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문제 정의
- Cloning 여부를 확인하기 위해서 TOPO vector 상의 제한 효소 인식부위 중에 PCR 생성물 삽입 시에 양쪽에 존재하게 되는 EcoRI과 HindDI를 처리하여 insert 존재여부를 확인하고자 하였다. plasmid DNA 5ul에 20U/ul EcoRI 또는 20U/ul Hindlll 제한효소를 37℃에서 3시간동안 처리한 뒤 1.
- 본 연구는 대부분이 원시난포로 구성되어 있는 생후 1일된 생쥐의 난소와, 주로 원시난포와 1차 난포로 구성되어 있는 생후 5일된 생쥐의 난소를 사용하여 ACP를 이용한 PCR 방법으로 각각의 난소에서 높게 발현하는 유전자들의 목록을 확보하였고, 기술적으로 분리가 어려운 이들 원시난포와1 차 난포 간 유전자 발현을 LCM과 real-time PCR 방법을 사용하여 비교분석하였다.
- 본 연구의 목적은 성장이 정지되어 있는 원시난포와 성장이 개시된 1차 난포 사이에서 다르게 발현하는 유전자를 찾고자 하는 것이다. 그러나 원시난포 및 1차 난포의 크기가 매우 작아서 각 발달 단계별 난포를 충분하게 확보하는 것이 쉽지 않기 때문에 대신, 본 연구에서는 대부분이 원시난포로구성되어 있는 생쥐의 1 일자 난소와 주로 원시난포와 1차 난포로 구성되어 있는 5일자 난소를 사용하여 ACP Technology 를 통해 두 그룹 간에 서로 다르게 발현하는 유전자들을 발굴하였고, 이렇게 발굴된 유전자들의 발현의 차이 및 난소내 발현양상을 분석하였다.
- 또한 배란이 되지 않거나 조기 폐경 등 난포발달과 관련된 여성의 난소질병에 대한 기전 연구 및 그 치료도 가능할 것이다. 이러한 궁극적인 목표를 염두에 두고 초기 난포발달 과정 에 관여하는 유전자를 찾고자 본 연구를 계획하였다.
가설 설정
- :A gene expressed only in day5 ovary.
제안 방법
- Real-Time PCR은 MyiQ single-color real-time PCR detec tion system(Bio-Rad, Hercules, CA)을 사용하여 수행하였다. 450개의 LCM 난포로부터 얻은 cDNA 2ul에 각 유전자의 20pmol forward/reverse primer(lul), 2X iQ SYBR green supermix 10ul(100mM KC1, 40mM Tris-HCl, pH 8.4, 0.4mM each dNTP, 50U/ml iTaq DNA polymerase, 6mM MgCL, SYBR Green I, 20nM fluorescein, stabilizers, Bio-Rad), 그리고 멸균된 3차 증류수로 전체 반응용액을 20ul 으로 맞추어 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 3분을 수행한 뒤, 95℃에서 40초, 60℃ 에서 40초, 72℃에서 40초 46번 반복하고 95℃에서 1분을 수행한 뒤, PCR 생성물의 melting curve를 분석하고자 55℃부터 95℃까지 0.
- BPOZ와 TIAP/m-survivin의 발현이 원시난포와 1차 난포에서 얼마나 다르게 발현하는지를 정량분석을 위하여 real-time PCR을 수행하였다. 그 결과, CT값의 차이로 우선 각 유전자의 발현양의 차이가 있음을 확인할 수 있었다(fig.
- PCR 조건은 94℃에서 5분, 94℃ 에서 40초, 각 annealing 온도에서 40초, 72℃ 에서 1분, 70℃에서 10분간 수행하였다. PCR 수행 후 최종산물은 1.5% agarose gel에서 전기영동 하여 각 유전자들의 생후 1일자와 5일자 난소에서의 발현을 관찰하였다. 상대적인 유전자 발현의 차이는 glyceraldeyde-3 phosphate dehydrogenase(G3PDH) 발현으로 normalization 한 후 다시 대조군과 비교하여 분석하였다.
- 25ul), 그리고 멸균된 3차 증류수로 전체 반응용액을 25ul로 맞추어 수행하였다. PCR 조건은 94℃에서 5분, 94℃ 에서 40초, 각 annealing 온도에서 40초, 72℃ 에서 1분, 70℃에서 10분간 수행하였다. PCR 수행 후 최종산물은 1.
