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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 각종 진균증에 광범위한 항균력을 나타내고 독성이 적은 항진균 항생물질을 개발하고자 항진균성 물질을 생산하는 세균을 이용하여 그 생물 활성을 조사하였다.
- 항균성 물질의 물질정제를 위한 특성으로 유기용매 전용성을 검토하였다. 배양액의 ether 추출농축물을 사용하여 TLC로서 분석하였으며, plate assay를 통하여 항균성 물질의 존재는 Fig.
제안 방법
- 1) 배지에 접종하여 37℃, 1 ~5일간 배양하였다. 항진균성 물질의 생산능이 우수한 PDB를 기본배지로 하여 탄소원으로 dextrin, glucose, glycerol, maltose, sodium acetate, soluble starch, sucrose, xylose를 각각 1% (w/v)로 첨가하여 수행하였으며, 질소원으로 최적 탄소원이첨가된 배지에 유기 질소원으로 asparagine, casamino acid, com steep liquor, leucine, peptone, soybean meal, yeast extract!- 무기질소원으로는 NH4C1, NaNO3, (NHQ2SO4를 각각 1% (w/v)로 첨가하여 실시하였다. 항균활성은 agar plate 상에서 agar diffusion법으로 저해환 (clear zone)을 검토하여조사하였으며, 시험균으로는 Aspergillus jlavus를 사용하였다.
- B-1 균주가 생산하는 항균성 물질의 특성을 조사하기 위해 김(16)의 방법에 따라 배양액을 1 N HC1, 1 N NaOH 를 사용하여 pH 2.0 및 pH 11.0으로 조정하여 실온에서 4~5시간 처리한 다음, 중성 (pH 7.0) 으로 조정하여 Bacillus subtilise 시험균주로 하여 항균효과를 조사하였다. 열처리의 경우 배양액을 121℃, 1기압에서 30분간 처리한 다음 잔존 활성을 조사하였다.
- PDB에 각각의 유기 혹은 무기 질소원을 1% 첨가하여생산능을 배지에서 조사한 결과, Table 3에서와 같이 PDB 를 제외한 다른 질소원을 첨가하였을 경우 항진균성 물질이 생산되지 않았으므로 Table 2와 3의 결과에서 PDB를공시균주인 B-l의 항진균성 물질 생산 최적배지성분으로결정하였다.
- B-1 이라 명명하였다. 균주의 항균성 물질 생산최적배지를 검토하기 위하여 기본 배지로 A6 (soy bean meal 1%, glucose 1%, NaCl 0.5% CaCO3 1%, pH 7.0), ISP No. 2 (yeast extract 0.4%, malt extract 1%, dextrose 0.4%, pH 7.2), LB (peptone 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 0.5%, pH 7.0), YM (yeast extract 0.3%, malt extract 0.3%, peptone 0.5%, glucose 1%, pH 5 — 6), PDB (potato starch 0.4%, dextrose 2%, pH 5.1) 배지에 접종하여 37℃, 1 ~5일간 배양하였다. 항진균성 물질의 생산능이 우수한 PDB를 기본배지로 하여 탄소원으로 dextrin, glucose, glycerol, maltose, sodium acetate, soluble starch, sucrose, xylose를 각각 1% (w/v)로 첨가하여 수행하였으며, 질소원으로 최적 탄소원이첨가된 배지에 유기 질소원으로 asparagine, casamino acid, com steep liquor, leucine, peptone, soybean meal, yeast extract!- 무기질소원으로는 NH4C1, NaNO3, (NHQ2SO4를 각각 1% (w/v)로 첨가하여 실시하였다.
- 항균활성은 agar plate 상에서 agar diffusion법으로 저해환 (clear zone)을 검토하여조사하였으며, 시험균으로는 Aspergillus jlavus를 사용하였다. 또한 균주 배양 초기 pH는 5, 6, 7, 8, 9, 10으로 조절하고 온도는 28℃, 37℃에서 생산 최적조건을 조사하였다.
- 생육초기 pH에 대한 영향을 알아보기 위하여 사용 배지의 pH를 5, 6, 7, 8, 9, 10으로 조정하여 배양하였다. 그 결과 Fig.
- 0) 으로 조정하여 Bacillus subtilise 시험균주로 하여 항균효과를 조사하였다. 열처리의 경우 배양액을 121℃, 1기압에서 30분간 처리한 다음 잔존 활성을 조사하였다.
