순천대학교 지의류 은행(Lichen Bioresources Center)에서 571종의 지의류 내생 곰팡이를 분양받아 Candida albicans에 대한 항진균 활성을 조사하여 4종을 선정하였다. 선정된 4종의 지의류 내생 곰팡이의 배양액 내에 존재하는 항진균 활성을 알아보기 위해 disc diffusion method 방법을 이용한 결과 Stereocaulon sp. (1429,1430)가 C. albicans에 대한 항진균 활성이 가장 좋았으며, 다음으로는 Graphis sp. (1245), Cryptosporiopsis diversispora (0156) 순으로 활성이 좋게 나타났으며, 이들 지의류 내생곰팡이가 고체배지와 액체배지에서도 항진균 활성 물질을 생성하였다. 고체배지에서와 액체배지에서 공통적으로 활성이 있는 지의류 내생 곰팡이 배양액의 chloroform, ethyl acetate 용매 추출물의 C. albicans의 항진균 활성도를 측정한 결과 4종 모두 chloroform 추출물에서 높은 활성도를 나타냈다. Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, Candida lusitaniae에 대한 항진균 활성은 Stereocaulon sp. (1429, 1430)의 chloroform 추출물에서 모두 98% 이상의 높은 저해율을 보였고 Stereocaulon sp. (1429) 배양액의 chloroform 추출액과 ethyl acetate 추출액을 GC/MS를 이용해 성분을 분석한 결과 hexadecanonic acid-methyl ester, 14-octadecenoic acid-methyl ester, octadecenoic acid-methyl ester가 새로운 항진균 물질일 가능성을 보여주었다.
순천대학교 지의류 은행(Lichen Bioresources Center)에서 571종의 지의류 내생 곰팡이를 분양받아 Candida albicans에 대한 항진균 활성을 조사하여 4종을 선정하였다. 선정된 4종의 지의류 내생 곰팡이의 배양액 내에 존재하는 항진균 활성을 알아보기 위해 disc diffusion method 방법을 이용한 결과 Stereocaulon sp. (1429,1430)가 C. albicans에 대한 항진균 활성이 가장 좋았으며, 다음으로는 Graphis sp. (1245), Cryptosporiopsis diversispora (0156) 순으로 활성이 좋게 나타났으며, 이들 지의류 내생곰팡이가 고체배지와 액체배지에서도 항진균 활성 물질을 생성하였다. 고체배지에서와 액체배지에서 공통적으로 활성이 있는 지의류 내생 곰팡이 배양액의 chloroform, ethyl acetate 용매 추출물의 C. albicans의 항진균 활성도를 측정한 결과 4종 모두 chloroform 추출물에서 높은 활성도를 나타냈다. Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, Candida lusitaniae에 대한 항진균 활성은 Stereocaulon sp. (1429, 1430)의 chloroform 추출물에서 모두 98% 이상의 높은 저해율을 보였고 Stereocaulon sp. (1429) 배양액의 chloroform 추출액과 ethyl acetate 추출액을 GC/MS를 이용해 성분을 분석한 결과 hexadecanonic acid-methyl ester, 14-octadecenoic acid-methyl ester, octadecenoic acid-methyl ester가 새로운 항진균 물질일 가능성을 보여주었다.
To isolate a novel antifungal compound, we obtained 571 kinds of endolichenic fungi from Lichen Bioresources Center and examined their antifungal abilities. Four fungi Stereocaulon sp. (1429), Stereocaulon sp. (1430), Cryptosporiopsis sp. (0156), and Graphis sp. (1245) showed high antifungal activit...
