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문제 정의
- 발달과의 연관관계를 알아보고자 하였으며, 3) 난소와정소의 발달단계에 따라 SCN에서 분비되어 표적조직 또는기관으로 전달되는 물질로 알려진 Pork2(Cheng et al., 2002)에 대한 수용체들(Proklr과 Prok2r)이 주요 clock 유전자들과 어떠한 연관 관계를 가지고 발현되는지를 알아보고자 하였다.
- 따라서 본 연구에서는 생쥐의 난소와 정소의 조직에서 일주기성 변화에 연관된 주요 clock 유전자들이 정소와 난소 조직의 발달과 정자 발생 과정 및 난자 형성 과정 전반에 걸쳐어떻게 작용하는지를 알아보고 이들 유전자의 발현 양상 변화가 정자 및 난자의 발달과 성숙에 미치는 영향을 추측하고자 하여 다음과 같은 연구를 수행하였다. 1) 생쥐 정소 및 난소의 발달과 성숙의 각 단계에서 일주기성 변화에 연관된 clock 유전자(Per/, Per2, Per3, Clock, Bmall, Cryl, Gy2)의 발현 유무 및 발현 정도를 확인하고자 하였고, 2) 정소 및 난소의발달과 성숙의 각 단계에서 나타나는 일주기성 유전자들의발현 정도와 유전자의 발현 결과물인 PER1 단백질의 발현 양상을 확인하여 일주기성 유전자들의 발현과 정소 및 난소의 발달과의 연관관계를 알아보고자 하였으며, 3) 난소와정소의 발달단계에 따라 SCN에서 분비되어 표적조직 또는기관으로 전달되는 물질로 알려진 Pork2(Cheng et al.
제안 방법
- PCR reaction에서 cDNA의 존재를 확인하고 동량의 RNA 로부터의 역전사 중합효소 연쇄 반응을 통한 상대적 인 양을 비교하고자 GAPDH 발현을 positive contr이로 사용하였다. 상대적인 발현 정도를 알아보기 위하여 전기영동한 결과를 Image Analyzer(Bio-lD, version 99.
- 중합효소 연쇄반응(PCR)에 사용된 primerc 예상되는 결과는 Table 1에 나타난 바와 같다. PCR 은 7.5mM Tris-HCl(pH 8.3), 5mM KC1, 0.2mM MgCh, 2mM (NH4)2SO4, 0.2mM dNTP, lOpmol의 각각의 primer와 Ipmol의 GAPDH의 primer와, 2.5u Taq DNA polymerase(Biotools, Spain)를 전체 50^L 반응으로 하여 시행하였다. PCR 조건은 94℃에서 5분간 predenaturation 후 94℃에서 1 분간 denatu ration, 각각의 annealing 온도에서 1분간 annealing, 72℃에서 1 분간 extension을 각각 30회 반복하였고, postelongation 반응을 72℃에서 10분간 실시하였다.
- 5u Taq DNA polymerase(Biotools, Spain)를 전체 50^L 반응으로 하여 시행하였다. PCR 조건은 94℃에서 5분간 predenaturation 후 94℃에서 1 분간 denatu ration, 각각의 annealing 온도에서 1분간 annealing, 72℃에서 1 분간 extension을 각각 30회 반복하였고, postelongation 반응을 72℃에서 10분간 실시하였다. 이를 통해 얻어진 PCR product 는 2.
- 상층액 제거 후 75% ethanol을 첨가하여 4℃에서 5분간 7,500 g로 원심 분리하였다. RNA 침전물을 공기 중에서 건조시킨 후 DEPC 처리된 증류수로 용해시켜 사용 전까지 -80 ℃ 저온냉동기에 보관하였으며 총 RNA 의 양은 260nm 파장에서 흡광도를 측정하여 확인하였다.
- 각 단계별로 회수된 난소 조직을 4% paraformaldehyde에 12~24시간 고정한 후 수세과정을 거쳐 순차적으로 ethyl alcohol(50, 70, 85, 95, 100%)을 사용하여 각각 30분씩 탈수하였고, xylene으로 30분씩 2번 치환하였으며, paraffin에 포매하여 block을 만들었다. 포매 후 박편절단기(Microtome, Leica)를 사용하여 5um 두께로 절편하였으며 각 10절편마다 1절편씩 선택하여 Plus 슬라이드(Fisher, uSA)에 절편을 부착시킨 후 xylene에 5분씩 2번 paraffin을 제거한 후, 점진적 방법으로 ethanol(100, 90, 85, 75, 50%)로 각각 3분씩 수화시켰다.