- 4mM each dNTP, 50U/ml iTaq DNA polymerase, 6mM MgCL, SYBR Green I, 20nM fluorescein, stabilizers, Bio-Rad), 그리고 멸균된 3차 증류수로 전체 반응용액을 20ul 으로 맞추어 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 3분을 수행한 뒤, 95℃에서 40초, 60℃ 에서 40초, 72℃에서 40초 46번 반복하고 95℃에서 1분을 수행한 뒤, PCR 생성물의 melting curve를 분석하고자 55℃부터 95℃까지 0.5℃씩 10초간 온도를 높여가면서 형광발현을 관찰 분석하였다. 사용한 시료간의 유전자 발현 증폭에 관한정량분석은 Hettinger 등(2001)이 사용한 계산법을 참고하여 semi-log amplification plot의 기하학적 범위 내에서 검출된 형광을 바탕으로 하여 형광이 두드러지게 증가하는 시점의 cycle 수인 threshold cycle(CT)로 분석하였다.
- 75 ul)를 첨 가하여 42℃ 에서 1 시간, 94℃ 에서 2분간 반응하여 역전사 반응을 수행하였다. PCR은 cDNA 1니에 각 유전자의 20pmol fbrward/reverse primer(lul), 25mM MgCk(2.5ul), 10X buffer(2.5ul), lOmM dNTP(0.5ul), 5U/ul Taq DNA polymerase (Promega)(0.25ul), 그리고 멸균된 3차 증류수로 전체 반응용액을 25ul로 맞추어 수행하였다. PCR 조건은 94℃에서 5분, 94℃ 에서 40초, 각 annealing 온도에서 40초, 72℃ 에서 1분, 70℃에서 10분간 수행하였다.
- 최종 cDNA 합성물이 20ul이 되도록, DNase I(Invitrogen) lU/ul 처리된 total RNA 3ug에 lOuM dT-ACPl 2니를 첨가하여 80℃ 에서 3분간 수행하고, MMLV reverse transcriptase(Promega, Madison, WI) 200U/ul(lul), RNa se inhibitor(Promega) 40U/ul(lul), 5X RT buffer(4ul), lOmM dNTP(lul)첨가하여 42℃에서 90분, 94℃에서 2분간 수행하여 cDNA를 합성한 뒤 5배 희석하여 사용하였다. PCR은 총 25니로 25mM MgC12(Z5니 1), 5uM arbitrary ACP(lul), lOuM dT- ACP2(0.5ul), lOmM dNTP(0.5ul), BioTherm DNA Polymerase (GeneCraft, Munster, Germany) 5U/ul(0.25ul), 10X buffer(2.5ul) 를 사용하였다. GeneFishing PCR은 기존의 PCR 조건과는 달리 2단계로 PCR이 진행되는데, PCR 조건은 94℃에서 5분, 50℃에서 3분, 72℃에서 1분간 첫 번째 단계의 PCR을 1회 수행한 후 94℃에서 40초, 65℃에서 40초, 72℃에서 40초의 조건으로 40회 반복 수행 하고 마지 막으로 72℃ 에서 5분간 수행하여 두 번째 단계의 PCR을 마쳤다.
- PixCell II™ system(Arcturus Engineering, Inc., Mountain View, USA)을 이용하여 원시난포와 1차 난포를 순수하게 분리하였다. LCM을 위한 조직의 준비과정, LCM 과정 및 포획한 난포세포로부터의 total RNA를 추출은 박 등(2002)의 방법을 사용하였다.
- 합성된 RNA probe의 효율을 확인하기 위하여 반응물 1니를 1% agarose gel에 전기 영동 하여 확인하였다. Probe 반응물을 G-50 column(Amersham Pharmacia Biotech Ltd., Piscataway, NJ)으로 정제한 후 농도가 100ug/ml이 되도록 Hybe buffer(50 % formamide, 5X SSC, Img/ml Torula yeast RNA, lOOug/ml heparin, IX Denhardt's solution, 0.1% Tween-20, 0.1%(CHAPS, 0.5mM EDTA)로 희석하였다. 파라핀 절편 슬라이드를 Xy- lene에 처리하여 파라핀을 제거하고, 알코올 처리과정과 D-PBS 용액에 세척한 후, 4% paraformaldehyde 용액으로 실온에서 10분간 재고정하였다.
