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문제 정의
- 중요하다. 따라서 본 연구에서는 유기물 분해능이 우수하면서도 암모니아 탈취능이 우수한 균주의 선별을 시도하였다. 유기물 분해력을 지닌 효소활성이 높은 NA 2, 5, 12, 15, 18 균주의 암모니아 가스 탈취 성능을 측정하였다.
- 본 연구에서는 가축분뇨의 비료화를 위한 분뇨의 악취와 암모니아성 질소를 제거시킬 수 있는 기능성 발효촉진 미생물의 선별을 목표로 쌀겨 자연발효 추출물로부터 총 61개의 균주를 순수 분리하였고, 순수 분리된 균주의 단백질, 지방, 탄수화물 등의 유기물 분해 효소활성 (amylase, protease, cellulase 및 lipase), 암모니아 가스의 탈취성능을 조사하여 최종적으로 NA 2, 12, 15의 3종의 균주를 선별하였다. 최종선별된 균주에 대해서 동정실험을 수행한 결과, NA 2는 Bacillus acidocaldarius로 동정되었고, NA 15는 Pianococcus sp.
- 본 연구에서는 분뇨의 악취와 암모니아성 질소를 제거시킬수 있고 발효촉진 기능을 가진 미생물을 선별하였으며, 선별된 균주를 동정하고, 실험계획법을 이용하여 선별된 미생물의 최적발효조건을 확립하고자 하였다.
제안 방법
- 유기물 분해력을 지닌 효소활성이 높은 NA 2, 5, 12, 15, 18 균주의 암모니아 가스 탈취 성능을 측정하였다. 가스 검지 관을 사용하여 초기 분뇨의 농도, 균주와 혼합배양 후 48시간과 70시간 후에 암모니아 가스의 변화량을 측정하였다. Fig.
- 고액분리시킨 액상타입의 돼지분뇨를 밀폐시킨 500 mL 삼각플라스크에 100 mL씩 넣어 각각 55°C 의 진탕배양기에서 1시간 정도 가온시킨 후, 가스텍 (KORINS Co., Korea)을 사용하여 암모니아 가스 생성량을 측정하였다. 돼지 분뇨의 암모니아 가스 생성량 측정 후, 미리 준비해 놓은 균주 배양액 1 mL 를 첨가하여 시간별로 암모니아 가스생성 변화량을 측정하였다.
- 및 암모니아 탈취성능이 우수한 중.고온성 미생물 균주를 자연으로부터 순수 분리하였고 실험계획법에 의해 최적의 발효 조건을 선정하였다.
- 공시험구 (blank test)로는 균주 배양액 대신 증류수 1 mL를 가한 것을 사용하였다. 반응용 시료와 공시험구를 0.
- 균주의 동정은 Bergey's manual(14)에 따라 최종 선별된 균주에 대해 14가지 (Gram test, extracellular protease, extracellular amylase, catalase, 형태, NaCl (1%, 2%, 3%) 존재 하에서의 성장상태, 성장온도, 포도당으로부터 산 생성능, citrate 이용, phenylalanine deamination, indol 형성, Voges- proskauer test, KOH test, spore-staining)의 동정실험을 행하였다(15, 16).
- 단백질 분해능을 분석하기 위해 skim milk agar (beef extract 3 g/L, peptone 5 g/L, agar 15 g/L, skim milk 10 g/L, pH 6.8)와 gelatin agar (gelatin 15 g/L, peptone 5 g/L, KNO3 1 g/L, pH 6.8)를 사용하였고, 탄수화물 분해능의 측정은 starch hydrolysis agar (beef extract, infusion from 5 g/L, soluble starch 20 g/L, tryptose 10 g/L, NaCl 5 g/L, agar 15 g/L, pH 7.4)와 cellulose agar (cellulose powder 10 g/L, yeast extract 1 g/L, NaCl 0.1 g/L, (NHi)2SO4 2.5 g/L, K2HPO4 0.25 g/L, MgSO4 . 7H2O 0.
- 실험은 반복 없이 2가지의 범위 (-1, +1) 내에서 16번 시행하였다. 독립변수 (beef extract, peptone의 양 및 배지의 pH)를 이용하여 종속변수 (균체성장률)에 대한 회귀방정식을 얻음으로써 각각의 반응조건에 대한 상호작용 및 최적의 반응조건을 구하였다. 실험설계 프로그램은 Design-Expert 6.
- , Korea)을 사용하여 암모니아 가스 생성량을 측정하였다. 돼지 분뇨의 암모니아 가스 생성량 측정 후, 미리 준비해 놓은 균주 배양액 1 mL 를 첨가하여 시간별로 암모니아 가스생성 변화량을 측정하였다.
