 5000으로 희석하여 이용하였으며 , 반응은 상온에서 30분 동안 진행하였다. 그 후 membrane을 TTBS로 3 회 세정하여 ECL 기질(Amersham Co.
노랑하늘타리의 각 부위별 메탄올 추출물 및 잎의 용매 분획물의 HL-60 세포의 성장 억제에 대한 효과는 tetrazolium salt의하나이 MTT를 사용하여 MTT2] 환원에 의해 생성되는 formazan 의 흩-낭드로 측정하였다.1°) 노랑하늘타리 잎의 메탄올 추출물을 100 黑;/血의 농도 처리시의 세포 성장 억제 효과는 약 43%로 나타났。며, 헥산 분획물에서 19.
노랑하늘타리 추출물에 의한 HL-60 세포 성장 억제 작용이 apoptosis 유도에 의한 것인지 그 기전을 알아보기 위하여, apoptosis 유도에 의하여 나타나는 DNA 단편화 현상을 전기영동으로 관찰하였다. 노랑하늘타리 잎의 용매 분획물을 HL-60 세포에 각각 lOOpg/m/ 농도로 24시간 동안 처리흐)였을 때, 에틸아세테이트 분획물에서 뚜렷한 DNA단편화 현상을 볼 수 있었다(Fig.
3-H). 또한, 노랑하늘타리 추출물에 의한 apoptosis 유도에 의하여 sub-Gl hypodiploid 세포가 증가하는지 DNA에 결합하여 형광을 나타내는 물질인 PI를 처리하여 유세포분석기로 분석하였다. 노랑하늘타리 잎의 에틸아세테이트 분획물을 100卩以血의 농도로 처리하여 시간별토 측정한 결과, sub-Gl hypodiploid 세포가 3시간에서 13.
4). HL-60 세포에 노랑하늘타리의 각 부위별 추출물을 10ng/m/, 50ng/m/, lOOng/m/ 의 농도로 24시간 처리한 후 단백질을 분리하여 effector caspase 의 하나인 caspase-3의 활성형 발현이 증가하는지 조사하였으며, caspase-3의 활성화에 의하여 caspase 기질의 하나인 PARP가 분해되는지 확인하여 노랑하늘타리의 각 부위별 메탄올 추출물 및 잎의 용매 분획물의 HL-60 세포 성장 억제 효과가 apoptosis 유도에 의한 것인지를 알아보았다. 노랑하늘타리 잎의 에틸아세테이트 용매 분획물을 50卩以m/ 이상의 농도로 처리하였을 때 caspase・3의 활성형 (19kDa)의 밴드가 나타났으며 , 이는 caspase-3의 활성화에 의하여 기질인 PARP(116kDa)가 절단되어 85kDa 의 낸드가 나타나는 농도와 거의 일치함을 보였다(Fig.
노랑 하늘타리에 의한 HL-60 백혈병 세포의 성장 억제 효과는 tetrx olium salt의 하나인 MTT를 사용하여 MTT의 환원에 의해 생성되는 formazan의 흡광도로 측정하였다. 그 결과, 노랑하늘타리 잎의 에틸아세테이트와 부탄올 분획물 100 ng/m/ 농도에서 세포 성장 억제 효과가 가장 높게 나타났다(Fig.
노랑하늘타리의 각 부위별 메탄올 추출물에서는 특히 줄기의 메탄올 추출물에서 DNA 단편화 현상을 가장 뚜렷하게 관찰할 수 있었다. 그리고 DNA에 결합하여 형광을 나타내는 물질인 #를 이용하여 노랑하늘타리 추출물의 처리에 의한 apoptotic 세포 즉 sub-Gl hypodiploid 세포의 증가를 유세포분석기로 확인하였다. 그 결과 노랑하늘타리 잎의 에틸아세테이트 분획물의 처리에 의하여 시간 의존적으로 apoptotic 세포가 증가되는 것을 관찰할 수 있었다(Rble II).

