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문제 정의
- 따라서 본 연구는 생쥐를 대상으로 사람 과배란 유도 방법과 비슷한 조건으로 PMSG와 GnRH-Ag를 투여한 후 생쥐 난소에 미치는 영향을 알아보았다.
- 따라서 본 연구에서는 사람과 배란 유도 과정중에 GnRH- Ag를 다량 투여하였음에도 불구하고 양질의 난자를 얻을 수있는 이유와 황체기 결함의 원인을 조사하고자 생쥐를 대상으로 PMSG와 GnRH-Ag를 사람 과배 란 유도 과정과 유사한 방법으로 투여 한 후 난소의 무게와 혈청내 estradiol과 proges- terone의 농도를 측정하고 난포내 세포자연사를 확인하였다.
제안 방법
- 2ml를 12시 간 간격으로 투여하였다. GnRH-Ag 투여군은 PMSG는 주사하지 않고 동일 기간 동안 12시간 간격으로 GnRH-Ag만을 10ug 씩 매회 주사하였다. PMSG+GnRH-Ag 투여군은 PMSG 주사 48시간 전부터 GnRH-Ag(buserelin acetate; Suprefact, Hoechst) 10ug을 12 시간 간격으로 투여한 후 PMSG를 주사하였다(Fig.
- 실험은 PMSG 투여군, GnRH-Ag 투여군, PMSG+ GnRH-Ag 투여군으로 나누어 시행하였다. PMSG 투여군은 PMSG만 투여하였으며 다른 군과 동일한 자극을 주기 위하여 PMSG 주사 48시 간 전부터 PBS 0.2ml를 12시 간 간격으로 투여하였다. GnRH-Ag 투여군은 PMSG는 주사하지 않고 동일 기간 동안 12시간 간격으로 GnRH-Ag만을 10ug 씩 매회 주사하였다.
- GnRH-Ag 투여군은 PMSG는 주사하지 않고 동일 기간 동안 12시간 간격으로 GnRH-Ag만을 10ug 씩 매회 주사하였다. PMSG+GnRH-Ag 투여군은 PMSG 주사 48시간 전부터 GnRH-Ag(buserelin acetate; Suprefact, Hoechst) 10ug을 12 시간 간격으로 투여한 후 PMSG를 주사하였다(Fig. 1).
- system (Cobra 口, Packard, USA)을 이용하여 측정하였다. 각 실험군에서 획득한 혈액은 원심분리하여 순수 혈청만을 분리한 후 E2와 P4를 측정하였다. E2의 정량은 Coat-A- Count Estradiol kit (DPC, USA)를 사용하였으며, 측정 가능한감도(sensitivity)는 0.
- 난소 조직 의 형 태 학적 관찰을 위 하여 4% NBF(Neutral Bu ffered Formalin)으로 고정하고 알콜 처리 과정을 거쳐 탈수시켰으며, xylene으로 투명화시킨 후 파라핀(Paraplast plus, Mo-noject)을 침투시켜 포매하였다. 박편절단기(Microtome, Lip- shaw)를 사용하여 4^m로 절편을 만든 다음 xylene으로 파라핀을 제거하고, 알콜 처리 과정을 거친 후 증류수로 세척하였다.
- 염색된 과립세포 및 황체 세포들을 광학현미경 하에서 검경하여 핵 응축(pyknotic nuclei) 또는 apoptotic body로 보이는 세포들을 관찰하였다. 난포의 갯수는 강소형성전 난포(pre-antral follicle), 강소형성 난포(antral follicle), 황체(corpus luteum)으로 구분하여 산정하였다.
- 먼저 GnRH-Ag가 생쥐 난소에 미치는 영향을 알아보기 위하여 GnRH-Ag 투여 후 난소의 무게를 측정 하고 난소내 세포자연사를 확인하였다. 실험 결과 PMSG만을 처리한 군에 비하여 GnRH-Ag만을 투여한 경우 난소의 무게는 유의하게 감소하였고 난포내 세포자연사가 증가한 것을 관찰할 수 있었다.
- 공급하여 실험에 사용하였다. 배란 시기를 동일하게 유도하기 위하여 phosphate buffered saline(PBS)에 녹인 preg nant mare's serum gonadotropin(PMSG; Sigma, St. Louis, MO)7.5IU를 복강 주사한 후 48시간에 생쥐의 몸무게를 측정하고 심장에서 혈액을 채취한 다음 난소를 획득하여 무게를 측정하였다. 실험은 PMSG 투여군, GnRH-Ag 투여군, PMSG+ GnRH-Ag 투여군으로 나누어 시행하였다.