To isolate a novel antifungal compound, we obtained 571 kinds of endolichenic fungi from Lichen Bioresources Center and examined their antifungal abilities. Four fungi Stereocaulon sp. (1429), Stereocaulon sp. (1430), Cryptosporiopsis sp. (0156), and Graphis sp. (1245) showed high antifungal activity against Candida albicans when they grew in both liquid and solid media. We extracted the culture supernatants of these fungi with chloroform and then ethyl acetate. The chloroform fraction exhibited the highest anti-fungal activities when those fractions were examined for the growth inhibition of Candida albicans with disc diffusion method. To see information for the inhibitor present in chloroform fraction we employed GC-MS for the fractions of Stereocaulon sp. (1429). We found that hexamethylcyclotrisiloxane, decanoic acid, hexadecanonic acid-methyl ester, 14-octadecenoic acid-methyl ester, and octadecenoic acid-methyl ester were present more in chloroform fraction than in ethylacetate fraction. This indicates that those compounds could be possible antifungal candidates since antifungal activity of chloroform extract was two times higher than that of ethyl acetate extract.
To isolate a novel antifungal compound, we obtained 571 kinds of endolichenic fungi from Lichen Bioresources Center and examined their antifungal abilities. Four fungi Stereocaulon sp. (1429), Stereocaulon sp. (1430), Cryptosporiopsis sp. (0156), and Graphis sp. (1245) showed high antifungal activity against Candida albicans when they grew in both liquid and solid media. We extracted the culture supernatants of these fungi with chloroform and then ethyl acetate. The chloroform fraction exhibited the highest anti-fungal activities when those fractions were examined for the growth inhibition of Candida albicans with disc diffusion method. To see information for the inhibitor present in chloroform fraction we employed GC-MS for the fractions of Stereocaulon sp. (1429). We found that hexamethylcyclotrisiloxane, decanoic acid, hexadecanonic acid-methyl ester, 14-octadecenoic acid-methyl ester, and octadecenoic acid-methyl ester were present more in chloroform fraction than in ethylacetate fraction. This indicates that those compounds could be possible antifungal candidates since antifungal activity of chloroform extract was two times higher than that of ethyl acetate extract.
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문제 정의
와 Cryptococcus neoformans의 진균을 대상으로 검증하였다. 이러한 진균들을 이용하여 지의류 내생 곰팡이의 항균활성 물질의 특성을 알아보고자 지의류 내생 곰팡이의 배양액을 분리하여 유기용매로 추출하고, GC-MS (gas chromatographymass spectrometer)를 이용하여 새로운 천연 항생물질을 찾는 기초실험으로 토대를 마련하고자 하였다.
제안 방법
2일 동안 배양한 Stereocaulon sp. (1429) 배양액의 chloroform 및 ethyl acetate 추출액을 GC-MS을 이용하여 분석하였다. Table 2를 통해 chloroform 추출물에서 활성이 2배 정도 더 좋은 것을 기초로 두어 chloroform과 ethyl acetate의 peak area의 비율을 비교한 GC-MS의 분석결과를 볼 수 있다.
30℃ incubator에서 24시간 배양 후 투명환의 크기가 큰 지의류 내생곰팡이 12종을 선별하였고, 배지 조성에 따른 활성도 차이를 비교해보기 위해 선별된 12종을 EMM [potassium hydrogen phthalate 3 g/L, Na2HPO4 2.2 g/L, NH4Cl 5 g/L, glucose 20 g/L, 225 mg/L supplements (A.A), salts 20 ml (MgCl2·6H2O 52.5 g/L, CaCl2·2H2O 0.735 g/L, KCl 50 g/L, Na2SO4 2 g/L), vitamins stock 1 ml (pantothenic acid 1 g/L, nicotinic acid 10 g/L, inositol 10 g/L, biotin 10 mg/L), minerals stock 0.1 ml (boric acid 5 g/L, MnSO4 4 g/L, ZnSO4·7H2O 4 g/L, FeCl2․6H2O 2 g/L, molybdic acid 0.4 g/L, KI 1 g/L, CuSO4․5H2O 0.4 g/L, citric acid 10 g/L, agar 18 g/L)] 배지에서도 동일한 방법으로 실험을 하여 항진균 활성을 알아보았다.