대상 데이터

노랑하늘타리 부위별 추출물의 제조

제주도에 자생하고 있는 노랑하늘타리의 잎, 줄기, 뿌리, 과피 및 씨를 각각 2001년 5월에 월평지역에서 채집하여 음건한 다음마쇄기로 갈아 미세말로 하였다. 잎(312 g), 줄기 (45 g), 뿌리 (42 g), 과피 (31g), 씨 (35 g)의 미세말 시료에 80% 메탄올을 시료무게의 3배에 해당하는 양을 가한 후 상온에서 24시간 동안 교반 하였으며, 진공여과에 의해 상층액을 회수하였다.
급성 전골수성 백혈병 환자에서 유래한 HL-60 세포주를 한국 세포주 은행 (KCLB)으로부터 분양 받아 100units/m/의 penicil- lin-streptomycin(GIBCO) 과 10%의 fetal bovine serum(FBS, GIBCO)가 함유된 RPMI 1640 배지 (GIBCO)를 사용하여 37°C, 5% CO₂ 항온기에서 배양하였으며, 계대 배양은 3~4일에 한 번씩 시행하였다.
Results are expressed as the percentage inhibition that produced a reduction in the absorbance in the treated cells compared to the untreated controls. All the experiments were performed in triplicate. The data is presented as a mean±SD.

이론/모형

노랑하늘타리의 추출물 처리에 의한 HL-60 세포 독성 측정은 3-(4, 5-dimehtylthiazol)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) assay를 이용하였다.'" HL-60 세포(2.
세포를 2〜3회 PBS로 서】척 후, 500 W의 lysis buffer를 첨가하여 1시간 동안 lysis 시킨 후 14, 000rpm에서 20분간 원심 분리하여 세포막 성분 등을 제거하였다. 단백질 농도는 Bradford 방법을 이용하여 정량 하였다.'泌 40 |ig의 lysate를 10% mini gel SDS-PAGE(Polyacrylamide Gel Electrophoresis) 로변성 분리하여, 이를 polyvinylidene fluoride(PVDF) membrane (BIO-RAD)에 200 mA로 2시간 동안 transfer하였다.