- 항진균성 물질의 대량생산을 위해 5 £ 용량의 Jar fermentor를 이용하여 대량생산을 실시하였다. 사용 배지인 PDB는 산업적 측면을 고려하여 실험실에서 직접 제조하여 사용하였다.
- 항진균성 물질의 대량생산을 위해 항진균성 물질 생산 최적 조건을 기초로 5, 용량의 Jar Fermentor를 이용하여 대량생산조건을 검토하였다. 생산 최적배지인 PDB (Difco Co.
- 항진균성 물질의 특성으로 유기용매 전용성을 검토하기 위해 ether 추출물 (1 阐成)을 TLC (Silica gel 60 F254) 상에 1 以 spot하여 UV lamp의 254 nm로 조사하여 분석하였다. 전개용매로는 CH2CI2, CH3OH를 각각 9 : 1로 혼합하여 사용하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 공시 균주는 토양시료로부터 분리한세균으로 B-1 이라 명명하였다. 균주의 항균성 물질 생산최적배지를 검토하기 위하여 기본 배지로 A6 (soy bean meal 1%, glucose 1%, NaCl 0.
- 이용하여 대량생산을 실시하였다. 사용 배지인 PDB는 산업적 측면을 고려하여 실험실에서 직접 제조하여 사용하였다. 그 결과 기존의 시판 PDB 제품과 비교하여 그 항균 활성이 더 우수하거나 동등한 효과를 보였다(결과미개재).
- 전개용매로는 CH2CI2, CH3OH를 각각 9 : 1로 혼합하여 사용하였다. 항균성 물질의 확인은 전개한 TLC plate를 부패 양파와 버섯에서 분리한 푸른곰팡이를 중층한 PDB agar plate 상에 얹고 실온에서 30분간 방치후 28℃에서 24시간 배양하여 저해환 형성 유 .
이론/모형
- B-1 균주를 28℃, 120 rpm에서 2일간 배양한 후 원심 분리하여 얻은 배양상등액과 ether 추출물을 시험균주가 중층된 agar plate 상에 paper disc (0 6 mm, Advantec Co.)를일정간격으로 놓은 후 20 以씩 첨가하여 clear zone의 유무및 크기를 판단하는 agar diffusion 법을 사용하였다. Ether 추출물은 B-1 균주의 2일 배양액 50 畝를 2배량의 ether로추출하여 NazSQ로 건조한 다음 감압 농축시켜 소량의 ether어】 용해 (1 阐成 농도)시켜 사용하였다.
- 항균성 물질의 확인은 전개한 TLC plate를 부패 양파와 버섯에서 분리한 푸른곰팡이를 중층한 PDB agar plate 상에 얹고 실온에서 30분간 방치후 28℃에서 24시간 배양하여 저해환 형성 유 . 무를 확인하는 plate assay를 사용하였다.
- 검토하였다. 생산 최적배지인 PDB (Difco Co.)는고가이므로 산업적 응용면을 고려하여 HANDBOOK OF Microbiological Media(17)를 참고하여 직접 제조하여 사용하였다. 배양은 28℃, 120 rpm, 통기량 1 L/min으로 pH 5.
- 3(B))이 확인되었으며, 항균성 물질이 ether 에 전용되는 것을 확인하였다. 시험균 (fungi)이 중층된 PDB agar plate에 plate assay법을 이용하여항균력을 확인하였다.
- 항진균성 물질의 생산능이 우수한 PDB를 기본배지로 하여 탄소원으로 dextrin, glucose, glycerol, maltose, sodium acetate, soluble starch, sucrose, xylose를 각각 1% (w/v)로 첨가하여 수행하였으며, 질소원으로 최적 탄소원이첨가된 배지에 유기 질소원으로 asparagine, casamino acid, com steep liquor, leucine, peptone, soybean meal, yeast extract!- 무기질소원으로는 NH4C1, NaNO3, (NHQ2SO4를 각각 1% (w/v)로 첨가하여 실시하였다. 항균활성은 agar plate 상에서 agar diffusion법으로 저해환 (clear zone)을 검토하여조사하였으며, 시험균으로는 Aspergillus jlavus를 사용하였다. 또한 균주 배양 초기 pH는 5, 6, 7, 8, 9, 10으로 조절하고 온도는 28℃, 37℃에서 생산 최적조건을 조사하였다.