Disc diffusion method를 이용하여 각 분획과 분리하고 남은 수층을 YpD 고체배지에서 C. albicans에 대한 항진균 활성도를 비교·측정하였다.
고체배지에서와 액체배지에서 공통적으로 활성이 있는 4종의 지의류 내생곰팡이를 선정하고, 배양액을 chloroform, ethyl acetate 용매 순으로 추출하여 분획별로 분리하였으며, 증착시킨 후 유기용매층 분획물을 용해 시키기 위해 농축 마지막 단계에 에탄올을 넣어 질소로 dry시키고 100% 에탄올 700 μl에 재용해시킨 다음, 300 μl 증류수를 가하였다.
그 위에 날짜별로 배양한 지의류 내생곰팡이의 배양액을 지름 6 mm 크기로 만든 paper disc (Whatman, Cat. No. 1002185)에 300 µl씩 분주하여 충분히 말린 후 올려놓고, 30℃ incubator에서 24시간 배양하여 투명환의 크기를 비교·관찰하였다.
그리고 선정된 4종의 지의류 내생곰팡이의 분획별 농축액인 chloroform 3 µl, ethyl acetate 6 µl씩을 첨가하였다.
albicans에 대한 항진균 활성도를 비교·측정하였다. 또한 액체배지에서의 항진균 활성을 측정하기 위해 RPMI 1640(Simga, USA) 배지를 test tube에 3 ml 넣고, 각각 C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. lusitaniae, Cryptococcus neoformans 균주를 접종하고 30℃ shaking incubator에서 24시간 동안 배양하였다. 각 균주의 배양액을 RPMI 배지로 OD600 0.
모세관의 컬럼(5% phenylmethylsiloxane, 30 m × 0.25 mm i.d., 0.25 μm film)을 사용하여 분석을 하였다.
미리 배양한 C. albicans의 배양액(OD600 0.01)을 도말한 YpD 고체배지에 4종의 지의류 내생곰팡이의 날짜별 배양액을 얻어 300 µl씩 분주하여 지름 6 mm 크기의 paper disc (Whatman, USA)를 올려놓고, 30℃ incubator에서 24시간 배양하여 투명환의 크기를 관찰하였다.
미리 배양한 C. albicans의 배양액(OD600 0.1)을 YpD 고체배지(500 ml 기준: yeast extract 5 g, peptone 10 g, dextrose 10 g, agar 8 g)에 100 µl 분주한 후 멸균된 면봉을 이용하여 도말하였다.
지의류 내생곰팡이가 생성하는 항진균 물질의 활성을 액체배지에서도 알아보기 위해, 선정된 4종의 지의류 내생곰팡이의 조각을 MY 액체배지(yeast extract 3 g, malt extract 3 g, glucose 10 g, peptone 5 g, 멸균증류수 1 L)에 넣고 30℃ shaking incubator에서 날짜별로 배양하여 각각의 배양액을 얻었다.
지의류 내생곰팡이를 배양시킨 MYA 배지에 C. albicans의 배양액(OD600 0.1)을 100 µl 분주하여 멸균된 면봉을 이용하여 골고루 도말하였다.
대상 데이터
4 g/L, citric acid 10 g/L, agar 18 g/L)] 배지에서도 동일한 방법으로 실험을 하여 항진균 활성을 알아보았다. 2차적으로 선정된 9종의 지의류 내생곰팡이 성장속도와 투명환의 크기를 비교하여 4개의 균주 선정하였다.