성능/효과

p data-page="1">천연물에는 항종양 효과를 비롯하여 다양한 생리활성을 나타내는 물질들이 포함되어 있으며, 이들 생리활성 물질의 작용기전에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다*3)이에 본 연구자 등은 천연물 유래의 물질을 이용하여 항암제를 개발하려는 노력의 일환 으로 제주에 자생하는 식물체들의 항암 효과를 검색하였다. 4" 그 결과, 특히 제주도의 산이나 들에 자생하는 노랑하늘타리의 잎이 혈액 종양 세포의 성장을 현저히 억제함을 확인하였다 空랑하늘타리는 우리나라 남부지방(제주도 . 흑산도 등 남부 다도해 섬 지방)과 중부지방의 구릉지나 숲 가장자리에 자생하는 다년생 초본이다. 그 뿌리에서 전분을 빼내어 식용으로 쓰며, 한방에서는 열매와 뿌리를 타박상 .
2-1). 그 중 억제 효과가 가장 높게 나타났던 에틸아세테이 三 분획물을 농도별로 처리하였을 때, 10ng/m/ 농도에서 8.6% , 25 |ig/m/ 농도에서 24.3%, 50 卩g/m;과 100 卩以m/의 농도에서 牛 70% 이상의 세포 성장 억제 효과를 보였다. 이때 노랑 하늘 匕■리 잎의 에틸아세테이트 분획물의 HL-60 세포 성장 억제에 디 한 IC”은 36.
그리고 노랑하늘타리의 平리, 줄기 , 씨 및 과피의 메탄올 추출물을 10 卩g/m/, 25 |回 ml, iOgg/m/, 또는 100|ig/m/의 농도로 처리한 결과, 뿌리는 10 |妇 mi. 줄기는 50 |ig/m/, 씨는 10 gg/m/, 과피는 100 昭向 농도 c I 싱게서 62.9%, 88.2%, 88.4%, 45.7%로 세포 성장 억제 효과를 보-였다(Eble I). 이와 같은 결과에 의하여 노랑하늘타리의 각 부위별 메탄올 추출물에 대한 항종양 기전 연구에 이 농도를 사용하였다.
관찰하였다. 노랑하늘타리 잎의 용매 분획물을 HL-60 세포에 각각 lOOpg/m/ 농도로 24시간 동안 처리흐)였을 때, 에틸아세테이트 분획물에서 뚜렷한 DNA단편화 현상을 볼 수 있었다(Fig. 3-1). 그리고 노랑하늘타리의 뿌리, 씨 및 줄기 메탄올 추출물을 각각 10 卩以m/, 10ng/mZ, 50 卩以m2 농도로 처리하였을 때에는 줄기 메탄올 추출물을 처리한 세포에서 DNA 단편화가 가장 뚜렷하게 관찰되었다(Fig.
3-1). 그리고 노랑하늘타리의 뿌리, 씨 및 줄기 메탄올 추출물을 각각 10 卩以m/, 10ng/mZ, 50 卩以m2 농도로 처리하였을 때에는 줄기 메탄올 추출물을 처리한 세포에서 DNA 단편화가 가장 뚜렷하게 관찰되었다(Fig. 3-H). 또한, 노랑하늘타리 추출물에 의한 apoptosis 유도에 의하여 sub-Gl hypodiploid 세포가 증가하는지 DNA에 결합하여 형광을 나타내는 물질인 PI를 처리하여 유세포분석기로 분석하였다.
또한, 노랑하늘타리 추출물에 의한 apoptosis 유도에 의하여 sub-Gl hypodiploid 세포가 증가하는지 DNA에 결합하여 형광을 나타내는 물질인 PI를 처리하여 유세포분석기로 분석하였다. 노랑하늘타리 잎의 에틸아세테이트 분획물을 100卩以血의 농도로 처리하여 시간별토 측정한 결과, sub-Gl hypodiploid 세포가 3시간에서 13.6%, 4시간에서 55.9%, 5시간에서 70.5%, 6시간에서 71.3%, 7시간에서, 94.8%, 游】간에서 96.9%로 시간이 지남에 따라 증가하였다(13ble II). 노랑하늘타리의 각 부위별 추출물을 처리 시에는 sub-Gl hypodiploid 세포가 줄기 추출물 50 卩以m2 처리에 의하}여 37.
9%로 시간이 지남에 따라 증가하였다(13ble II). 노랑하늘타리의 각 부위별 추출물을 처리 시에는 sub-Gl hypodiploid 세포가 줄기 추출물 50 卩以m2 처리에 의하}여 37.7%, 뿌리 추출물 10卩血 처리에 의하여 12%, 씨 추출물 10|ig/m/ 처리에 의하여 22.7%로 관찰되었다(Fig. 4). HL-60 세포에 노랑하늘타리의 각 부위별 추출물을 10ng/m/, 50ng/m/, lOOng/m/ 의 농도로 24시간 처리한 후 단백질을 분리하여 effector caspase 의 하나인 caspase-3의 활성형 발현이 증가하는지 조사하였으며, caspase-3의 활성화에 의하여 caspase 기질의 하나인 PARP가 분해되는지 확인하여 노랑하늘타리의 각 부위별 메탄올 추출물 및 잎의 용매 분획물의 HL-60 세포 성장 억제 효과가 apoptosis 유도에 의한 것인지를 알아보았다.