- 2% H2O2를 10분간 처 리하여 조직 내 효소들을 불활성화 시킨 후 슬라이드를 다시 PBS 용액으로 옮겨 5분간방치 후, 1차 항체(1:100 anti-PERl antibody, Alpha Science, uSA)를 처 리하여 4 ℃ 에서 18시간 반응시킨 후 PBS로 5분간 2회 반복 세척하였다. 세척 후 2차 항체(1:500, biotin conju gated goat anti-rabbit-IgG)에 15분간 상온에서 반응시킨 후, PBS로 3분간 3회 세척 후 stable AEC(DAKO, uSA)에 10분간 발색시킨 후 탈수하여 balsam으로 봉입하였다. 대조군의 경우에는 PERI 1차 항체를 처리하지 않았다.
- 대조군의 경우에는 PERI 1차 항체를 처리하지 않았다. 슬라이드는 또한 난소와 정소의 발달 과정을 형태학적으로 확인하기 위해 위와 같은 방법 으로 paraffin을 제 거 하고, 알코올 처 리 과정 을 거쳐 증류수로 세척한 후 hematoxyline-eosin으로 염색한 후 각각의 조직 표본들을 광학현미경(Leitz) 하에서 관찰하였다.
- PCR 조건은 94℃에서 5분간 predenaturation 후 94℃에서 1 분간 denatu ration, 각각의 annealing 온도에서 1분간 annealing, 72℃에서 1 분간 extension을 각각 30회 반복하였고, postelongation 반응을 72℃에서 10분간 실시하였다. 이를 통해 얻어진 PCR product 는 2.0% agarose gel에서 전기영동한 후에 ethidium bromide로 염색하여 transilluminator상에서 형광 정도를 확인하였다.
- 이용하여 cDNA를 합성하였다. 총 반응 용액을 20uL 로 하여 SuperScript II RNase H reverse transcriptase 200u, oligo (dT)12-18 primer 0.5 ug을 사용하여 cDNA를 합성하였고 negative control로는 reverse transcriptase 없이 반응한 것을 cDNA 대신 사용하였다. 중합효소 연쇄반응(PCR)에 사용된 primerc 예상되는 결과는 Table 1에 나타난 바와 같다.
- block을 만들었다. 포매 후 박편절단기(Microtome, Leica)를 사용하여 5um 두께로 절편하였으며 각 10절편마다 1절편씩 선택하여 Plus 슬라이드(Fisher, uSA)에 절편을 부착시킨 후 xylene에 5분씩 2번 paraffin을 제거한 후, 점진적 방법으로 ethanol(100, 90, 85, 75, 50%)로 각각 3분씩 수화시켰다. PBS 로 수세 후 citric acid 용액 속에 넣고 멸균한 후 다시 PBS로세척 하였다.
대상 데이터
- Analysis of circadian clock genes at different developmental stages. At CT6, testis samples were obtained from 1, 7, 10, 21, and 35 day old male ICR mice. Total RNA samples prepared from testis were analyzed by RT-PCR.
- 본 실험에서는 생후 1, 7, 10, 21, 35일령의 ICR 암컷과 수컷 생쥐(Sam: TacHaQCR), fBR)의 난소와 정소를 일정한 시간 (점등 6시간 후, CT6)에 회수하여 실험에 사용하였다. 난소를 적출한 후 diethyl pyrocarbonate(DEPC) 처리된 Phosphate buff ered saline(PBS)으로 세척하여 액체질소에 급속 냉동시켜 사용 전까지 -80℃의 저온냉동기에 보관하였다.
데이터처리
- 상대적인 발현 정도를 알아보기 위하여 전기영동한 결과를 Image Analyzer(Bio-lD, version 99.01, Vilber Lourmat, France)를 이용하여 정량분석하고, GAPDH의 발현에 대한 각각의 clock 유전자들의 발현 정도를 arbitrary unit(Au)로 환산하였다.
