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문제 정의
- 세포질분열억제 소핵시험 (CBMN assay)은 일반 소핵시험 (MN assay)에 비해 민감성이 높고, 시험물질에 의한 유전독성을 보다 정확하게 측정할 수 있지만, cytochalasin B 자체가 세포독성이 있으므로 적절한 시험조건을 확립해야 한다는 단점이 있다 (Fenech, 2000).본 연구에서는 표준담배(Kentury Reference Cigarette,2R4F)의 담배연기 응축물에 대하여 일반 소핵시험과 세포질분열 억제 소핵시험을 수행하여, 두 시험 간 소핵생성 측정의 민감성을 비교 평가하였다.
제안 방법
- 모든 실험에서 사용되는 대조군은 최고 농도의 CSC에 첨가된 DMSO(1.0 또는 0.75%) 처리군으로 하였다. CSC의 처리 시간은 단기 처리인 경우 대사 활성계(S-9 mix) 유.
- 유기용 매 용액(50% ethanol-1% acetic acid) 100 M을 첨가해서 실온에서 15분간 neutral red 를 추출한 후 microplate reader (BIO-TEK, USA)를 사용해서 540 run에서 흡광도를 측정하였다. 모든 시험 결과는 세포를 배양하지 않은 well에서 측정된 흡광도에 대하여 보정하였으며, 흡광도는 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 생존율로 변환하였다.
- 상등액을 제거한 후 고정9^(methanol:acetic acid= 3:1)으로 세포들을 고정시킨 다음 공기 건조법으 로 슬라이드를 제작하여 5% Giemsa 용액으로 30분간 염색하였다. 양성대조군으로는 각변이원 물질의 특성에 따라 대사 활성계 미적용 시(직접법) 에서는 MMC(0.5 ug/mL)을, 대사 활성계 적용시에 는 cyclophosphamide(5ug/mL)을 사용하였다. 일반 소핵시험에서는 시험 농도당 1,000개의 세포를 광학현미경 (Nikon microphot FXA, Japan)을 이용하여 X 1,000배율에서 소핵세포를 판독하였고, 세포질분열억제 소핵시험에서는 2개 이상의 핵을 가진 세포(500개)에서 소핵세포를 계수하였다.
- 일반 소핵시험에서는 시험 농도당 1,000개의 세포를 광학현미경 (Nikon microphot FXA, Japan)을 이용하여 X 1,000배율에서 소핵세포를 판독하였고, 세포질분열억제 소핵시험에서는 2개 이상의 핵을 가진 세포(500개)에서 소핵세포를 계수하였다. 정상핵의 1/3 크기의 핵을 소핵으로 판정하엿으며, 하나 이상의 소핵을 가지고 있는 세포를 소핵세포로 계수하였다.
- 소핵시험에서 V79 세포의 배양시간은, Krishna 등(1989)이 Cytochalasin B에 의해서 2핵 세포수가 최대가 되는 세포주기(14±2시간) 및 세포주기 kinetic 분석을 통하여 적당하다고 보고한 15시간 으로 하였다. 세포질분열 억제 소 핵시험에 사용되는 cytochalasin B의 적정 농도를 결정하기 위해 V79 세포에 대한 cytochalasin B의 농도별 세포 독 성 및 2핵을 가진 세포의 수를 조사하였다. 4 ug/mL의 cytochalasin B 를 최고 농도로 하여 단계적으로 희석하여 세포독성을 측정한 결과, 1~4 <zg/ mL 농도에서 농도의존적으로 세포독성이 증가되었다 (Fig.
- , 1991).본 연구의 세포질분열 억제 소 핵시험에 사용되는 cytochalasin B의 농도는 2핵세포 생성비율이 높으면서도 (55%), 세포독성이 약한 1 ug/mL으로 정하였다.
- In vitro 소핵시험에서 화학물질의 처리 방법은 단기 처리(2~6 h) 또는 장기 처리(20~24 h)가 있으며, 단기처리시에는 대사 활성계를 함께 처리하는 대사 활성법과 직접법(대사활성계 미적용) 등이 있다. 본 연구에서는 neutral red 세포독성 측정 방법에 의한 독성결과를 근거로(data not shown)하여, 일반 소핵시험과 세포질 억제 소핵시험에서 CSC에 대한 소핵생성을 비교하기 위하여 단기와 장기 처리 두 방법을 다 적용하여 수행하였다. Fig.