- 5IU를 복강 주사한 후 48시간에 생쥐의 몸무게를 측정하고 심장에서 혈액을 채취한 다음 난소를 획득하여 무게를 측정하였다. 실험은 PMSG 투여군, GnRH-Ag 투여군, PMSG+ GnRH-Ag 투여군으로 나누어 시행하였다. PMSG 투여군은 PMSG만 투여하였으며 다른 군과 동일한 자극을 주기 위하여 PMSG 주사 48시 간 전부터 PBS 0.
- )으로 봉입하였다. 염색된 과립세포 및 황체 세포들을 광학현미경 하에서 검경하여 핵 응축(pyknotic nuclei) 또는 apoptotic body로 보이는 세포들을 관찰하였다. 난포의 갯수는 강소형성전 난포(pre-antral follicle), 강소형성 난포(antral follicle), 황체(corpus luteum)으로 구분하여 산정하였다.
- 002% H2O2가 들어있는 3, 3' -diaminobenzidine (DAB)을 5분간 처리하여 발색시킨 후 증류수로 세척하여 methylene blue로 이중 염색을 하였다. 염색이 끝난 조직은 탈수 과정을 거쳐 Canadian balsam으로 mounting하여 광학현미경하에서 세포자연사 여부를 관찰하였다. 난소내에서 세포 자연사가 일어난 난포의 비율은 전체 난포 수 중에 세포 자연사가 확인된 난포 수의 백분율(세포자연사가 확인된 난포 수 /전체난포 수×100)로 나타내었다.
- 혈 청내 estradiol (E2) 과 progesterone (P4) 농도의 정량은 y- counter system (Cobra 口, Packard, USA)을 이용하여 측정하였다. 각 실험군에서 획득한 혈액은 원심분리하여 순수 혈청만을 분리한 후 E2와 P4를 측정하였다.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용한 생쥐(6주령, ICR 계열)는 14시간/10시간(명/암) 조명 조건에서 3~4일간 적응시키고, 먹이와 물을 충분히 공급하여 실험에 사용하였다. 배란 시기를 동일하게 유도하기 위하여 phosphate buffered saline(PBS)에 녹인 preg nant mare's serum gonadotropin(PMSG; Sigma, St.
데이터처리
- 통계학적 유의성 검정은 one way ANOVA와 x2-test 방법을 사용하였으며 p 값이 0.05보다 작은 경우를 유의하다고 판정하였다.
이론/모형
- 세포자연사의 확인은 terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP- digoxigenin nick end-labeling(TUNEL) 방법 을 사용하였으며, in situ apoptosis detection kit(ApopTagR Plus; Oncor, Gaithersburg, MD)를 사용하였다. 준비된 조직은 탈 파라핀 과정을 거친 후 tris buffer로 세척하였다.
성능/효과
- 66mg과 7.IO±1.6Omg, GnRH-Ag 투여군에서 4.76± 1.44mg과 5.36+1.41 mg, PMSG+GnRH-Ag 투여군에서 6.68± 1.12mg과 6.48±L43mg으로서 GnRH-Ag만을 투여한 군에서 유의하게 난소 무게가 감소하였다(p<0.05) (Table 1).
- 2A). 각실험군에서 난소내 난포를 각 시기별로 구분하여 조사한 결과, PMSG 만을 투여한 군에서 강소형성전 난포 비율은 49.7 %, 강소형성 난포의 비율은 25.6%, 황체의 비율은 24.7%를 차지하고 있었으며, GnRH-Ag만을 투여한 실험군에서는 강소형성전 난포 비율은 61.2%, 강소형성 난포의 비율은 20.2 %, 황체의 비율은 18.6%로 PMSG 만을 투여한 군과 비교해볼 때 강소형성 난포와 황체의 비율은 줄어드는 반면 강소형성전 난포의 비율은 증가하는 것으로 나타났다. 반면 PMSG 와 GnRH-Ag을 함께 투여 한 군에 서는 강소형성 전 난포 비율은 50.
- 감소된 것으로 보인다. 그러나 투여된 GnRH-Ag가 난소 내세 포들의 세포자연사에 직접적으로 작용한 결과인지는 불분명하지만, GnRH-Ag에 의에 유도된 난소내 세포자연사 효과는 PMSG를 함께 투여해 줌으로써 그 효과가 억제됨을 알 수 있었다. E2의 생성 또한 PMSG를 함께 투여해 줌으로써 GnRH- Ag에 의에 감소되었던 농도가 다시 회복되는 것을 알 수 있었으나, P4의 생성은 완전히 회복되지 못하는 결과를 보여주었다.