성능/효과
- B-l이 생산하는 항균성 물질의 항진균 및 항세균 효과를 검토하기 위하여 PDB 배양상등액 20 成와 ether 추출 농축물 (1 您/以)을 사용하여 Gram(+) 세균 2균주, Gram(-) 세균 2균주, 곰팡이 5균주, 효모 1균주 대상으로 항균 활성을 조사한 결과 진균에 강한 항균력을 가지며, 세균에도작용하는 광범위한 항균효과를 나타내었다(Table 6).
- Table 1의 결과에서 탄소원의 영향을 검토하기 위해 기본배지인 PDB에 탄소원을 각각 1% 첨가하여 배양일수에따른 생산능을 조사한 결과, Table 2에서와 같이 탄소원은항진균성 물질 생산에 큰 영향이 없다고 사료되었으며 PDB 경우 Table 1에서와 같이 배양 2일째 항균효과가 가장 우수하였다.
- 공시균의 생육과 항진균성 물질 생산에 대한 최적 배지를 조사하기 위해 5종류의 배지를 사용하여 항균성 물질의 생산을 조사한 결과 Table 1에서와 같이 PDB에서만 항진균성 물질이 생산되었으며 배양 2일째 최대 생산량을 나타내었다. 따라서 기본배지로 사용하였으며 또한 직접 제조한 PDB의 경우 시판용 PDB에 비해 생산능이 다소 우수하다고 판단되었다.
- pH를 5, 6, 7, 8, 9, 10으로 조정하여 배양하였다. 그 결과 Fig. 1에서 보인 바와 같이 pH 5에서 균의 생육이 가장 우수하였으며 pH가 증가함에 따라 균 생육도가 다소 감소하는 경향을 보였다. 배양 온도의 영향을 알아보기 위하여 28℃, 37℃의 온도 조건하에 각각 실험한 결과 28℃에서 균의 생육이 24 hr 이후부터 48 hr까지 다소 양호한 결과로 나타내었다(Fig.
- 사용 배지인 PDB는 산업적 측면을 고려하여 실험실에서 직접 제조하여 사용하였다. 그 결과 기존의 시판 PDB 제품과 비교하여 그 항균 활성이 더 우수하거나 동등한 효과를 보였다(결과미개재). 본 공시균주는 현재 동정 중에 있으며 대량생산을 통한 응용분야의 적합성 연구도 수행 중에 있다.
- 따라서 기본배지로 사용하였으며 또한 직접 제조한 PDB의 경우 시판용 PDB에 비해 생산능이 다소 우수하다고 판단되었다.
- 1에서 보인 바와 같이 pH 5에서 균의 생육이 가장 우수하였으며 pH가 증가함에 따라 균 생육도가 다소 감소하는 경향을 보였다. 배양 온도의 영향을 알아보기 위하여 28℃, 37℃의 온도 조건하에 각각 실험한 결과 28℃에서 균의 생육이 24 hr 이후부터 48 hr까지 다소 양호한 결과로 나타내었다(Fig. 2). 이들 조건(Fig.
- 2). 이들 조건(Fig. 1, Fig. 2)에 이에 따른 각각의 항균효과를 검토하기 위하여 버섯 곰팡이균을시험균으로 하여 조사한 결과 48 hr의 pH 5와 28 ℃ 에서 항균효과가 가장 우수하였으나(Table 4, Table 5), pH 7 이후 및 37℃의 72 hr 배양 이후는 생성된 항균성물질이 분해되는 결과를 보인다고 추정되었다.
- 항균성 물질의 특성을 조사하기 위해 배양상등액을 산처리, 알칼리처리, 열처리한 다음 잔존활성을 측정한 결과 Table 7에서 보인 바와 같이 비처리시 (control)와 비교하였을 때 항균성 물질은 산, 알칼리처리시 비처리에 비해 각각 82%, 73%의 활성이 잔존하였고, 열처리시 완전히 실활되어 열에 상당히 불안정한 특성을 나타내었다.
후속연구
- 이는 우리나라와 같은 식량증산을 중시하는 곳에서는 그 개발이 크게 요구될 것이며 인체나 동물에 무독하고 안전한 항생물질 농약 그리고 환경보전에 맞는 농약, 병균 병충의 성질에 맞는 농약 항생물질로서 개발될 수도있다. 그 외 여러가지 항균활성을 가지는 첨가제와의 혼합에 따른 항진균의 효과를 훨씬 증대시킬 수 있으며 이런 약제의 용도뿐만 아니라 실생활의 항곰팡이 제제로 이용하여 좀 더 쾌적한 환경을 누릴 수 있을 것이다.
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