[논문]세포주에 따른 담배연기응축물의 소핵생성 비교

신한재; 손형옥; 이영구; 이동욱; 현학철

[국내논문] 세포주에 따른 담배연기응축물의 소핵생성 비교
Comparison of Micronulcleus Induction of Cigarette Smoke Condensate in Various Cell Lines 원문보기

한국연초학회지 = Journal of the Korean society of tobacco science, v.25 no.2, 2003년, pp.128 - 136

신한재 (KT&G 중앙연구원) , 손형옥 (KT&G 중앙연구원) , 이영구 (KT&G 중앙연구원) , 이동욱 (KT&G 중앙연구원) , 현학철 (KT&G 중앙연구원)

Abstract ▼ AI-Helper

Although tobacco smoke has been known to have genotoxicity as well as cytotoxicity, the sensitivity of the cell lines used against cigarette smoke is poorly understood. The objective of this study was to evaluate and compare the genotoxicity of several cell lines, which are routinely used in the in vitro assays, with cigarette smoke condensate(CSC) of Kentucky Reference Cigarette 1R4F. In the micronucleus(MN) induction assays, murine(CHO-K1, V79, BALB/c 3T3) cell lines and human(MCF-7, A549) ones were used. As a result, the CSC exhibited cytotoxicity with a concentration-dependent response in all cell lines. EC$_{50}$ of CSC in CHO-K1, V79, BALB/c 3T3, MCF-7 and A549 were 140, 125, 100, 116 and 109 $\mu\textrm{g}$/mL, respectively. On the other hand, the spontaneous micronucleated cell(MNC) frequency was stable and reproducible in every cell lines tested in this study. The dose-response of various cell lines to the induction of MN by CSC was estimated using linear regression analysis. CSC(0～100 $\mu\textrm{g}$/mL) caused a dose-dependent MN induction in CHO-K1, V79, BALB/c 3T3 and MCF-7 cell lines. Putting together all the data obtained and linear regression analysis of the data, we concluded that V79 cells are more susceptible to the accurate assessment of CSC-induced MN than the others.s.

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AI 본문요약
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문제 정의

따라서 제품 담배의 품질을 평가함에 있어서도 성분 중심의 감소 방안과 더불어, 실제적으로 생체에 영향을 측정할 수 있는 생물학적 안전성 평가의 필요성이 증대되고 있다. 본 연구에서는 CORESTA가 추진 중인 3가지 in vitro 안전성 평가 방법 중의 하나이며, 아직 guideline이 설정되지 않은 소핵 시험법에 초점을 맞추어, 이 방법에 사용 가능한 5종의 세포주를 대상으로 표준담배(K1R4F)의 CSC에 대한 세포 독성 및 소핵 시험을 수행하여 세포주별 소핵생성 빈도수를 비교 평가함으로서, 소핵시험에 적용할 수 있는 적정 세포주를 선택하고자 하였다.
본 연구에서는 표준 담배(K1R4F)의 연기 응축물(CSC)에 대하여 5가지 세포주(human: MCF-7, A549, Murine: CHO-K1, V79, BALB/c 3T3)를 이용해서 세포독성과 유전독성을 비교 조사하였다. 독성평가를 위해 본 실험에서는 MTS법(세포 독성)과 소핵 시험법(유전 독성)을 사용하였다.

제안 방법

, 2001). 본 연구에서는 Kentury Reference 1R 4F의 연기 응축물(CSC)에 대하여 5가지 세포주(human: MCF-7, A549, Murine: CHO-K1, V79, BALB/c 3T3)를 이용해서 세포 독성 및 소핵시험을 수행하여 담배 시료에 대한 susceptibility 등을 비교 평가하였다.
담배 연기 응축물(CSC)은 표준담배(Kentucky reference cigarette 1R4F) 20개피를 RM20/CS 흡연 장치(Heinr Borgwaldt, Germany)를 이용하여 CORESTA 표준 흡연조건(puff volume: 35 mL, puff frequency: 60 sec, puff duration: 2 sec) 하에서 연소시키고, 92 mm Cambridge filter pad를 이용하여 포집하였다. 적당량의 DMSO를 이용해서 filter pad로부터 CSC를 추출해서 농도가 10 mg/mL이 되도록 한 후 -70℃에 보관하면서 시험에 사용하였다.
2%)로 하였다. 시료의 처리 시간은 설치류 유래세포(CHO-K1, V79, BALB/c 3T3)의 경우 24시간 동안 시료를 처리하였으며, 사람 유래세포(MCF-7, A549)의 경우 24시간 시료처리 후 보통 배양액으로 24시간 더 배양(24±24 h)하였다.
시험물질 처리 후 24 시간(설치류 유래세포) 또는 48시간(사람 유래세포)에 세포의 각 well 당 MTS 용액 20μL를 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 배양한 후 microplate reader(BIO-TEK, USA)를 사용해서 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 모든 시험 결과는 세포를 배양하지 않은 well에서 측정된 흡광도에 대하여 보정하였으며, 흡광도는 시험물질이 처리되지 않은 대조군과 비교하여 생존율로 환산하였다. 세포독성은 50%의 세포를 사멸시키는 시험물질의 농도(EC_{세포독성 시험에서 결정된 세포독성 농도(EC₅₀)를 참고하여 4단계의 농도를 세포에 처리해서 소핵시험을 수행하였다. 또한 대조군은 DMSO(1 또는 1.}