- RT-PCR로 발현양상을 확인한 유전자 가운데 Anxll, Pepp2-pending, BPOZ, Chesl, Kcmfl, Ninjl, SENP, HAP/ m-survivin 등을 선택하여 난소 내에서의 mRNA 발현 위치를 알아보고자 in situ hybridization을 수행 하였다. 이 때 난포발달단계에 따른 변화를 살펴보고자 5일자 난소와 4주령의 난소에서 실험하여 각 발달단계별 난포 내 난자와 과립세포, 그리고 협막 세포에서의 발현을 관찰하였다.
- LCM을 위한 조직의 준비과정, LCM 과정 및 포획한 난포세포로부터의 total RNA를 추출은 박 등(2002)의 방법을 사용하였다. Semi-quantitative RT-PCR 방법으로 난소간의 발현차이를 우선 확인하고, in situ hybridization을 통해서 mRNA 발현 위치를 확인한 10개의 유전자 중 BPOZ와 TIAP/m-survivin을 선택하여 real-time PCR을 이용하여 실제로 원시난포와 1차 난포간 발현의 양적인 차이를 확인하였다. Real-Time PCR은 MyiQ single-color real-time PCR detec tion system(Bio-Rad, Hercules, CA)을 사용하여 수행하였다.
- 하였다. plasmid DNA 5ul에 20U/ul EcoRI 또는 20U/ul Hindlll 제한효소를 37℃에서 3시간동안 처리한 뒤 1.5% agarose gel상에서 전기영동 하여 insert를 확인하였다. 제한효소 처 리를 통해서 insert 크기를 확인한 sample은 lug의 농도로 염기서열 분석(Macrogen Co.
- 상대적인 유전자 발현의 차이는 glyceraldeyde-3 phosphate dehydrogenase(G3PDH) 발현으로 normalization 한 후 다시 대조군과 비교하여 분석하였다. 결과는 mean士SEM으로 나타내었고 실험은 3번 반복수행 하였다.
- 하는 것이다. 그러나 원시난포 및 1차 난포의 크기가 매우 작아서 각 발달 단계별 난포를 충분하게 확보하는 것이 쉽지 않기 때문에 대신, 본 연구에서는 대부분이 원시난포로구성되어 있는 생쥐의 1 일자 난소와 주로 원시난포와 1차 난포로 구성되어 있는 5일자 난소를 사용하여 ACP Technology 를 통해 두 그룹 간에 서로 다르게 발현하는 유전자들을 발굴하였고, 이렇게 발굴된 유전자들의 발현의 차이 및 난소내 발현양상을 분석하였다.
- Louis, MO)로 실온에서 1시간 발색시켰다. 발색 후 PBS로 수세 하고, Nuclear Fast Red로 대조염 색 후수용성 봉입제(DAKO, Carpinteria, CA)로 봉입하였다.
- 사용한 시료간의 유전자 발현 증폭에 관한정량분석은 Hettinger 등(2001)이 사용한 계산법을 참고하여 semi-log amplification plot의 기하학적 범위 내에서 검출된 형광을 바탕으로 하여 형광이 두드러지게 증가하는 시점의 cycle 수인 threshold cycle(CT)로 분석하였다. 상대적인 유전자 발현의 차이는 G3PDH 발현으로 normalization 한 후 다시 대조군과 비교하여 분석하였다. 결과는 mean士SEM으로 나타내었고 실험은 3번 반복 수행하였다.
- 5% agarose gel에서 전기영동 하여 각 유전자들의 생후 1일자와 5일자 난소에서의 발현을 관찰하였다. 상대적인 유전자 발현의 차이는 glyceraldeyde-3 phosphate dehydrogenase(G3PDH) 발현으로 normalization 한 후 다시 대조군과 비교하여 분석하였다. 결과는 mean士SEM으로 나타내었고 실험은 3번 반복수행 하였다.
- 생쥐의 난소조직을 4% parafbrmaldehyde에서 하루 동안 고정시킨 후 파라핀 블록을 제작하였으며, 파라핀 침투조직은 5um 두께의 연속절편을 슬라이드(ProbeOn Plus, Fisher Scien tific, Pittsburgh, PA)에 부착하여 사용 전까지 4℃ 에서 보관하였다. RNA probe 는 in vitro transcription kit(Promega) 을 이용하여 제작하였다.