- 한다. 분리된 미생물들의 단백질, 탄수화물, 지방 등의 유기물에' 대한 분해성능을 각각의 성분이 포함된 고체 배지에서 정성적으로 분석하였다(Table 2). 61개의 순수 분리된 균주의 유기물 분해력을 정성적으로 측정한 결과, 약 20 종의 균주가 3가지 이상의 유기물 분해효소를 지닌 것으로 나타났고, 그 중 NA 2, 5, 12, 15, 18이 다양한 유기물에 대해 높은 분해력을 나타냈다.
- 2 mL 및 일정량의 효소액 1 mL으로 구성되었으며 최종 부피는 증류수로 총 1 mL이 되도록 보정하였고, 효소 반응액을 35 °C 에서 30분간 반응시킨 후 ethanol을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 생성된 유리 지방산은 phenolphthalein의 존재 하에서 0.01 N KOH 용액으로 중화 적정하였고, 동일 조건 하에서 배양액 대신 증류수를 사용하여 대조구 실험을 행하였다. 1 unit은 효소액 1 mL당 1분간에 10 皿이의 유리 지방산을 생성하게 하는 효소의 양으로 정의하였다(10).
- 와 cellulase 의 활성을 측정하였다. 선별된 균주를 nutrient broth 배지에서 55°C에서 24, 48, 72시간 동안 배양한 배양액을 효소액으로 사용하여 분석을 수행하였다. 균체 농도는 균 배양액을 증류수로 세척 후, 칭량접시에 담아 5 0°C 에서 건조시켜 건조무게로 측정하였다.
- 순수분리된 균주의 유기물에 대한 정성적 분해능을 확인하고자, 다양한 유기물 (전분, 젤라틴, 카제인, 셀룰로오즈, 지방) 이 탄소원으로 첨가된 평판배지에 35 °C 와 55'C 에서 각각 2-3 일 정도 배양하여 균체 주위의 투명환을 관찰하였다. 단백질 분해능을 분석하기 위해 skim milk agar (beef extract 3 g/L, peptone 5 g/L, agar 15 g/L, skim milk 10 g/L, pH 6.
- 암모니아 가스의 높은 탈취성능을 보이는 3종의 균주 NA 2, 12, 15를 혼합 배양하여 실험계획법의 일종인 반응표면계획법에 의해 실험을 설계하고 결과를 분석하였다. Table 3과같이 반응표면계획법 (response surface method)의 중심합성계획법 (central composite design)에 의한 총 16가지의 배지 조건에서 실험을 통해 균체의 성장속도를 조사하였다.
- 따라서 본 연구에서는 유기물 분해능이 우수하면서도 암모니아 탈취능이 우수한 균주의 선별을 시도하였다. 유기물 분해력을 지닌 효소활성이 높은 NA 2, 5, 12, 15, 18 균주의 암모니아 가스 탈취 성능을 측정하였다. 가스 검지 관을 사용하여 초기 분뇨의 농도, 균주와 혼합배양 후 48시간과 70시간 후에 암모니아 가스의 변화량을 측정하였다.
- 유기물 분해력이 높은 균주를 선별하여 amylase, protease, lipase 와 cellulase 의 활성을 측정하였다. 선별된 균주를 nutrient broth 배지에서 55°C에서 24, 48, 72시간 동안 배양한 배양액을 효소액으로 사용하여 분석을 수행하였다.
- 자연상태에서 발효된 쌀겨 추출물((쥐영우환경 제공)을 분리 원으로 하여 균주를 순수 분리하였다. 분리배지로는 nutrient agar (NA, beef extract 3 g/L, peptone 5 g/L, agar 15 g/L, pH 6.
-
효소활성 측정
정상적인 유기물 분해력 측정을 통해 선별된 NA 2, 5, 12, 15, 18 균주에 대해 amylase, protease, lipase와 cellulase의 활성을 측정하였다. Fig.
- 효소활성과 탈취실험에서 우수한 성능을 나타낸 3종 (NA 2, 12, 15)의 균주에 대해서 14가지의 동정실험을 행하였다. Table 6에서 보는 바와 같이 NA 2는 Bacillus acidocaldarius 로 동정되었고, NA 15는 Pianococcus sp.
- 5 mL를 가하여 잘 혼합하고 40 °C 에서 10분간 가온한 후, 660 nm에서의 홉광도를 측정하였다. 흡광도를 tyrosine 농도로 환산하기 위해 tyrosine 농도를 변화시켜서 위의 조작을 반복하여 표준곡선을 미리 작성해 두었다. 1 unit은 1분간에 tyrosine 1 昭 상당량의 생성물을 나오게 하는 효소량으로 하였다(9).