수행하였다. 또한 대조군은 DMSO(1 또는 1.2%)를 처리하였다. 설치류 유래세포(1.

2%)를 처리하였다. 설치류 유래세포(1.2×10⁴ cells) 또는 사람유래세포(1.0×10⁴ cells)를 chamber slide platefNunc, Denmark)에 이식해서 1일간 배양 후, 시험물질을 처리하여 24시간(설치류유래세포) 또는 48시간(사람유래세포) 배양하였다. 그 후 PBS로 세척하고, 0.

75 M KC1 용액을 넣어 4℃에서 5분간 배양하였다. 상등액 제거 후 고정액(methanol : acetic acid=3:l)으로 세포들을 고정시킨 다음 공기 건조법으로 슬라이드를 제작하여 5% Gimsa 용액으로 30분간 염색하였다. 한 시험 농도당 1000개의 세포를 광학 현미경(Nikon microphot FXA, Japan)을 이용하여 ×1000 배율로 판독하여 소핵 세포를 판독하였다.

상등액 제거 후 고정액(methanol : acetic acid=3:l)으로 세포들을 고정시킨 다음 공기 건조법으로 슬라이드를 제작하여 5% Gimsa 용액으로 30분간 염색하였다. 한 시험 농도당 1000개의 세포를 광학 현미경(Nikon microphot FXA, Japan)을 이용하여 ×1000 배율로 판독하여 소핵 세포를 판독하였다. 정상핵의 1/3 크기의 핵을 소핵으로 판정했으며, 하나이상의 소핵을 가지고 있는 세포를 소핵 세포로 계수하였다.

한 시험 농도당 1000개의 세포를 광학 현미경(Nikon microphot FXA, Japan)을 이용하여 ×1000 배율로 판독하여 소핵 세포를 판독하였다. 정상핵의 1/3 크기의 핵을 소핵으로 판정했으며, 하나이상의 소핵을 가지고 있는 세포를 소핵 세포로 계수하였다.

설치류 유래세포인 CHO-Kl, V79 와 BALB/c 3T3 세포에 대한 담배연기 응축물(CSC) 농도에 따른 세포독성을 조사하였다. CSC 150 0g/mL을 최고 농도로 해서 단계적으로 희석하여 세포독성 시험을 실시한 결과, 모든 세포주에서 농도 의존적으로 세포독성이 증가 되었고(Fig.

MTS 세포 독성 측정 방법에 의한 결과를 근거로, 1R4F 표준담배의 CSC 농도별에 따른 각 세포주별 소핵생성을 조사하였다. CHO-K1, V79, BALB/c 3T3, MCF-7과 A549 등 5개 세포주에서의 자발적 소핵생성율은 각각 2.

모든 실험에서 사용되는 대조군은 최고 농도의 CSC에 첨가된 DMSO농도(1.0 또는 1.2%)로 하였다. 시료의 처리 시간은 설치류 유래세포(CHO-K1, V79, BALB/c 3T3)의 경우 24시간 동안 시료를 처리하였으며, 사람 유래세포(MCF-7, A549)의 경우 24시간 시료처리 후 보통 배양액으로 24시간 더 배양(24±24 h)하였다.