- 성장이 정지된 원시난포와 그 원시난포의 성장이 개시되어 1차 난포가 되는 과정에 관여할 것으로 생각되어지는 유전자를 찾기 위해 생쥐의 1일자와 5일자 난소에서 얻은 동량의 cDNA로 ACP# 이용하여 PCR을 수행하였다. 총 80개의 ACP를 사용하여 41개의 DEG를 얻었다.
- in situ hybridization을 수행 하였다. 이 때 난포발달단계에 따른 변화를 살펴보고자 5일자 난소와 4주령의 난소에서 실험하여 각 발달단계별 난포 내 난자와 과립세포, 그리고 협막 세포에서의 발현을 관찰하였다. 그 결과, 어느 특정 세포에서만 발현하는 유전자는 찾을 수 없었고, 거의 모든 유전자가 난자 또는 과립 세포를 비롯한 난소 내 모든 부분에서 발현하였다.
- RNA probe 는 in vitro transcription kit(Promega) 을 이용하여 제작하였다. 이때 lug/ul DNA template(lul), 5X Trans buffer(4ul), RNAsin(2ul), T7 또는 SP6 RNA polymerase(2ul), DIG RNA labeling mix(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN; 2ul), 1 OOmM threo-1, 4-dimercapto-2, 3-butandiol(DTT)(2ul) 및 DEPC-treated water를 전체 20ul가 되도록 첨가하여 37℃ 에서 6시간 합성한 후, RNase-free DNase I(Invitrogen)를 처리하였다. 합성된 RNA probe의 효율을 확인하기 위하여 반응물 1니를 1% agarose gel에 전기 영동 하여 확인하였다.
- GeneFishing PCR은 기존의 PCR 조건과는 달리 2단계로 PCR이 진행되는데, PCR 조건은 94℃에서 5분, 50℃에서 3분, 72℃에서 1분간 첫 번째 단계의 PCR을 1회 수행한 후 94℃에서 40초, 65℃에서 40초, 72℃에서 40초의 조건으로 40회 반복 수행 하고 마지 막으로 72℃ 에서 5분간 수행하여 두 번째 단계의 PCR을 마쳤다. 이를 통해서 얻어진 PCR 산물은 2% agarose gel에 전기영동하여 생후 1일자와 5 일자 간에 뚜렷한 차이를 보이는 DEG를 선택하여 gel extraction kit(QIAGEN, Santa Clara, USA)을 사용하여 정제하였다. 정제된 DNA 단편을 TOPO vector(Invitrogen)ligation 하여 cloning 한 후, 얻어진 plasmid는 miniprep kit(QIAGEN) 으로 추출하였다.
- 선택한 유전자에 대한 primer sequence에 대한 정보는 Table 1에 정리하였다. 전체 반응 용액이 25ul이 되도록 DNase I(Invitrogen) lU/ul 처리된 total RNA 2ug에 oligo(dT)2o(lul)를 첨가하여 70℃에서 10분간 수행 하고, MMLV reverse transcriptase(Promega) 200U/ul(lul), 5X RT buffer(5ul), lOmM dNTP(1.25ul), DEPC-treated water(2.75 ul)를 첨 가하여 42℃ 에서 1 시간, 94℃ 에서 2분간 반응하여 역전사 반응을 수행하였다. PCR은 cDNA 1니에 각 유전자의 20pmol fbrward/reverse primer(lul), 25mM MgCk(2.
- 이를 통해서 얻어진 PCR 산물은 2% agarose gel에 전기영동하여 생후 1일자와 5 일자 간에 뚜렷한 차이를 보이는 DEG를 선택하여 gel extraction kit(QIAGEN, Santa Clara, USA)을 사용하여 정제하였다. 정제된 DNA 단편을 TOPO vector(Invitrogen)ligation 하여 cloning 한 후, 얻어진 plasmid는 miniprep kit(QIAGEN) 으로 추출하였다.
- cDNA를 합성하였다. 최종 cDNA 합성물이 20ul이 되도록, DNase I(Invitrogen) lU/ul 처리된 total RNA 3ug에 lOuM dT-ACPl 2니를 첨가하여 80℃ 에서 3분간 수행하고, MMLV reverse transcriptase(Promega, Madison, WI) 200U/ul(lul), RNa se inhibitor(Promega) 40U/ul(lul), 5X RT buffer(4ul), lOmM dNTP(lul)첨가하여 42℃에서 90분, 94℃에서 2분간 수행하여 cDNA를 합성한 뒤 5배 희석하여 사용하였다. PCR은 총 25니로 25mM MgC12(Z5니 1), 5uM arbitrary ACP(lul), lOuM dT- ACP2(0.