성능/효과
- Peri 유전자의 발현은 성체가 되기까지 매우 낮게 발현되었고, Cryl 유전자의 경우는 생후 7일에 감소하였다가 10일부터 성숙이 완료될 때까지 발현량이 유지되는 양상을 나타내었다. Bmall, Clock 및 Cry2 유전자의 발현은 생후 7일에 높게 발현되어 성체까지 유지되는 것을 알 수 있었다. 난소에서 PER1 단백질의 발현 양상을 면역조직화학적 방법으로 확인한 결과 난포의 모든 발달단계(원시난포, 일차난포, 이차난포, 강소 형성전 난포 및 강소 형성 난포)에 걸쳐 PER1 단백질이 발현되었다(Fig.
- PER1 의 발현 양상을 면역조직화학적 방법으로 비교한 결과, 생쥐 난포의 모든 발달 단계에서 난소 내 건강한 난자와과립 막세포(granulosa cell)에서 높게 발현되 며, 협막세포(theca cell) 나 간충직세포(stromal cell)에서는 발현되지 않음을 알 수 있었고, 발달 주기에 따라 Perl 유전자와 유사한 발현 시기를보임을 확인할 수 있었다. 또한 난포 내 PER1 의 발현 양상에서 난자에서 먼 기저막쪽의 과립세포에서 보다 난자에 가까운 과립세포에서, 또 폐쇄중인 난포(apoptotic follicle)에서보다 건강한 난포에서 더욱 많이 발현되는 것을 확인할 수 있어, 난포 발달의 각 단계 동안 난자의 정상적인 발달과 밀접한 연관이 있을 것을 추측할 수 있었다(Fig.
- Perl 유전자의발현은 생후 1 일과 7일 사이에 높았는데 생후 10일 이후부터 21일까지 점차적으로 감소함을 확인할 수 있었고 생후 35일에 다시 증가함을 확인할 수 있었다. Per2 유전자는 생후 1일부터 성체인 생후 35일까지 점차적으로 증가함을 확인할 수 있었다. Peri 유전자의 발현은 성체가 되기까지 매우 낮게 발현되었고, Cryl 유전자의 경우는 생후 7일에 감소하였다가 10일부터 성숙이 완료될 때까지 발현량이 유지되는 양상을 나타내었다.
- 특히 Clock 유전자의 발현은 많은 난포가 성 장을 시작하는 생후 7일에 매우 높게 발현됨을 알 수 있었다. Perl 유전자의 발현은 생후 1 일과 7일 사이에 증가하다가 생후 10일 이후부터 21 일까지 점차적으로 감소하나 생후 35일에 다시 증가함을 확인할 수 있었다. 이것은 성장 중인 중간 크기의 난포가 높은비율로 폐쇄되는 현상이 나타나는 시기가 생후 10일부터 35 일이라는 점과 연관되어 낮게 발현된 것으로 추정할 수 있었으며, 따라서 Perl 유전자는 난포의 성장 및 발달과 연관되어있음을 추측할 수 있다.
- 1과 같다. Perl 유전자의발현은 생후 1 일과 7일 사이에 높았는데 생후 10일 이후부터 21일까지 점차적으로 감소함을 확인할 수 있었고 생후 35일에 다시 증가함을 확인할 수 있었다. Per2 유전자는 생후 1일부터 성체인 생후 35일까지 점차적으로 증가함을 확인할 수 있었다.
- 4, 8). 그러나 난소의 발달에 있어서 시교차상핵에서 분비되는 물질인 에 대한 수용체인 Prok2r 은 생후 7일에 발현되며, 이 시기 본 연구에서 확인한 일주기성 유전자들 중 Cryl을 제외한 모든 유전자들의 발현이 증가한 점에서 볼 때 중추신경계에서의 중앙 조절이 말초 조직의 주기성에 관여할 수 있을 것이라는 것을 추론해 볼 수 있었다.
- 그러나 본 연구의 결과 정소의 경우 발달의 단계에 따라일주기성 유전자의 발현이 서로 다른 양상을 보였으며, 특히생후 7일과 10일에서 상대적으로 높은 발현 양상을 보임이 관찰되었다. 정세포 형성 과정에 따른 Perl의 발현 양상 변화의 이유는 명확하지 않으나 성체 생쥐에서 Perl의 발현이 다시 나타나는 것으로 보아 Perl은 정세포 발달 및 성숙의 특정단계와 연관된 것으로 사료된다.