대상 데이터

RPMI 1640 medium(RPMI), Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS), L-glutamine, penicillin/streptomycin solution, PBS 등은 GIBCO(Grand Island, NY, USA) 제품을 사용하였다. Dimethysulfoxide(DMSO), mitomycin C(MMC), Gimsa 등은 Sigma(St, Louis, USA) 제품을 사용하였고, 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethox yphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium(MTS) 는 Promega(St, WI, USA) 제품을 사용하였다.
Dimethysulfoxide(DMSO), mitomycin C(MMC), Gimsa 등은 Sigma(St, Louis, USA) 제품을 사용하였고, 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethox yphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium(MTS) 는 Promega(St, WI, USA) 제품을 사용하였다.
In vitro 실험을 위해 사용할 Chinese hamster ovary cells(CHO-Kl)을 한국세포주은행(KCLB)으로부터 분양받아 사용하였으며 세포주기는 14±2시간이다. Chinese hamster lung fibroblast V79(V79)와 mouse embryo BALB/c 3T3(BALB/c3T3)은 American Type Culture Collection(ATCC)으로부터 분양 받아 사용하였으며 세포주기는 각각 14±2와 20±3시간이다.
Chinese hamster lung fibroblast V79(V79)와 mouse embryo BALB/c 3T3(BALB/c3T3)은 American Type Culture Collection(ATCC)으로부터 분양 받아 사용하였으며 세포주기는 각각 14±2와 20±3시간이다. CHO-K1세포의 배양액은 10% FBS와 100U penicillin/mL, 100㎍ streptomycin/mL을 포함한 RPMI를 사용하였다.
Chinese hamster lung fibroblast V79(V79)와 mouse embryo BALB/c 3T3(BALB/c3T3)은 American Type Culture Collection(ATCC)으로부터 분양 받아 사용하였으며 세포주기는 각각 14±2와 20±3시간이다. CHO-K1세포의 배양액은 10% FBS와 100U penicillin/mL, 100㎍ streptomycin/mL을 포함한 RPMI를 사용하였다. V79와 BALB/c 3T3 세포는 10% FBS, 100 U penicillin/mL, 100㎍ streptomycin/mL와 2 mM L-glutamine이 포함된 DMEM을 사용하였다.
CHO-K1세포의 배양액은 10% FBS와 100U penicillin/mL, 100㎍ streptomycin/mL을 포함한 RPMI를 사용하였다. V79와 BALB/c 3T3 세포는 10% FBS, 100 U penicillin/mL, 100㎍ streptomycin/mL와 2 mM L-glutamine이 포함된 DMEM을 사용하였다. 배양된 세포는 2~3일마다 0.
사람 유래 세포로서 human breast carcinoma MCF-7(MCF-7) 과 human lung carcinoma A549(A549) 세포는 KCLB로부터 분양 받았으며 세포주기는 30±3시간이다. MCF-7 cells과 A549 cells의 배양액은 10% FBS, penicillin streptomycin이 포함된 RPMI 배지를 사용하였다.
30±3시간이다. MCF-7 cells과 A549 cells의 배양액은 10% FBS, penicillin streptomycin이 포함된 RPMI 배지를 사용하였다. 배양된 세포는 3〜4일마다 0.
03% EDTA용액을 이용하여 계대 유지하였다. 모든 세포주의 자연 발생적 돌연변이의 생성을 최소화하고자 구입 후부터 10번 미만으로 계대 배양한 세포만을 실험에 사용하였다. 배양은 CO₂ 배양기 (VISION사.
모든 세포주의 자연 발생적 돌연변이의 생성을 최소화하고자 구입 후부터 10번 미만으로 계대 배양한 세포만을 실험에 사용하였다. 배양은 CO₂ 배양기 (VISION사. Korea)를 이용하여 포회 습도 하에서 37℃, 5% CO₂ 상태로 배양하였다.

데이터처리

모든 측정값은 평균값±표준편차로 표시하였으며 SPSS(version 10.0) 통계 프로그램을 이용하여 one way ANOVA test를 실시하였고, 유의한 차이가 인정되는 경우 Dunnefs multiple-range test를 통해서 p<0.05 및 p<0.01 의 수준에서 처리군과의 유의성을 검정하였다. 시료의 농도별 소핵세포 생성율에 관한 용량 상관성은 선형 회귀분석을 통해서 측정하였다.
01 의 수준에서 처리군과의 유의성을 검정하였다. 시료의 농도별 소핵세포 생성율에 관한 용량 상관성은 선형 회귀분석을 통해서 측정하였다.
6㎍/mL인데도 불구하고, 80㎍/mL 이상의 농도에서 소핵세포가 오히려 감소했다. 소핵 세포주별 소핵 생성율을 비교하고자 선형 회귀분석을 실시하였다. Table 4의 회귀식에서 볼 수 있는 것처럼, 단위 CSC(㎍/mL)당 소핵 생성 빈도수가 V79 세포주의 경우 0.