- 본 연구에서는 V79 Chinese hamster lung 세포주를 이용하여 표준담배(2R4F)의 연기응축물(CSC)에 대한 일반소핵시험과 세포질분열 억제 소핵시험간에 민감성을 비교평가하였다. 세포질분열 억제 소핵시험을 위해 사용되는 적절한 cytochalasin B 농도를 결정하기 위해 V79 세포에 대한 cytochalasoin B 의 농도(0~4 ug/mL)에 따른 세포 독성과 2핵 세포 의 수를 조사하였다.
- 본 연구에서는 V79 Chinese hamster lung 세포주를 이용하여 표준담배(2R4F)의 연기응축물(CSC)에 대한 일반소핵시험과 세포질분열 억제 소핵시험간에 민감성을 비교평가하였다. 세포질분열 억제 소핵시험을 위해 사용되는 적절한 cytochalasin B 농도를 결정하기 위해 V79 세포에 대한 cytochalasoin B 의 농도(0~4 ug/mL)에 따른 세포 독성과 2핵 세포 의 수를 조사하였다. 1 ug/mL cytochalasin B 처리 시 세포 생존율과 2핵을 가진 세포의 비율이 각각 약 95%와 55 %로 나타났으며, 이와 같은 결과로부터 세포질분열 억제 소핵시험을 위해 사용되는 cytochalasin B의 농도는 1 ug/mL로 결정하였다.
- 무와 관계없이 4시간 처리 후 새로운 배양액으로 교환하여 15시간 더 배양하였다. 장기 처리인 경우 대사 활성계 없이 CSC만을 첨가해서 19시간 배양 후 세포독성 및 소핵생성을 측정하였다. 세포질분열 억 제소핵시험에서는 세포배양이 끝나기 15시간 전에 cytochalasin B 를 첨가하였다.
대상 데이터
- Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS), L-glutainine, penicillin/ streptomycin solution, phosphate-buffered saline (PBS) 등은 GIBCO(Grand Island, NY, USA) 제품을 사용하였다. Dimethysulfoxide(DMSO), mitomycin C(MMC), colchicine, cyclophosphamide, Giemsa, nuetral red 등은 Sigma(St, Louis, USA) 제품을 사용하였다.
- Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS), L-glutainine, penicillin/ streptomycin solution, phosphate-buffered saline (PBS) 등은 GIBCO(Grand Island, NY, USA) 제품을 사용하였다. Dimethysulfoxide(DMSO), mitomycin C(MMC), colchicine, cyclophosphamide, Giemsa, nuetral red 등은 Sigma(St, Louis, USA) 제품을 사용하였다. 대사 활성계(S-9 mix)와 cytochalasin B는 Moltox (Boone, NC, USA) 제품을 사용하였고, 대사 활성계에 사용된 cofactor는 Wako Pure Chem.
- 대사 활성계(S-9 mix)와 cytochalasin B는 Moltox (Boone, NC, USA) 제품을 사용하였고, 대사 활성계에 사용된 cofactor는 Wako Pure Chem.(Tokyo, Japan)에서 구입하였다. 그 외의 유기용매들은 특급시약을 사용하였다.
- 실험에 사용한 V79 Chinese hamster lung fibroblast(V79) 세포주는 한국 세포주은행(KCLB)으로부터 분양받아 사용하였으며, 세포주기는 14±2시간이다. V79 세포는 10% FBS, 100 U penicillin/mL, 100 ug streptomycin/mL와 2 mM L-glutamine이 포함된 DMEM 배양액을 사용하였다.
- 실험에 사용한 V79 Chinese hamster lung fibroblast(V79) 세포주는 한국 세포주은행(KCLB)으로부터 분양받아 사용하였으며, 세포주기는 14±2시간이다. V79 세포는 10% FBS, 100 U penicillin/mL, 100 ug streptomycin/mL와 2 mM L-glutamine이 포함된 DMEM 배양액을 사용하였다. 배양된 세포는 2~3일마다 0.
- 03% EDTA용액을 이용하여 계대유지하였다. 세포주의 자연 발생적 돌연변이 생성을 최소화하고 자 구입 후부터 10번 미만으로 계대 배양한 세포만을 실험에 사용하였다. 배양은 CO2 배양기(VISION.
데이터처리
- 모든 측정값은 평균값 ± 표준편차로 표시하였으며, SPSS(version 10.0) 통계 프로그램을 이용하여 one way ANOVA test를 실시하였고, 사후검정으로는 Dunnefs multiple-range test 를 통해서p<Q05의 수준에서 처리군과의 유의성을 검정하였다. 시료의 농도별 소핵세포 생성율에 관한 용량 상관성은 선형 회귀분석을 통하여 판정하였다.