- Bmall, Clock 및 Cry2 유전자의 발현은 생후 7일에 높게 발현되어 성체까지 유지되는 것을 알 수 있었다. 난소에서 PER1 단백질의 발현 양상을 면역조직화학적 방법으로 확인한 결과 난포의 모든 발달단계(원시난포, 일차난포, 이차난포, 강소 형성전 난포 및 강소 형성 난포)에 걸쳐 PER1 단백질이 발현되었다(Fig. 2, 3). 난자 난구세포 복합체에서는 난자의 세포질과 난구세포에서 발현이 확인되었다.
- 난자 난구세포 복합체에서는 난자의 세포질과 난구세포에서 발현이 확인되었다. 날짜별 발달 단계에 따라 PER1 의 발현은 생후 1일과 7일에 증가하나, 생후 10일에서부터 21일 사이에 다소 감소하였으며, 생후 35일에 다시 증가하는 경향을 보였으며, 이는 Perl 유전자의 발현 양상과 일치하는 결과를 보였다.
- 5와 같았다. 대부분의 일주기 유전자들은 생후 1일에 비해 7일째에 증가하였으며, 생후 10일 이후에는 대체로 감소하는 경향을 보였다. 그러나 Cryl의 경우에는 다른 유전자의 발현과는 달리 생후 7일에서 감소하는 경향을 나타내었다.
- 확인할 수 있었다. 또한 난포 내 PER1 의 발현 양상에서 난자에서 먼 기저막쪽의 과립세포에서 보다 난자에 가까운 과립세포에서, 또 폐쇄중인 난포(apoptotic follicle)에서보다 건강한 난포에서 더욱 많이 발현되는 것을 확인할 수 있어, 난포 발달의 각 단계 동안 난자의 정상적인 발달과 밀접한 연관이 있을 것을 추측할 수 있었다(Fig. 2, 3). 상기 결과는 일주기성 유전자들이 유사분열의 조절에 관여하는 Weel 유전자의 전사조절에 관여한다는 보고와도 일치하는 결과를 보였다(Matsuo et al.
- 또한 시교차상핵에서 분비되어 표적 조직 또는 기관으로전달되는 물질로 알려진 Prokineticin 2의 수용체 인 Proklr과 Prok2r 유전자의 생식소 발달 단계별 발현 양상 변화는 Proklr의 경우 생후 7과 21일에, Prok2의 경우 7일에 난소에서 각각 강한 발현을 나타내었으며, 정소에서는 Proklr이 1, 7, 10일에서, Prok2r이 1일과 7일에서 각각 발현이 관찰되었으나, 시간이 지남에 따라 점차로 그 발현 양상이 감소하는경향을 보였다(Fig. 4, 8). 그러나 난소의 발달에 있어서 시교차상핵에서 분비되는 물질인 에 대한 수용체인 Prok2r 은 생후 7일에 발현되며, 이 시기 본 연구에서 확인한 일주기성 유전자들 중 Cryl을 제외한 모든 유전자들의 발현이 증가한 점에서 볼 때 중추신경계에서의 중앙 조절이 말초 조직의 주기성에 관여할 수 있을 것이라는 것을 추론해 볼 수 있었다.
- 면역조직화학적 방법으로 PER1 단백질의 발현을 확인한 결과 생후 1 일과 7일 정소의 Type A 정원세포와 응축정세포에서 PER1 의 발현(Fig. 6, 7)을 확인할 수 있었다. 생후 10일과 21 일의 Type A 정원세포에서는 상대적으로 PER1 의 발현이 적음을 확인할 수 있었으며, 이 러한 결과는 유전자의발현 양상과 일치하였다.
- 6, 7)을 확인할 수 있었다. 생후 10일과 21 일의 Type A 정원세포에서는 상대적으로 PER1 의 발현이 적음을 확인할 수 있었으며, 이 러한 결과는 유전자의발현 양상과 일치하였다.
- 1), 많은난포가 성장을 시작하는 시기인 생후 7일과 10일을 전후하여발현 양상이 변화함을 알 수 있었다. 생후 7일의 Cry2, Bmall 과 Clock 유전자의 발현 양상은 생후 1일에 비해 증가하였고, 성체가 되는 35일까지 점차적으로 증가함을 나타내었다. 특히 Clock 유전자의 발현은 많은 난포가 성 장을 시작하는 생후 7일에 매우 높게 발현됨을 알 수 있었다.