이론/모형

세포독성 시험

시험물질의 세포독성 농도를 구하고자 미토콘드리아 탈수소효소의 활성지수를 나타내는 MTS 비색 환원방법을 사용하였다. 설치류 유래세포(5×10³ cells) 또는 사람 유래세포(2.
유전 독성 평가에 이용되는 in vitro 소핵 시험은 염색체 수준에서 유전 독성을 검색할 수 있는 간단하면서도 경제적인 시험법이며(Fenech and Morley, 1985; Kirsch-Volders et al., 1997), 세포질 분열만 선택적으로 억제할 수 있는 cytochalasin B의 처리 유·무에 따라 세포질 분열 억제 소핵시험과 일반 소핵시험으로 구분되어지며(Fenech, 1993), 본 실험에서는 일반 소핵시험을 이용하였다. 최근에는 다양한 probe를 사용하는 형광 면역 염색법(FISH)을 이용하여 clastogen과 aneugen을 정확하게 분석해 낼 수 있게 되었다(Zijno et al.
조사하였다. 독성평가를 위해 본 실험에서는 MTS법(세포 독성)과 소핵 시험법(유전 독성)을 사용하였다. CSC 처리 시(0〜150μg/mL) 모든 세포주에서 농도 의존적으로 세포독성이 증가되었다.