- 3A). 난소내 난포에서 세포자연사를 조사한 결과 PMSG만을 투여한 경우 강소형성전 난포 중 1.6%, 강소형성 난포 중에 9.7%, 황체 중에 41.5%에서 세포자연사가 일어난 것을 확인할 수 있었다. GnRH-Ag와 PMSG를 함께투여한 군에서는 강소형성전 난포 중 2.
- 한편 GnRH-Ag와 PMSG를 함께 투여한 경우 난소 조직에서 세포자연사가 감소하고 난소 무게도 다시 회복되는 것을 알 수 있었다. 난소내 난포의 분포를 분석한 결과에서도 GnRH-Ag만을 투여한 군에서 강소형성전 난포의 비율이 증가한 반면, 강소형성 난포 및 황체의 비율은 감소한 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 다량의 GnRH-Ag 투여가 뇌하수체의 기능을 방해하여 성선자극호르몬의 분비를 억제시키고, 이로 인하여 난소내 난포의 발달이 억제되었기 때문으로 보인다.
- 6%로 PMSG 만을 투여한 군과 비교해볼 때 강소형성 난포와 황체의 비율은 줄어드는 반면 강소형성전 난포의 비율은 증가하는 것으로 나타났다. 반면 PMSG 와 GnRH-Ag을 함께 투여 한 군에 서는 강소형성 전 난포 비율은 50.4%, 강소형성 난포의 비율은 12.1%, 황체의 비율은 37.6%로 황체의 비율이 크게 증가하는 반면 강소형성 난포의 비율은 감소하는 것을 알 수 있었다(Fig. 2B).
- 32pg/ml으로 GnRH-Ag만을 투여 한 군에서 유의하게 감소하였다. 반면 혈청내 P4의 농도는 PMSG 투여군에서 15, 18+5.75ng/ml, PMSG+GnRH-Ag 투여군에서 7.91+1.99 ng/mi, GnRH-Ag 투여군에서 1.81+0.48ng/ml으로 PMSG만을 투여 한 군에 비하여 GnRH-Ag와 PMSG를 함께 투여 한 군에서 유의하게 감소하는 것을 알 수 있었고, 특히 GnRH-Ag만을 투여한 군에서 P4의 농도는 기저 수준으로 떨어짐을 확인 할 수 있었다(Fig. 4).
- 본 연구 결과를 종합하여 볼 때 GnRH-Ag의 장기 투여가 뇌하수체의 기능을 방해하여 성선자극 호르몬의 분비를 억제시키고, 이로 인하여 난소의 발달이 저해되어 부피와 무게가 감소된 것으로 보인다. 그러나 투여된 GnRH-Ag가 난소 내세 포들의 세포자연사에 직접적으로 작용한 결과인지는 불분명하지만, GnRH-Ag에 의에 유도된 난소내 세포자연사 효과는 PMSG를 함께 투여해 줌으로써 그 효과가 억제됨을 알 수 있었다.
- 확인하였다. 실험 결과 PMSG만을 처리한 군에 비하여 GnRH-Ag만을 투여한 경우 난소의 무게는 유의하게 감소하였고 난포내 세포자연사가 증가한 것을 관찰할 수 있었다. 한편 GnRH-Ag와 PMSG를 함께 투여한 경우 난소 조직에서 세포자연사가 감소하고 난소 무게도 다시 회복되는 것을 알 수 있었다.
- 이는 Broekmans 등(1996)과 Billig 등(1994)이 발표한 바와 같이 GnRH-Ag를 주입하면 혈청내 E2의 농도가 유의하게 감소된다는 논문과 같은 결과인 것을 확인할 수 있었다. 한편, GnRH-Ag와 PMSG를 함께 투여해 줌으로써 E?의 농도는 완전히 회복되어 PMSG만을 투여한 군과 같은 수준으로 증가한 반면, P4의 농도는 PMSG를 함께 투여했음에도 불구하고 회복하지 못하고 유의하게 감소한 것을 알 수 있었다. 이러한 난소내 steroidogenesis의 변화는 다량의 GnRH-Ag가 뇌하수체에 작용하여 탈감각 반응을 일으켜 성선자극호르몬의 방출을 억제함으로써 난소에 steroidogenesis를 간접적으로 억제시키는 효과로 설명할 수 있으나, 다른 한편으론 다량의 GnRH-Ag가 난소에 직접적으로 작용한 결과로 설명할 수 있다.