- 5mM EDTA)로 희석하였다. 파라핀 절편 슬라이드를 Xy- lene에 처리하여 파라핀을 제거하고, 알코올 처리과정과 D-PBS 용액에 세척한 후, 4% paraformaldehyde 용액으로 실온에서 10분간 재고정하였다. 그리고 0.
- 이때 lug/ul DNA template(lul), 5X Trans buffer(4ul), RNAsin(2ul), T7 또는 SP6 RNA polymerase(2ul), DIG RNA labeling mix(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN; 2ul), 1 OOmM threo-1, 4-dimercapto-2, 3-butandiol(DTT)(2ul) 및 DEPC-treated water를 전체 20ul가 되도록 첨가하여 37℃ 에서 6시간 합성한 후, RNase-free DNase I(Invitrogen)를 처리하였다. 합성된 RNA probe의 효율을 확인하기 위하여 반응물 1니를 1% agarose gel에 전기 영동 하여 확인하였다. Probe 반응물을 G-50 column(Amersham Pharmacia Biotech Ltd.
- Seoul, Korea)을 의뢰하였고, 그 결과를 BLAST 프로그램을 통하여 분석하였다. 확인된 유전자는 GeneSpring(Silicon Genetics, Redwood, CA) 프로그램으로 생물학적 기작 및 기능, 그리고 세포 내에서의 위치에 대한 분석을 하였다.
대상 데이터
- cDNA로 ACP# 이용하여 PCR을 수행하였다. 총 80개의 ACP를 사용하여 41개의 DEG를 얻었다. Fig.
데이터처리
- 결과의 통계분석은 /-test를 사용하여 검증하였으며 유의 차에 대한 수준은 p값이 0.05보다 작은 경우에 유의성이 있다고 분석하였다.
- 5% agarose gel상에서 전기영동 하여 insert를 확인하였다. 제한효소 처 리를 통해서 insert 크기를 확인한 sample은 lug의 농도로 염기서열 분석(Macrogen Co., Ltd. Seoul, Korea)을 의뢰하였고, 그 결과를 BLAST 프로그램을 통하여 분석하였다. 확인된 유전자는 GeneSpring(Silicon Genetics, Redwood, CA) 프로그램으로 생물학적 기작 및 기능, 그리고 세포 내에서의 위치에 대한 분석을 하였다.
이론/모형
- , Mountain View, USA)을 이용하여 원시난포와 1차 난포를 순수하게 분리하였다. LCM을 위한 조직의 준비과정, LCM 과정 및 포획한 난포세포로부터의 total RNA를 추출은 박 등(2002)의 방법을 사용하였다. Semi-quantitative RT-PCR 방법으로 난소간의 발현차이를 우선 확인하고, in situ hybridization을 통해서 mRNA 발현 위치를 확인한 10개의 유전자 중 BPOZ와 TIAP/m-survivin을 선택하여 real-time PCR을 이용하여 실제로 원시난포와 1차 난포간 발현의 양적인 차이를 확인하였다.
- Semi-quantitative RT-PCR 방법으로 난소간의 발현차이를 우선 확인하고, in situ hybridization을 통해서 mRNA 발현 위치를 확인한 10개의 유전자 중 BPOZ와 TIAP/m-survivin을 선택하여 real-time PCR을 이용하여 실제로 원시난포와 1차 난포간 발현의 양적인 차이를 확인하였다. Real-Time PCR은 MyiQ single-color real-time PCR detec tion system(Bio-Rad, Hercules, CA)을 사용하여 수행하였다. 450개의 LCM 난포로부터 얻은 cDNA 2ul에 각 유전자의 20pmol forward/reverse primer(lul), 2X iQ SYBR green supermix 10ul(100mM KC1, 40mM Tris-HCl, pH 8.
- 두 가지 시료간의 유전자의 발현의 차이를 연구하는 방법으로 differential display PCR(DD-PCR), suppression substrac tive hybridization(SSH) 등을 예로 들 수 있는데, 본 연구에서는 비교하고자 하는 시료에서 서로 다르게 발현되는 유전자 (DEG; differentially expressed genes)를 탐색한다는 점에서 앞의 두 가지 방법과 같은 의미를 갖지만, false positive가 없고효율성 면에서 더 좋다고 알려진 annealing control primer technology(ACP; Seegene, Seoul, Korea)를 이용하였다. ACP는 template에 annealing temperature specific 하게 결합함으로써두 시료 간에 서로 다르게 발현하는 유전자를 알아내는 새로운 방법이다(Hwang et al.