고체배지에서와 액체배지에서 공통적으로 활성이 있는 4종의 지의류 내생곰팡이를 선정하고, 배양액을 chloroform, ethyl acetate 용매 순으로 추출하여 분획별로 분리하였으며, 증착시킨 후 유기용매층 분획물을 용해 시키기 위해 농축 마지막 단계에 에탄올을 넣어 질소로 dry시키고 100% 에탄올 700 μl에 재용해시킨 다음, 300 μl 증류수를 가하였다. 분획물은 액체배지에서 항균활성을 조사하기 위하여 배지에 약 3% 첨가 시 곰팡이 성장에 영향이 없는 70% ethanol 용액에 녹여 실험에 사용하였다. Disc diffusion method를 이용하여 각 분획과 분리하고 남은 수층을 YpD 고체배지에서 C.
순천대학교 지의류 은행(Lichen Bioresources Center)에서 571종의 지의류 내생 곰팡이를 분양받아 Candida albicans에 대한 항진균 활성을 조사하여 4종을 선정하였다. 선정된 4종의 지의류 내생 곰팡이의 배양액 내에 존재하는 항진균 활성을 알아보기 위해 disc diffusion method 방법을 이용한 결과 Stereocaulon sp.
순천대학교 지의류 은행(Lichen Bioresources Center)에서 571종의 지의류 내생곰팡이를 분양 받아 malt yeast extract agar (MYA : yeast extract 3 g, malt extract 3 g, glucose 10 g, peptone 5 g, agar 15 g) 배지에 지의류 내생곰팡이 조각을 올려 25℃ incubator에서 1–5일 정도 배양하였고, 4℃에 보관하였다.
지의류 내생곰팡이를 배양한 MYA 배지와 EMM 배지에 C. albicans의 배양액(OD600 0.01)을 100 µl 분주·도말하여 배양한 결과 분양받은 571종 중 활성이 좋은 12종의 지의류 내생곰팡이를 1차적으로 선별하였다(Figs. 1 and 2).
이론/모형
12종 곰팡이 중에서 선정된 4종의 지의류 내생곰팡이의 액체배지에서 생성하는 항진균 물질의 활성을 알아보기 위해 disc diffusion method를 이용하였다. 미리 배양한 C.
Mass spectrometer는 아래의 상태인 170℃에서 onization energy, 70 eV; m/z range, 45–600; scan cycle time, 1 sec; transfer line 수행하였다. Peak 분석은 mass spectral interpretation와 standard libraries를 기초로 하였다.
성능/효과
고체배지에서와 액체배지에서 공통적으로 활성이 좋은 지의류 내생 곰팡이 4종의 배양액을 chloroform, ethyl acetate 용매 순으로 추출하여 70% ethanol로 농축하였다. Disc diffusion method를 이용하여 각 추출물에 따른 고체배지(YpD)에서의 C. albicans의 항진균 활성도를 측정한 결과 4종 모두 chloroform 추출물에서 높은 활성도를 보였다(Fig. 4). 이 결과 지의류 내생곰팡이 추출물 간의 항균 활성의 차이점이 추출에 사용되는 용매에 따라 다르다는 것을 알 수 있었다.
고체배지에서와 액체배지에서 공통적으로 활성이 있는 지의류 내생 곰팡이 배양액의 chloroform, ethyl acetate 용매 추출물의 C. albicans의 항진균 활성도를 측정한 결과 4종 모두 chloroform 추출물에서 높은 활성도를 나타냈다. Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, Candida lusitaniae에 대한 항진균 활성은 Stereocaulon sp.
전체적으로 EMM 배지에서 지의류 내생곰팡이의 성장이 MYA 배지에서보다 좋지 않았다. 또한 MYA 배지에서 활성이 좋은 12종의 지의류 내생곰팡이는 EMM 배지에서도 활성이 좋은 반면에, MYA 배지에서 활성이 좋지 않은 종들은 EMM 배지에서도 활성이 좋지 않게 나타났다. Cryptosporiopsis diversispora.
5). 이 결과 4종의 지의류 내생곰팡이가 생성하는 항진균 활성 물질이 다르다고 추정되며, 저해하는 진균의 종도 다른 것을 알 수 있었다.