- E2의 생성 또한 PMSG를 함께 투여해 줌으로써 GnRH- Ag에 의에 감소되었던 농도가 다시 회복되는 것을 알 수 있었으나, P4의 생성은 완전히 회복되지 못하는 결과를 보여주었다. 이러한 결과는 사람 체외수정 및 배아이식 시술에 있어서 과배란 유도 과정중에 다량으로 사용한 GnRH-Ag가 회수된 난자의 상태에는 큰 영향을 미치지는 못하나, 황체기에 P4 생성에 감소를 가져와 황체기 결함을 유발시키고 또한 자궁 내막 발달을 억제시킴으로써 착상률을 저하시킬 수 있을 것으로 판단된다. 따라서 과배란 유도 과정중 GnRH-Ag를 투여한 환자에서는 자궁 내막을 착상에 알맞은 상태로 유지하기 위한 방법으로 GnRH-Ag를 사용하지 않은 환자에서보다 많은 P4을 배 아이식 후 투여해 줌으로써 황체기 결함을 보다 적극적으로 보완해야 할 것으로 사료된다.
- 41%에서 세포자연사가 일어났다. 이상의 결과에서 세포자연사가 일어난 강소형성 난포와 황체의 수는 PMSG만을 투여한 군과 비교해 볼 때 GnRH-Ag만 투여한 군에서는 증가하나 GnRH- Ag와 PMSG를 함께 투여한 군에서 다시 감소하는 것을 알수 있었다(Fig. 3B).
- 조직학적 관찰 결과 GnRH-Ag의 투여에 의한 난소 무게의감소에 따라 부피도 작아져 있었으며, GnRH-Ag와 PMSG를 함께 투여하였을 경우 GnRH-Ag를 단독으로 투여한 것보다는 난소의 부피가 증가하는 경향을 보여주었다(Fig. 2A). 각실험군에서 난소내 난포를 각 시기별로 구분하여 조사한 결과, PMSG 만을 투여한 군에서 강소형성전 난포 비율은 49.
- 한편 투여된 GnRH-Ag가 직접적으로 또는 간접적으로 난소 내 세포자연사를 유발시 켰는지는 불분명 하지 만, GnRH-Ag 에 의한 난소내 세포자연사 유발 효과는 PMSG를 함께 투여해 줌으로써 억제됨을 알 수 있었다. 현재 세포자연사를 유발시킬 수 있는 많은 요소들이 밝혀지고 있으며, 이러한 요소들 중 일부는 난포액 내에 존재하는 것으로 보고되고 있다(Billig et al.
- 혈청내 E2와 P4의 농도를 측정한 결과 GnM-Ag만을 투여한 군에서 E2와 P4의 농도가 모두 유의 하게 감소하였다. 이는 Broekmans 등(1996)과 Billig 등(1994)이 발표한 바와 같이 GnRH-Ag를 주입하면 혈청내 E2의 농도가 유의하게 감소된다는 논문과 같은 결과인 것을 확인할 수 있었다.
- 혈청내 E2와 P4의 농도를 측정한 결과 PMSG 투여 48시간 후 혈청내 E2 농도는 PMSG 투여군에서 26.92+3.19pg/ml, PMSG +GnRH-Ag 투여군에서 25.34+1.78p0ml, GnRH-Ag 투여군에서 12.44+1.32pg/ml으로 GnRH-Ag만을 투여 한 군에서 유의하게 감소하였다. 반면 혈청내 P4의 농도는 PMSG 투여군에서 15, 18+5.
후속연구
- 이러한 결과는 사람 체외수정 및 배아이식 시술에 있어서 과배란 유도 과정중에 다량으로 사용한 GnRH-Ag가 회수된 난자의 상태에는 큰 영향을 미치지는 못하나, 황체기에 P4 생성에 감소를 가져와 황체기 결함을 유발시키고 또한 자궁 내막 발달을 억제시킴으로써 착상률을 저하시킬 수 있을 것으로 판단된다. 따라서 과배란 유도 과정중 GnRH-Ag를 투여한 환자에서는 자궁 내막을 착상에 알맞은 상태로 유지하기 위한 방법으로 GnRH-Ag를 사용하지 않은 환자에서보다 많은 P4을 배 아이식 후 투여해 줌으로써 황체기 결함을 보다 적극적으로 보완해야 할 것으로 사료된다.
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