- 5℃씩 10초간 온도를 높여가면서 형광발현을 관찰 분석하였다. 사용한 시료간의 유전자 발현 증폭에 관한정량분석은 Hettinger 등(2001)이 사용한 계산법을 참고하여 semi-log amplification plot의 기하학적 범위 내에서 검출된 형광을 바탕으로 하여 형광이 두드러지게 증가하는 시점의 cycle 수인 threshold cycle(CT)로 분석하였다. 상대적인 유전자 발현의 차이는 G3PDH 발현으로 normalization 한 후 다시 대조군과 비교하여 분석하였다.
성능/효과
- 1일자 난소에서 Anxll과 Pepp2-pending을 선택하여 이들 모두 1일자 난소에서 더 높게 발현하는 것을 확인하고 mRNA 발현 위치를 확인한 결과, 원시난포와 1차 난포에서 난자와 과립세포 모두 발현하다가 강소 형성 난포(antral follicle)에서는 난자는 발현하지 않고 과립세포에서만 발현하는 것을 관찰하였다. 원시난포에서는 난자가 편평한 과립세포보다 강한 발현을 보이 다가 1차 난포에서는 입 방형으로 성장한 과립세포에서 난자보다 더 강한 발현을 보이고, 강소형성 난포에 이르러는 과립세포에서만 발현하였는데, 성장이 저해되어 있는 원시난포의 편평한 과립세포가 1차 난포로성장이 개시되면서 입방형으로 과립세포가 성장을 하게 되는데 이 두 유전자가 어떠한 영향을 미칠 것으로 사료된다.
- 실험결과, 1일자 난소에서 특이적으로 발현하는 유전자는 찾을 수 없었으나 1일자 난소에서 더 많이 발현되는 유전자를 9개, 5일자 난소에서 더 많이 발현되는 유전자를 31개, 5일자 난소에서만 특이적으로 발현하는유전자 1개를 얻었다. 1일자 난소에서 더 많이 발현되는 9개의 유전자는 세포간의 정보교환, 물질대사, RNA processing 에 관여하는 유전자였으며, 5일자 난소의 32개 유전자는 세포와 기질간의 결합, 유전자 및 단백질 발현, 세포주기 저해, 세포 성장 조절, 전자의 이동, 단백질 가수분해, 세포사멸 저해 등에 관여하는 유전자였다(Table 3).
- 사용한 ACP의 개수에 비하여 적은 수의 DEG를 얻은 것은, 각각의 ACP에 대한 발현 유전자의 수는 훨씬 많았음에도 불구하고 두 그룹간의 발현 차가 확실하게 나는 유전자는 매우 적었으며, 그렇게 선택된 유전자 중에서도 클로닝, 염기서열분석, 그리고 BLAST 검색과정까지 마친 유전자만을 포함시켰기 때문이다. 41개의 DEG 중에서 33개의 clone은 BLAST 에 등록되어 있는 유전자와 일치하였고 4개의 clone은 아직 밝혀지지 않은 유전자였으며 나머지 4개는 expressed se quence tag(EST)이었다. 이렇게 얻은 41개의 DEG의 이름을 Table 2에 정리하였다.
- 5일자 난소에서 더 많이 발현한 유전자 중에서 Apg3 /Autlp-like, BPOZ, Chesl, Kcmfl, NHE3, Nid2, Ninjl, SENP3, Suil-rsl, TIAP/m-survivin 등 그 기능이 알려져 있는 유전자중에서 중요하다고 생각되는 10개 유전자를 택하여 마찬가지로 semi-quantitative RT-PCR을 수행 하여 이 들 유전자 역 시모두 1일자 난소에서보다 5일자 난소에서 높게 발현함을 확인하였다(Fig. 2B). 모두 12개의 유전자에 대한 semi-quan titative RT-PCR 결과 중 2개의 유전자(pepp2, SENP3)는 통계적으로 유의성을 보이지는 않았으나 경향은 보였다.
- BLAST를 통하여 얻은 결과 중에서 모두 12개의 유전자를 선택하여 RT-PCR 방법으로 생후 1 일자와 5일자 난소간의 발현 차이를 다시 확인하였다. 선택한 유전자에 대한 primer sequence에 대한 정보는 Table 1에 정리하였다.