1 and 2). 이 결과 고체배지에서 지의류 내생곰팡이가 활성물질을 생성하여 진균인 C. albicans의 성장을 저해한다는 것을 알 수 있었다. 전체적으로 EMM 배지에서 지의류 내생곰팡이의 성장이 MYA 배지에서보다 좋지 않았다.
3 and Table 1). 이 결과 지의류 내생 곰팡이가 고체배지 뿐만 아니라 액체배지에서도 항진균 활성 물질을 생성함을 알 수 있었다.
4). 이 결과 지의류 내생곰팡이 추출물 간의 항균 활성의 차이점이 추출에 사용되는 용매에 따라 다르다는 것을 알 수 있었다. 또한 추출하고 남은 수층에서는 항균활성을 거의 볼 수 없었는데, 아마도 지의류 내생곰팡이의 항진균 활성 물질의 대부분이 불용성이거나 물에 대한 용해도가 낮기 때문이라고 추정된다.
albicans의 성장을 저해한다는 것을 알 수 있었다. 전체적으로 EMM 배지에서 지의류 내생곰팡이의 성장이 MYA 배지에서보다 좋지 않았다. 또한 MYA 배지에서 활성이 좋은 12종의 지의류 내생곰팡이는 EMM 배지에서도 활성이 좋은 반면에, MYA 배지에서 활성이 좋지 않은 종들은 EMM 배지에서도 활성이 좋지 않게 나타났다.
후속연구
, 2010; Hashem2011). 다른 분석물질로 hexadecanonic acid-methyl ester, 14-octadecenoic acid-methyl ester, octadecenoic acid-methyl ester는 본 연구에서 새롭게 밝혀진 화합물로써 항진균 활성에 대한 연구가 요구된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
다양한 효능을 가진 지의류에서 생성되는 1차, 2차 대사산물 합성을 누가 하는가?
또한 미국 농무부 농업연구소(ARS)는 최근 연구결과 usnic acid가 카로티노이드 합성을 억제함으로서 새로운 천연물 제초제로 이용 가능하다는 보고를 하였으며, 이러한 지의류 탄닌 성분들은 항히스타민, 항바이러스, 항세균 활성도 높은 것으로 알려지고 있다. 이러한 화합물의 대부분은 지의류만이 가지고 있으며 주로 지의류 내생 곰팡이가 합성하는 것으로 알려지고 있다(Kamer et al., 1995; John et al.
지의류란?
지의류(Lichens)는 세계적으로 가장 널리 분포하는 진핵생물 중 하나로 “곰팡이와 광합성을 하는 공생체의 연합체이며, 특별한 구조를 지닌 지의체(Thallus)라는 안정된 생장체를 형성하는 것”이라고 정의된다. 지의류는 단독 생명체가 아니라 종속영양체인 곰팡이(fungi)와 광합성을 통해 먹이를 생산할 수 있는 독립영양체인 녹조류(green algae), 남조류(cyanobacteria) 또는 녹조와 남조 모두 공생 관계를 유지하고 있는 생명체이다.
지의류가 생산하는 usnic acid가 천연 제초제로 사용될 수 있는 이유는 어떤 기능 때문입니까?
지의류에서 생성되는 1차, 2차 대사산물들은 약리적 작용이 뛰어난 것으로 알려지고 있으며, 대표적으로 usnic acid와 같은 탄닌 성분들은 항균작용이 매우 우수한 천연물질로 밝혀졌다. 또한 미국 농무부 농업연구소(ARS)는 최근 연구결과 usnic acid가 카로티노이드 합성을 억제함으로서 새로운 천연물 제초제로 이용 가능하다는 보고를 하였으며, 이러한 지의류 탄닌 성분들은 항히스타민, 항바이러스, 항세균 활성도 높은 것으로 알려지고 있다. 이러한 화합물의 대부분은 지의류만이 가지고 있으며 주로 지의류 내생 곰팡이가 합성하는 것으로 알려지고 있다(Kamer et al.
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