- 시교차상핵에서 분비되어 표적조직 또는 기관으로 전달되는 물질로 알려 진 에 대한 수용체 인 Proklr과 Prok2r 유전자의 경우 Prok2r은 생후 1일 이후 지속적으로 발현이 감소하여 성체인 35일에서는 발현되지 않음이 관찰되었으며, Prok2r은 1일과 7일에 높게 발현되었으나 그 이후에는 발현되지 않음을 확인할 수 있었다(Fig. 8).
- 시교차상핵에서 분비되어 표적조직 또는 기관으로 전달되는 물질로 알려진 Prokineticin 2의 수용체 인 Prokh과 Prok2r 유전자 또한 생후 7일에 강한 발현을 나타내었으며 Proklr의 경우는 생후 21일에서도 강한 발현을 보였다(Fig. 4).
- 이상의 연구들을 종합한 결과, 난소와 정소에서의 일주기성 clock 유전자의 발현은, 발생 단계별, 정상적인 난자와 폐쇄되는 난자에서 다양하면서도 뚜렷한 발현 양상의 차이를보임으로서 난소와 정소 내에서 정자와 난자의 정상적인 발달과 밀접한 연관이 있음을 추론할 수 있었으며, 또한 난소나정소에서 발현되는 일주기성 clock 유전자들은 정자와 난자발달의 각 단계에서 발달의 조절에 중요한 영향을 미칠 수있을 것으로 보였다. 현재까지 생식주기의 조절이나 발생 단계에서 성호르몬이 연관된 시상하부, 뇌하수체생식소의 중심축에 관한 연구가 매우 활발히 이루어져 왔으나, 이들 호르몬과 시상하부, 뇌하수체에 의한 조절의 상위 개념인 외부로부터의 자극의 수용과, 스스로의 주기를 가지고 이들에 영향을주는 일주기성 clock 유전자들에 의한 생식주기의 조절에 관한 연구는 아직까지 미흡한 단계이다.
- 일주기성을 나타내는 주요 유전자들과 난소와 정소의 발달 단계(생후 1, 7, 10, 21, 35일)에 따른 연관성을 추론하고자 한 본 연구의 결과, 각각의 일주기성 유전자들의 발현 양상은 난소의 발달 단계에 따라 서로 다르게 나타나며(Fig. 1), 많은난포가 성장을 시작하는 시기인 생후 7일과 10일을 전후하여발현 양상이 변화함을 알 수 있었다. 생후 7일의 Cry2, Bmall 과 Clock 유전자의 발현 양상은 생후 1일에 비해 증가하였고, 성체가 되는 35일까지 점차적으로 증가함을 나타내었다.
후속연구
- 현재까지 생식주기의 조절이나 발생 단계에서 성호르몬이 연관된 시상하부, 뇌하수체생식소의 중심축에 관한 연구가 매우 활발히 이루어져 왔으나, 이들 호르몬과 시상하부, 뇌하수체에 의한 조절의 상위 개념인 외부로부터의 자극의 수용과, 스스로의 주기를 가지고 이들에 영향을주는 일주기성 clock 유전자들에 의한 생식주기의 조절에 관한 연구는 아직까지 미흡한 단계이다. 본 연구의 결과, 일주기성 clock 유전자들도 생물의 생식주기 및 생식세포의 발달에 큰 영향을 미칠 수 있음을 강력하게 시사하여 차후 이에대한 다양한 연구가 진행되어야 할 것으로 생각된다.
- 정세포 형성 과정에 따른 Perl의 발현 양상 변화의 이유는 명확하지 않으나 성체 생쥐에서 Perl의 발현이 다시 나타나는 것으로 보아 Perl은 정세포 발달 및 성숙의 특정단계와 연관된 것으로 사료된다. 비록 일주기성 유전자들이결손된 동물들이 생식능력이 있다 하더라도(Bae et al, 2001; Bunger et al., 2000; Cermakian et al., 2000; Kume et al., 1999; van der Horst et al., 1999; Zheng et al, 2001) 본 실험의 결과에서 이러한 유전자들이 발생의 각 단계에 참여하는 것으로보여 정자 발생 과정의 특정 단계에 관여하거나 또는 단계 별전이에 참여할 가능성을 추론해 볼 수 있으며, 또한 정자의질이나 양과 관여 가능성도 생각해 볼 수 있어 추후 지속적인 연구가 필요하다고 생각된다.
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