대상 데이터
- 다양한 균을 분리하기 위해 일반세균, 효모균, 방선균의 분리를 위해 각각 NA, YM, BA 배지를 분리용 배지로 사용하였다. 시료를 다양한 희석배율로 희석하여 세 종류의 배지에도 말하여 각각 35 °C 와 55 °C 의 온도에서 48시간 동안 배양한 결과, Table 1에서 보는 바와 같이 32종의 일반 세균류, 20종의 효모류, 9종의 방선균으로 보이는 총 61개의 단일콜로니를 얻을 수 있었다.
- 5 mL 를 가하여 50°C 에서 30분간 반응시킨 후, DNS 용액 3 mL을 가하여 생성된 환원당을 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 포도당을 사용하였다. 분당 효소액 1 Umol의환원당을 생성하는 속도를 1 unit로 정의하였다<11).
이론/모형
- 의해 실험을 설계하고 결과를 분석하였다. Table 3과같이 반응표면계획법 (response surface method)의 중심합성계획법 (central composite design)에 의한 총 16가지의 배지 조건에서 실험을 통해 균체의 성장속도를 조사하였다. 중심합성계획법은 2차 이상의 근사 반응 함수를 만드는데 있어서 보편적으로 사용되는 방법이다.
- 실험설계는 반응표면계획법 (response surface method) 중심합성계획법 (central composite design)을 사용하여 조작 변수들의 영향과 상호작용 등을 포함한 데이터를 분석하였다 (13). 실험은 반복 없이 2가지의 범위 (-1, +1) 내에서 16번 시행하였다.
성능/효과
- 분리된 미생물들의 단백질, 탄수화물, 지방 등의 유기물에' 대한 분해성능을 각각의 성분이 포함된 고체 배지에서 정성적으로 분석하였다(Table 2). 61개의 순수 분리된 균주의 유기물 분해력을 정성적으로 측정한 결과, 약 20 종의 균주가 3가지 이상의 유기물 분해효소를 지닌 것으로 나타났고, 그 중 NA 2, 5, 12, 15, 18이 다양한 유기물에 대해 높은 분해력을 나타냈다. 유기물 분해력이 높은 이들 균주들은 NA 배지에서 분리된 것으로 보아 대부분 일반 세균의 일종일 것으로 추정되었다.
- 가스 검지 관을 사용하여 초기 분뇨의 농도, 균주와 혼합배양 후 48시간과 70시간 후에 암모니아 가스의 변화량을 측정하였다. Fig. 2에서 보는 바와 같이 NA 2 균주는 70시간 후에는 암모니아 가스를 약 95%까지 감소시켰고, NA 12와 15 균주도 각각 65%와 57%씩 감소시켜 높은 암모니아 가스 탈취성능을 보이는 것으로 나타났다.
- 즉 배양 초기에는 amylase의 활성이 높았고, 중기에는 protease오) lipase, 후기에는 cellulase의 활성이 높게 나타났다. 따라서 이들 4개 주요 효소들은 균주를 48시간 이상 배양했을 때, 높게 나타남을 알 수 있었다.
- 34 hr'1 로 최고값을 나타낸다는 것을 프로그램에 의해 통계적으로 산출할 수 있었다. 또한 결정된 최적 배지 조건으로 5회의 검정 실험결과 프로그램에 의해 예측된 값 (0.34)에 대해 약 94%에 해당하는 0.32 hr'1 값을 얻을 수 있었고, 이로부터 중심합성계획법에 의해 예측된 결과와 실제 실험결과사이에 높은 신뢰성이 있음을 알 수 있었다(Table 5).
- 최종 모델식을 분석해 보면, pH가 다른 변수에 비해 균체의 성장속도에 큰 영향을 미치는 것을 알 수 있었다. 본 모델 식을 통해 높은 균체 성장속도를 갖는 최적의 배지 조건을 구하기 위해 컴퓨터 모사를 한 결과, pH가 6.3으로 고정되었을 때, beef extract와 peptone의 변화에 따른 성장 속도의 변화는 Fig. 3과 같이 나타났다. 최적 배지 조건은 beef extract 4.