- 그 결과, 어느 특정 세포에서만 발현하는 유전자는 찾을 수 없었고, 거의 모든 유전자가 난자 또는 과립 세포를 비롯한 난소 내 모든 부분에서 발현하였다. 관찰한 모든 유전자에서 공통적으로 특이하게 발견되는 발현양상은 모든 유전자가 원시난포의 난자에서는 발현되던 것이 1차 난포만 되어도 난자에서의 발현이 급격히 감소하였고(Fig. 3, 4), 그 이상의 발달단계에 있는강소 형성 난포(antral fbllicle)에서는 난자에서 거의 발현이 관찰되지 않았다(Fig. 3, 4). 그러나 모든 유전자가 과립 세포에서는 지속적으로 높게 발현하였다.
- 수행하였다. 그 결과, CT값의 차이로 우선 각 유전자의 발현양의 차이가 있음을 확인할 수 있었다(fig. 5A). 이들유전자의 양을 각각의 G3PDH 양으로 먼저 환산한 후에, 원시난포에 대한 1차 난포의 발현 양을 조사한 결과, BPOZ는 원시난포에서 보다 1차 난포에서 약 4.
- 이 때 난포발달단계에 따른 변화를 살펴보고자 5일자 난소와 4주령의 난소에서 실험하여 각 발달단계별 난포 내 난자와 과립세포, 그리고 협막 세포에서의 발현을 관찰하였다. 그 결과, 어느 특정 세포에서만 발현하는 유전자는 찾을 수 없었고, 거의 모든 유전자가 난자 또는 과립 세포를 비롯한 난소 내 모든 부분에서 발현하였다. 관찰한 모든 유전자에서 공통적으로 특이하게 발견되는 발현양상은 모든 유전자가 원시난포의 난자에서는 발현되던 것이 1차 난포만 되어도 난자에서의 발현이 급격히 감소하였고(Fig.
- 2B). 모두 12개의 유전자에 대한 semi-quan titative RT-PCR 결과 중 2개의 유전자(pepp2, SENP3)는 통계적으로 유의성을 보이지는 않았으나 경향은 보였다.
- 생후 5일자 난소에서 선택한 이 8개의 유전자 모두 원시난포에서는 난자가 편평한 과립세포보다 강한 발현을 보이다가 1차 난포에서는 입방형으로 성장한 과립세포에서 난자보다 더 강한 발현을 보이고, 강소 형성 난포에 이르러는 과립세포에서만 발현하였다. 이 중 BPOZ, Chesl, TIAP/m-survivin 등은 세포주기에 관련이 있는 유전자들이며 real-time PCR 수행결과, BPOZ의 경우에는 원시난포에서보다 1차 난포에서 약 4.
- 이렇게 얻은 41개의 DEG의 이름을 Table 2에 정리하였다. 실험결과, 1일자 난소에서 특이적으로 발현하는 유전자는 찾을 수 없었으나 1일자 난소에서 더 많이 발현되는 유전자를 9개, 5일자 난소에서 더 많이 발현되는 유전자를 31개, 5일자 난소에서만 특이적으로 발현하는유전자 1개를 얻었다. 1일자 난소에서 더 많이 발현되는 9개의 유전자는 세포간의 정보교환, 물질대사, RNA processing 에 관여하는 유전자였으며, 5일자 난소의 32개 유전자는 세포와 기질간의 결합, 유전자 및 단백질 발현, 세포주기 저해, 세포 성장 조절, 전자의 이동, 단백질 가수분해, 세포사멸 저해 등에 관여하는 유전자였다(Table 3).
- 원시난포로만 구성되어 있는 생후 1일자 난소에서 더 높게 발현한 유전자는 세포간의 정보교환, 물질대사, RNA pro- cessing에 관여하는 것이었으며, 5일자 난소의 32개 유전자는 세포와 기질간의 결합, 유전자 및 단백질 발현, 세포주기 저해, 세포 성장 조절, 전자의 이동, 단백질 가수분해, 세포사멸저해 등에 관여하는 것이었다.
- 5B). 이것으로 BPOZ와 TIAP/m-survivin 두 유전자 모두 난소에서 뿐만 아니라 난포간에서도 차이 나게 발현함을 확인하였다.