HL-60 세포에 노랑하늘타리의 각 부위별 추출물을 10ng/m/, 50ng/m/, lOOng/m/ 의 농도로 24시간 처리한 후 단백질을 분리하여 effector caspase 의 하나인 caspase-3의 활성형 발현이 증가하는지 조사하였으며, caspase-3의 활성화에 의하여 caspase 기질의 하나인 PARP가 분해되는지 확인하여 노랑하늘타리의 각 부위별 메탄올 추출물 및 잎의 용매 분획물의 HL-60 세포 성장 억제 효과가 apoptosis 유도에 의한 것인지를 알아보았다. 노랑하늘타리 잎의 에틸아세테이트 용매 분획물을 50卩以m/ 이상의 농도로 처리하였을 때 caspase・3의 활성형 (19kDa)의 밴드가 나타났으며 , 이는 caspase-3의 활성화에 의하여 기질인 PARP(116kDa)가 절단되어 85kDa 의 낸드가 나타나는 농도와 거의 일치함을 보였다(Fig. 5-A). 또한 - 슬기.
또한 - 슬기. 뿌리, 씨, 과피 메탄올 추출물도 각각 50询m/, 50|丄以 m2, l)j_ig/mZ, 100 |1 以m/ 이상의 농도로 처리하였을 때, caspase- 3 홀 시형 밴드와 caspase-3의 활성화에 의한 PARP의 절단된 밴드츹 관찰할 수 있었다(Fig. 5-B).
노랑 하늘타리에 의한 HL-60 백혈병 세포의 성장 억제 효과는 tetrx olium salt의 하나인 MTT를 사용하여 MTT의 환원에 의해 생성되는 formazan의 흡광도로 측정하였다. 그 결과, 노랑하늘타리 잎의 에틸아세테이트와 부탄올 분획물 100 ng/m/ 농도에서 세포 성장 억제 효과가 가장 높게 나타났다(Fig. 2-1). 그 중에서 노랑하늘타리 잎의 에틸아세테이트 분획물을 농도별로 HL- 60세포에 처리한 결과 성장 억제 효과는 농도에 의존적으로 증가함을 확인 할 수 있었다(Fig.
2-1). 그 중에서 노랑하늘타리 잎의 에틸아세테이트 분획물을 농도별로 HL- 60세포에 처리한 결과 성장 억제 효과는 농도에 의존적으로 증가함을 확인 할 수 있었다(Fig. 2-II). 그리고 노랑하늘타리의 뿌리, 잎, 줄기 및 과피 메탄올 추출물을 각각 10|ig/m/, 10ng/m/, 50 μg/m/ 및 100 μg/m/ 이상의 농도로 처리하였을 때 HL-60 세포 성장이 현저히 억제되었다(Table I).
2-II). 그리고 노랑하늘타리의 뿌리, 잎, 줄기 및 과피 메탄올 추출물을 각각 10|ig/m/, 10ng/m/, 50 μg/m/ 및 100 μg/m/ 이상의 농도로 처리하였을 때 HL-60 세포 성장이 현저히 억제되었다(Table I). 이와 같은 노랑하늘타리의 HL-60 세포의 성장에 대한 억제 효과가 apoptosis 유도에 의한 것인지 알아보았다.
3에서 보는 바와 같이 세포 성장 억제 효과가 가장 높았던 노랑하늘타리 잎의 에틸아세태이트 분획물에서 뚜렷한 DNA 단편화 현상을 볼 수 있었다. 노랑하늘타리의 각 부위별 메탄올 추출물에서는 특히 줄기의 메탄올 추출물에서 DNA 단편화 현상을 가장 뚜렷하게 관찰할 수 있었다. 그리고 DNA에 결합하여 형광을 나타내는 물질인 #를 이용하여 노랑하늘타리 추출물의 처리에 의한 apoptotic 세포 즉 sub-Gl hypodiploid 세포의 증가를 유세포분석기로 확인하였다.
그리고 DNA에 결합하여 형광을 나타내는 물질인 #를 이용하여 노랑하늘타리 추출물의 처리에 의한 apoptotic 세포 즉 sub-Gl hypodiploid 세포의 증가를 유세포분석기로 확인하였다. 그 결과 노랑하늘타리 잎의 에틸아세테이트 분획물의 처리에 의하여 시간 의존적으로 apoptotic 세포가 증가되는 것을 관찰할 수 있었다(Rble II). 또한 뿌리, 씨, 줄기 메탄올 추출물을 처리하였을 때도 apoptotic 세포가 증가됨을 관찰할 수 있었으며, 특히 뿌리와 씨의 메탄올 추출물을 처리시 G2/M 세포 peak 도 같이 증가됨 관찰할 수 있었다(Fig.
그 결과 노랑하늘타리 잎의 에틸아세테이트 분획물의 처리에 의하여 시간 의존적으로 apoptotic 세포가 증가되는 것을 관찰할 수 있었다(Rble II). 또한 뿌리, 씨, 줄기 메탄올 추출물을 처리하였을 때도 apoptotic 세포가 증가됨을 관찰할 수 있었으며, 특히 뿌리와 씨의 메탄올 추출물을 처리시 G2/M 세포 peak 도 같이 증가됨 관찰할 수 있었다(Fig. 4). Caspase는 효소 활성 부위에 모두 cysteine을 가지고 있는 단백질 분해 효소로써 지금까지 14종류가 알려져 있는데 이들은 대부분 apoptosis에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 18)PARR: 손상된 DNA 복구에 관여된 단백질로써 apoptosis 과정 중 caspase에 의해서 절단되는 것으로 보고되어 있다单 Fig.

후속연구

노랑하늘타리의 각 부위별 추출물이 HL-60 세포의 apoptosis 를 유도하여 백혈병 세포의 성장을 저해한다는 본 연구 결과는노랑하늘타리를 암 치료제로 이용할 수 있는 새로운 근거를 제시하며, 항암 치료제 또는 예방제의 유효 성분 분리 및 그 작용기전 연구에 중요한 기초자료가 될 것이라 사료된다.

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