- 시료를 다양한 희석배율로 희석하여 세 종류의 배지에도 말하여 각각 35 °C 와 55 °C 의 온도에서 48시간 동안 배양한 결과, Table 1에서 보는 바와 같이 32종의 일반 세균류, 20종의 효모류, 9종의 방선균으로 보이는 총 61개의 단일콜로니를 얻을 수 있었다. 균주의 명명은 배지 이름의 약자에 숫자를 표기하여 나타내었다.
- 61개의 순수 분리된 균주의 유기물 분해력을 정성적으로 측정한 결과, 약 20 종의 균주가 3가지 이상의 유기물 분해효소를 지닌 것으로 나타났고, 그 중 NA 2, 5, 12, 15, 18이 다양한 유기물에 대해 높은 분해력을 나타냈다. 유기물 분해력이 높은 이들 균주들은 NA 배지에서 분리된 것으로 보아 대부분 일반 세균의 일종일 것으로 추정되었다. 이와 같이 분리된 5종의 미생물은 55°C에서 배양된 고체배지에서 선별되었고, 35笆의 중온에서도 높은 성장률을 보여 (데이터 저]시) 가축분뇨 처리용 미생물로 적합한 것으로 판단되었다.
- 로 부분동정되었다. 이들 분리된 미생물을 가축분뇨처리 제로 개발하기 위한 최적의 혼합 배양 조건을 구하기 위해 반응표면계획법으로 배지 조성과 pH와 같은 조작 변수들의 영향과 상호작용 등을 포함한 데이터를 분석한 결과, 최적 배양 조건은 beef extract 4.59 g/L, peptone 8.73 g/L, pH 6.3으로 결정되었다. 분리된 미생물들은 발효촉진 및 암모니아 탈취 성능이 우수하면서도 중.
- 이상의 실험으로 가축분뇨의 액비화를 위한 3종의 발효촉진 및 암모니아 탈취성능이 우수한 중.고온성 미생물 균주를 자연으로부터 순수 분리하였고 실험계획법에 의해 최적의 발효 조건을 선정하였다.
- 유기물 분해력이 높은 이들 균주들은 NA 배지에서 분리된 것으로 보아 대부분 일반 세균의 일종일 것으로 추정되었다. 이와 같이 분리된 5종의 미생물은 55°C에서 배양된 고체배지에서 선별되었고, 35笆의 중온에서도 높은 성장률을 보여 (데이터 저]시) 가축분뇨 처리용 미생물로 적합한 것으로 판단되었다. 실제 이동식 탱크로리에 발효촉진 미생물이 투여되고 이동 중 부숙되는 과정은 계절 변화에 따라 다양한 온도 (대략 35-55笆)에서 진행되기 때문이다.
- 효소활성 결과를 분석한 결과, protease와 lipase 활성의 경우 48-72시간 배양 시, 높은 활성을 나타냈고, amylase activity 는 24-48 시간 배양 시, cellulase 활성은 72시간 배양 시에 높은 활성을 나타냈다. 즉 배양 초기에는 amylase의 활성이 높았고, 중기에는 protease오) lipase, 후기에는 cellulase의 활성이 높게 나타났다. 따라서 이들 4개 주요 효소들은 균주를 48시간 이상 배양했을 때, 높게 나타남을 알 수 있었다.
- 3과 같이 나타났다. 최적 배지 조건은 beef extract 4.59 g/L, peptone 8.73 g/L일 때, 성장속도가 0.34 hr'1 로 최고값을 나타낸다는 것을 프로그램에 의해 통계적으로 산출할 수 있었다. 또한 결정된 최적 배지 조건으로 5회의 검정 실험결과 프로그램에 의해 예측된 값 (0.
- 위와 같이 실험에 의해 얻어진 결과는 중심합성계획법에 의해 이차함수의 형태로 산출되었고, 다중 회귀분석 결과 Table 4와 같은 최종 모델식을 얻을 수 있었다. 최종 모델식을 분석해 보면, pH가 다른 변수에 비해 균체의 성장속도에 큰 영향을 미치는 것을 알 수 있었다. 본 모델 식을 통해 높은 균체 성장속도를 갖는 최적의 배지 조건을 구하기 위해 컴퓨터 모사를 한 결과, pH가 6.
- 나머지 3가지의 균주 (NA 5, 12, 18)도 비슷한 활성을 나타냈다. 효소활성 결과를 분석한 결과, protease와 lipase 활성의 경우 48-72시간 배양 시, 높은 활성을 나타냈고, amylase activity 는 24-48 시간 배양 시, cellulase 활성은 72시간 배양 시에 높은 활성을 나타냈다. 즉 배양 초기에는 amylase의 활성이 높았고, 중기에는 protease오) lipase, 후기에는 cellulase의 활성이 높게 나타났다.
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