- 5A). 이들유전자의 양을 각각의 G3PDH 양으로 먼저 환산한 후에, 원시난포에 대한 1차 난포의 발현 양을 조사한 결과, BPOZ는 원시난포에서 보다 1차 난포에서 약 4.5배, 그리고 TIAP/m- survivin는 3.4배 높게 발현하고 있음을 알 수 있었고 이들 모두 통계적으로 유의성이 있었다(Fig. 5B). 이것으로 BPOZ와 TIAP/m-survivin 두 유전자 모두 난소에서 뿐만 아니라 난포간에서도 차이 나게 발현함을 확인하였다.
- 총 41개의 DEG 중에서 1일자 난소에서 더 많이 발현한 9 개의 유전자 중에서 일차적으로 Anxll 및 Pepp2-pending에대 한 specific primer(Table 1)를 제 작하여 난소 전체를 이용한 semi-quantitative RT-PCR을 수행 한 결과, ACP를 통해서 얻은 발현양상과 동일한 양상을 얻어 이 두 유전자가 5일자 난소에서 보다 1일자 난소에서 높게 발현하고 있음을 확인하였다 (Fig. 2A).
- 총 41개의 DEG 중에서 5일자 난소에서만 특이적으로 발현한 유전자는 hypothetical protein 1개, 1일자보다는 5일자난소에서 더 많이 발현한 유전자는 Apg3/Autlp-like 등 31개였다. 5일자 난소에서 더 많이 발현한 유전자 중에서 Apg3 /Autlp-like, BPOZ, Chesl, Kcmfl, NHE3, Nid2, Ninjl, SENP3, Suil-rsl, TIAP/m-survivin 등 그 기능이 알려져 있는 유전자중에서 중요하다고 생각되는 10개 유전자를 택하여 마찬가지로 semi-quantitative RT-PCR을 수행 하여 이 들 유전자 역 시모두 1일자 난소에서보다 5일자 난소에서 높게 발현함을 확인하였다(Fig.
후속연구
- 특히 Anxll의 경우, Ca2+ 존재 하에 S100 단백질인 calcyclin (SlOOAb)과 결합한다고 보고되어 있다(Tohshiki & Hiroyoshi, 1998). Calcyclin은 Ca2+ 존재 하에, 난포 성장에 관여한다고 보고되어 있는 insulin 분비를 촉진하며(Okazaki et al., 1994; Satoshi I et al., 2000), 사람에서는 세포주기 특히, G1 기의 진행 에 관여 한다고 보고되 어져 있어(Calabretta et al., 1985), 본연구를 통해 1차 난포에서 입방형 과립세포에서의 mRNA 발현이 관찰된 Anxll과 calcyclin과의 상관관계에 대하여 연구 할 가치가 높을 것으로 생각된다.
- , 1998). TIAP/m-survivin이 닭의 난소의 과립세포에서 유사분열의 G2와 M기에서 특별히 발현한다는 보고가 있으며 (Johnson AL et al., 2002), TIAP/msurvivin의 p34xsx2 인산화에 의해 세포 분열에서의 세포사멸을 조절한다는 보고가있어(O'Connor et al., 2000), 본 연구를 통해 관찰된 1차 난포의 성장이 개시된 입방형 과립세포에서의 TIAP/m-survivin과세포주기에 관련된 cell-cycle machinery, 특히 cdc2, cyclinBl 등과의 상관관계를 연구하는데 의의가 있을 것으로 사료된다.
- 따라서 생후 5일자 난소에서 세포주기를 저해하고 세포사멸에 관한 인자들의 높은 발현은 매우 흥미로운 결과로서, 이들 유전자에 대한 연구를 통하여 앞으로 원시난포에서 성장이 정지되었다가 1차 난포로 성장이 개시되는 분자생물학적 기전을 밝히는데 한 걸음 더 다가갈 수 있을 것으로 기대한다.
- 원시난포가 활성화되어 다시 성장하기 시작하는 과정을 이해함으로써 여성의 생식능력이 시작되는 시기를 조절하거나 혹은 폐경이 시작되는 시기를 뒤로 미룰 수 있는 등 궁극적으로는 여러 가지 조절이 인위적으로 가능하게 될 것이다. 또한 배란이 되지 않거나 조기 폐경 등 난포발달과 관련된 여성의 난소질병에 대한 기전 연구 및 그 치료도 가능할 것이다. 이러한 궁극적인 목표를 염두에 두고 초기 난포발달 과정 에 관여하는 유전자를 찾고자 본 연구를 계획하였다.
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