성능/효과

세포독성을 조사하였다. CSC 150 0g/mL을 최고 농도로 해서 단계적으로 희석하여 세포독성 시험을 실시한 결과, 모든 세포주에서 농도 의존적으로 세포독성이 증가 되었고(Fig. 1), CHO-K1, V79와 BALB/c 3T3 세포주별 CSC의 EC₅₀는 각각 140, 125와 100㎍/mL이었다(Table 1). 사람 유래 세포인 MCF-7과 A549 세포의 경우에서도 농도 의존적으로 세포독성이 증가되었고(Fig.
1), CHO-K1, V79와 BALB/c 3T3 세포주별 CSC의 EC₅₀는 각각 140, 125와 100㎍/mL이었다(Table 1). 사람 유래 세포인 MCF-7과 A549 세포의 경우에서도 농도 의존적으로 세포독성이 증가되었고(Fig. 2), CSC의 EC는 각각 116.2와 109.6㎍/mL으로 측정되었다 (Table 1).
소핵생성을 조사하였다. CHO-K1, V79, BALB/c 3T3, MCF-7과 A549 등 5개 세포주에서의 자발적 소핵생성율은 각각 2.4, 1.8, 2.3, 1.3과 3.0%로서 설치류 유래세포추에서는 V79 세포주가 가장 낮았으며, 전체적으로는 MCF-7 세포가 1.3%로 가장 낮았다(Table 2, Table 3). CSC의 농도별 처리 시 CHO-K1, V79와 BALB/c 3T3에서 농도 의존적으로 소핵생성 세포수가 증가하였고(Table 2), 회귀분석을 이용하여 세포주별 소핵생성 빈도수(회귀식의 기울기)를 계산한 결과, 각각 0.
3%로 가장 낮았다(Table 2, Table 3). CSC의 농도별 처리 시 CHO-K1, V79와 BALB/c 3T3에서 농도 의존적으로 소핵생성 세포수가 증가하였고(Table 2), 회귀분석을 이용하여 세포주별 소핵생성 빈도수(회귀식의 기울기)를 계산한 결과, 각각 0.507, 0.904와 0.523으로 V79 세포주가 가장 높았으며, 각 세포주별 CSC의 용량 상관관계를 조사한 결과, 상관계수(R)가 0.8이상이었다(Table 4). 사람 유래세포인 MCF-7과 A549 세포에 대해서 CSC 농도별로 각각 처리해서 48시간 후 소핵 세포수를 측정한 결과, MCF-7 세포에서 농도의존적으로 소핵 세포수가 증가하였고(Table 3), CSC 농도별 소핵 세포 생성에 관한 용량 상관성도 높았다(Table 4).
8이상이었다(Table 4). 사람 유래세포인 MCF-7과 A549 세포에 대해서 CSC 농도별로 각각 처리해서 48시간 후 소핵 세포수를 측정한 결과, MCF-7 세포에서 농도의존적으로 소핵 세포수가 증가하였고(Table 3), CSC 농도별 소핵 세포 생성에 관한 용량 상관성도 높았다(Table 4). A549 세포의 경우 CSC 40㎍/mL 처리시 소핵 세포가 대조군에 비해 증가되었으나 80㎍/mL 이상의 농도에서는 오히려 소핵세포 생성율이 감소하였다.
일반적으로 소핵 시험은 EC₅₀을 최고 농도로 하여 수행한다. CSC의 세포독성(EC₅₀)을 측정한 결과, 설치류 유래세포(CHO-K1, V79와 BALB/c 3T3)는 각각 140, 125와 100 ㎍/mL이었으며, 사람 유래세포주(MCF-7과 A549)의 경우는 각각 116.2와 109.6㎍/mL이었다. CSC의 독성은 대사 활성제(이물질 대사 효소)의 유·무에 따라 차이를 나타내므로(Doolittle et al.
CHO-K1, V79, BALB/c 3T3, MCF-7과 A549 등 5종의 세포주에 대한 CSC 농도별 소핵 시험을 실시한 결과, A549 세포주를 제외한 모든 세포주에서 농도의존적으로 소핵 세포수가 유의적으로 증가하였다. A549 세포주의 경우는 CSC에 대한 세포독성(EC₅₀)이 109.
바람직하다. 또한 담배시료의 유전독성 유·무판별이 아니라, 담배 시료별 유전독성의 정도를 비교 평가하기 위해서는 담배시료에 민감성(susceptibility)이 높은 세포주 선택이 중요하기 때문에, V79 세포를 이용하여 담배시료의 소핵 생성 시험을 수행하는 것이 효율적이라 사료된다.
독성평가를 위해 본 실험에서는 MTS법(세포 독성)과 소핵 시험법(유전 독성)을 사용하였다. CSC 처리 시(0〜150μg/mL) 모든 세포주에서 농도 의존적으로 세포독성이 증가되었다. CSC에 대한 EC₅₀ 은 CHO-K1, V79, BALB/c 3T3, MCF-7과 A549 세포에서 각각 140, 125, 100, 116과 109㎍/mL로 나타났다.
CSC에 대한 EC₅₀ 은 CHO-K1, V79, BALB/c 3T3, MCF-7과 A549 세포에서 각각 140, 125, 100, 116과 109㎍/mL로 나타났다. 한편 각각의 세포주에서의 자발적인 소핵 생성율은 일정했으며, CSC를 각각의 세포주에 처리(0〜100㎍/mL) CHO-K1, V79, BALB/c 3T3와 MCF-7 세포에서 농도의존적으로 소핵 생성이 증가되었다. 회귀분석을 이용하여 세포주별 CSC의 용량 상관관계를 조사한 결과, 상관계수(R)가 0.
한편 각각의 세포주에서의 자발적인 소핵 생성율은 일정했으며, CSC를 각각의 세포주에 처리(0〜100㎍/mL) CHO-K1, V79, BALB/c 3T3와 MCF-7 세포에서 농도의존적으로 소핵 생성이 증가되었다. 회귀분석을 이용하여 세포주별 CSC의 용량 상관관계를 조사한 결과, 상관계수(R)가 0.8 이상이었고, 소핵생성 빈도수(회귀식의 기울기)는 V79 세포가 0.904로서 가장 높았다. 이상의 결과로부터, 담배시료의 소핵생성 평가에는 민감성(susceptibility)이 높은 V79 세포를 이용하는 것이 효율적일 것으로 사료된다.
904로서 가장 높았다. 이상의 결과로부터, 담배시료의 소핵생성 평가에는 민감성(susceptibility)이 높은 V79 세포를 이용하는 것이 효율적일 것으로 사료된다.

후속연구

향후 덜 해로운 담배 개발에 적용하기 위해서는 담배별, 잎담배별, 사용재료별 유전독성의 정도를 비교 평가하는 것이 중요하기 때문에, 담배 시료에 대해서 소핵생성 빈도가 큰 세포주를 이용하는 것이 바람직하다. 또한 담배시료의 유전독성 유·무판별이 아니라, 담배 시료별 유전독성의 정도를 비교 평가하기 위해서는 담배시료에 민감성(susceptibility)이 높은 세포주 선택이 중요하기 때문에, V79 세포를 이용하여 담배시료의 소핵 생성 시험을 수행하는 것이 효율적이라 사료된다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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