- 0) 통계 프로그램을 이용하여 one way ANOVA test를 실시하였고, 사후검정으로는 Dunnefs multiple-range test 를 통해서p<Q05의 수준에서 처리군과의 유의성을 검정하였다. 시료의 농도별 소핵세포 생성율에 관한 용량 상관성은 선형 회귀분석을 통하여 판정하였다.
- 소핵시험별 처리 방법에 따른 소핵생성율을 비교하고자 선형 회귀분석을 실시하였다. Table 1의 회귀식에서 나타난 바와 같이, 단기 처리와 장기 처리 모두 세포질 억제 소핵시험이 일반 소핵시험보다 소 핵생성 빈도수가 높았다.
이론/모형
- Cytochalasin B 및 시험물질의 세포독성은 리소 좀에 의한 neutral red 흡수정도를 측정하는 neutral red cytotoxicity assay 방법을 사용하였다 (Borenfreund and Puemer, 1985). V79 세포(lx 10, cells)를 96 well plate(n=3)에 이식해서 24시간동안 배양한 후 시험물질을 처리하였다.
성능/효과
- 세포질분열 억제 소 핵시험에 사용되는 cytochalasin B의 적정 농도를 결정하기 위해 V79 세포에 대한 cytochalasin B의 농도별 세포 독 성 및 2핵을 가진 세포의 수를 조사하였다. 4 ug/mL의 cytochalasin B 를 최고 농도로 하여 단계적으로 희석하여 세포독성을 측정한 결과, 1~4 <zg/ mL 농도에서 농도의존적으로 세포독성이 증가되었다 (Fig. 1).
- 1 ug/mL의 cytochalasin B 처리 시 세포 생존율이 약 95%이었으나, 4 ug/mL 처리 시 세포 생존율은 약 70%로 감소되었다. Neutral red cytotoxicity 측정에 의한 결과를 근거로, cytochalasin B 농도별(0~3 ug/mL) 2핵 세포 최적수를 조사한 결과, 0.
- 1 ug/mL의 cytochalasin B 처리 시 세포 생존율이 약 95%이었으나, 4 ug/mL 처리 시 세포 생존율은 약 70%로 감소되었다. Neutral red cytotoxicity 측정에 의한 결과를 근거로, cytochalasin B 농도별(0~3 ug/mL) 2핵 세포 최적수를 조사한 결과, 0.75 ug/mL 이상에서 2핵 세포수가 증가하기 시작하였으며, 세포독성이 약한 농도인 1 ug/mL 처리했을때 2핵세포의 비율이 약 55 %로 나타났으며, 1 ug/mL 이상의 농도에서 2핵세포의 비율은 증가되지 않았다 (Fig. 2).정해진 농도(4.
- 예비 독성시험에서 결정된 약 50% 이하 세포독성을 가지는 4단계의 농도(0, 25, 50, 75 ug/mL) 로 CSC를 단기 처리(4 h) 한 후, 일반 소핵시험과 세포질분열억제 소핵시험의 소핵세포 생성율을 비교한 결과, 두 시험법 모두에서 CSC 처리 농도가 증가함에 따라 소핵세포가 증가되는 것을 확인하였다(Fig. 4). 일반소핵시험과 세포질분열억제소 핵시험에서의 자발적 소핵세포 생성율은 각각 2.
- 4). 일반소핵시험과 세포질분열억제소 핵시험에서의 자발적 소핵세포 생성율은 각각 2.1±0.3%와 3.6±2.0% 이었으며, CSC 75 ug/mL 처리시 소핵세포 생성율 각각 4.1±0.8%와 9.6±1.5%로, 세포질분열억제 소핵시험시 소핵생성율이 높게 나타났다. 두 방법 간에 소핵생성율의 차이는 소핵세포를 관찰하는 시점이 세포분열 전·후의 차이로서, 일반소핵시험의 경우는 세포분열(2배의 세포수) 후에 소핵을 측정하기 때문에 핵분열시 생성된 소핵은 일반적으로 소핵을 가지지 않은 세포와 소핵을 가진 세포로 양분된다.
- 또한 세 포의 핵분열시 나타나는 소핵은 세포질 분열 등을 거치면서 세포의 복귀 시스템에 의해 제거될 가능성이 있음으로 일반 소핵시험보다 세포질분열억제 소핵시험에서 소핵생성율이 더 높을 가능성도 배제할 수 없다 (French, 1993).대사활성계 적용 시 소핵세포 생성을 비교한 결과, 세포질분열억제소 핵시험에서 CSC 75 us/mL 처리했을때 소핵세포가 다소 증가하였으나, 대사 활성계 미적용 시보다는 소핵세포 생성율이 낮았다 (Fig. 5).
- , 2002). CSC를 농도별(0~75 ug/mL)로 장기 처리(19 h) 후 일반 소핵시험과 세포질분열억제 소핵시험에 의한 소핵세포 생성율은 두 시험법 모두에서 농도의존적으로 증가되었다. CSC 75 ug/mL 처리 시 일반 소핵시험과 세포질 분 열억제 소핵시험에서의 소핵세포 생성율은 각각 6.
- CSC를 농도별(0~75 ug/mL)로 장기 처리(19 h) 후 일반 소핵시험과 세포질분열억제 소핵시험에 의한 소핵세포 생성율은 두 시험법 모두에서 농도의존적으로 증가되었다. CSC 75 ug/mL 처리 시 일반 소핵시험과 세포질 분 열억제 소핵시험에서의 소핵세포 생성율은 각각 6.5±0.6%와 11.7±1.1%로 세포질분열 억제 소핵시험이 더 높았으며, 단기 처리에 비해 소핵세포 생성율이 증가되었다 (Fig. 6).
- Table 1의 회귀식에서 나타난 바와 같이, 단기 처리와 장기 처리 모두 세포질 억제 소핵시험이 일반 소핵시험보다 소 핵생성 빈도수가 높았다. CSC 처리 방법에 따른 용량 상관관계를 조사한 결과, 상관계수값(R)도 일반소핵시험보다 세포질분열 억제 소핵시험에서 1에 가까웠으며, 장기처리시 0.895로 상관계수가 가장 높게 나타났다.
- 1 ug/mL cytochalasin B 처리 시 세포 생존율과 2핵을 가진 세포의 비율이 각각 약 95%와 55 %로 나타났으며, 이와 같은 결과로부터 세포질분열 억제 소핵시험을 위해 사용되는 cytochalasin B의 농도는 1 ug/mL로 결정하였다. CSC의 농도별(0~75 ug/mL)로 단기 처리(4 h) 후 일반 소핵시험과 세포질분열 억제 소핵시험에서 소핵세포 생성율을 비교한 결과, 두 시험법 모두에서 농도의존적으로 소핵세포가 증가되었다. 대사 활 성계 적용 시에는 세포질분열 억제 소핵시험에서만 소핵세포가 다소 증가되었고, 대사 활성계 미적용 시보다는 소핵세포 생성율이 낮았다.
- CSC의 농도별(0~75 ug/mL)로 단기 처리(4 h) 후 일반 소핵시험과 세포질분열 억제 소핵시험에서 소핵세포 생성율을 비교한 결과, 두 시험법 모두에서 농도의존적으로 소핵세포가 증가되었다. 대사 활 성계 적용 시에는 세포질분열 억제 소핵시험에서만 소핵세포가 다소 증가되었고, 대사 활성계 미적용 시보다는 소핵세포 생성율이 낮았다. CSC의 장기 처리(19 h) 경우 두 시험법 모두에서 농도의존적 으로 소핵세포가 증가되었고, 세포질분열 억제 소 핵시험시 소핵세포의 증가폭이 더 컸다.
- CSC의 장기 처리(19 h) 경우 두 시험법 모두에서 농도의존적 으로 소핵세포가 증가되었고, 세포질분열 억제 소 핵시험시 소핵세포의 증가폭이 더 컸다. 회귀분석을 이용하여 CSC 처리 방법에 따른 소핵생성 빈도수를 계산한 결과, 모든 처리 방법에서 일반 소핵 시험 보다 세포질분열 억 제 소핵시험 에서 소핵생성 빈도수와 상관계수값(R)이 더 높았다. 이상의 결과로부터 담배시료의 소핵생성 평가에는 소핵생성율이 높게 측정되는 세포질분열 억제 소핵시험법을 이용하는 것이 효율적일 것으로 판단된다.
- 회귀분석을 이용하여 CSC 처리 방법에 따른 소핵생성 빈도수를 계산한 결과, 모든 처리 방법에서 일반 소핵 시험 보다 세포질분열 억 제 소핵시험 에서 소핵생성 빈도수와 상관계수값(R)이 더 높았다. 이상의 결과로부터 담배시료의 소핵생성 평가에는 소핵생성율이 높게 측정되는 세포질분열 억제 소핵시험법을 이용하는 것이 효율적일 것으로 판단된다.
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