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문제 정의
- feoB 유전자가 철 결핍 상태에 있어서의 철 흡수에 있어서 중심적인 역할을 하기 때문에 본 연구에서 저자들은 철 결핍성 빈혈 유무에 따른 H. pylori feoB 유전자의 비교 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 10∼18세 사이, 14명의 H. pylori 양성인 환자들을 철 결핍성 빈혈 유무에 따라 두 군으로 분류하였다. 철 결핍성 빈혈은 ferritin level ＜12 ng/mL, transferrin saturation ＜15%, hemoglobin ＜12 g/dL를 모두 만족할 때로 정의하였는데13), 8명이 철 결핍성 빈혈에 해당되었다.
- , 37℃의 환경에서 48∼72시간을 배양하였다. Genomic DNA는 Wizard genomic DNA purification kit (Promega, USA)을 사용하여 추출하였다.
- feoB 유전자는 feoB region의 sequencing을 위해 genomic DNA로부터 증폭되었다. H. pylori J99와 26695 feoB 유전자에 근거한 4개의 primer를 준비하고(Table 1) 먼저 FeoB-R/F primer로 총 feoB 유전자를 증폭하였다. 효율적인 sequencing을 위하여 FeoB-A∼D primer로 전체 유전자를 작은 크기의 DNA 조각으로 나누었다.
- 5 unit, primer 20 pmole, 10 PCR buffer, 25 mM dNTP mix를 첨가한 뒤, 3차 증류수로 최종 부피를 50 L로 맞추었다. PCR 반응은 먼저 95℃에서 초기변성을 5분 동안 시키고, 94℃ 1분, 62℃ 1분, 72℃ 1분의 반응을 30번 반복하였으며, 마지막 단계에서 72℃ 10분 간 신장 과정을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 ethidium bromide를 첨가하여 전기영동으로 크기를 확인하였다.
- 반응이 일어난 산물만을 순수 분리하기 위해 100% ethanol로 DNA를 침전시킨 뒤, 70% ethanol로 washing하여 완전히 말린 후 Big dye용 loading buffer 4μL로 녹여 얼음에 보관하였다. Sequencing용 젤은 6% acrylamide solution 50μL, TEMED 35μL, 10% ammonium persulfate 250 L를 첨가하여 기포가 생기지 않도록 잘 섞은 뒤, 젤 판에 부어한 시간 정도 굳힌 다음 사용하였으며, 시료는 끓는 물에서 3분 동안 변성시킨 뒤 젤에 올려 ABI prism 377 Genetic analyzer (Perkin Elmer, Norwalk, CT, USA)를 사용하여 sequencing하였다. Sequencing한 결과는 NCBI의 Blast 프로그램을 사용하여 표준 균주와 비교되었다.
- Sequencing을 위해서 DNA sequencing kit (ABI Prism, USA)을 사용하였다. 다른 두 개의 tube에 primer F, R을 각각 20 pmol이 되도록 첨가하고, 순수 분리한 PCR 산물을 각각 5μL, Big dye 4μL를 첨가하여 96℃에서 10초, 50℃에서 5초, 60℃에서 4분씩의 과정을 25회 반복하는 Big dye reaction을 수행하였다.
- Sequencing을 위해서 DNA sequencing kit (ABI Prism, USA)을 사용하였다. 다른 두 개의 tube에 primer F, R을 각각 20 pmol이 되도록 첨가하고, 순수 분리한 PCR 산물을 각각 5μL, Big dye 4μL를 첨가하여 96℃에서 10초, 50℃에서 5초, 60℃에서 4분씩의 과정을 25회 반복하는 Big dye reaction을 수행하였다. 반응이 일어난 산물만을 순수 분리하기 위해 100% ethanol로 DNA를 침전시킨 뒤, 70% ethanol로 washing하여 완전히 말린 후 Big dye용 loading buffer 4μL로 녹여 얼음에 보관하였다.
- 철 결핍성 빈혈은 ferritin level ＜12 ng/mL, transferrin saturation ＜15%, hemoglobin ＜12 g/dL를 모두 만족할 때로 정의하였는데13), 8명이 철 결핍성 빈혈에 해당되었다. 모든 환자에서 위십이지장 내시경 검사를 시행하였으며, 위십이지장의 점막에서 출혈 또는 궤양은 없었다. 대변에 대한 잠혈 검사(monoclonal antibody to human hemoglobin, Kit OC Haemodia; Eiken Chemical Co.
- 효율적인 sequencing을 위하여 FeoB-A∼D primer로 전체 유전자를 작은 크기의 DNA 조각으로 나누었다. 상동성이 낮은 A 부분은 증폭되지 않아서 FeoB-A1과 FeoB-A2라는 새로운 primer를 사용하였는데, FeoB-A1는 표준 균주를 기본으로 제작하였고 FeoB-A2는 이 A1 PCR 산물의 sequence 분석을 이용하여 만들었다. 증폭된 산물을 전기영동 하였다(Fig.
- pylori J99, 26695와 비교하였다. 염기서열의 비교는 철 결핍성 빈혈 유무군 간에도 이루어졌다. feoB 유전자의 완전한 염기 분석으로 16개의 다형성 돌연변이가 확인되었다(Fig.
- PCR 반응은 먼저 95℃에서 초기변성을 5분 동안 시키고, 94℃ 1분, 62℃ 1분, 72℃ 1분의 반응을 30번 반복하였으며, 마지막 단계에서 72℃ 10분 간 신장 과정을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 ethidium bromide를 첨가하여 전기영동으로 크기를 확인하였다. 크기를 확인한 산물은 다음 단계의 sequencing에 사용하기 위하여 PCR clean-up kit (Genenmed, USA)을 이용하여 순수한 DNA만을 분리하였다.
- 상동성이 낮은 A 부분은 증폭되지 않아서 FeoB-A1과 FeoB-A2라는 새로운 primer를 사용하였는데, FeoB-A1는 표준 균주를 기본으로 제작하였고 FeoB-A2는 이 A1 PCR 산물의 sequence 분석을 이용하여 만들었다. 증폭된 산물을 전기영동 하였다(Fig. 1). 반응은 template, Taq DNA polymerase 2.
- 증폭된 PCR 산물은 ethidium bromide를 첨가하여 전기영동으로 크기를 확인하였다. 크기를 확인한 산물은 다음 단계의 sequencing에 사용하기 위하여 PCR clean-up kit (Genenmed, USA)을 이용하여 순수한 DNA만을 분리하였다.
- pylori J99와 26695 feoB 유전자에 근거한 4개의 primer를 준비하고(Table 1) 먼저 FeoB-R/F primer로 총 feoB 유전자를 증폭하였다. 효율적인 sequencing을 위하여 FeoB-A∼D primer로 전체 유전자를 작은 크기의 DNA 조각으로 나누었다. 상동성이 낮은 A 부분은 증폭되지 않아서 FeoB-A1과 FeoB-A2라는 새로운 primer를 사용하였는데, FeoB-A1는 표준 균주를 기본으로 제작하였고 FeoB-A2는 이 A1 PCR 산물의 sequence 분석을 이용하여 만들었다.
데이터처리
- 93 kb의 feoB region이 생성되었다. 14개의 H. pylori 균주로부터 얻어진 feoB region의 염기 및 아미노산 서열을 Genbank에서 얻은 H. pylori J99, 26695와 비교하였다. 염기서열의 비교는 철 결핍성 빈혈 유무군 간에도 이루어졌다.
- Fisher's exact test로 철 결핍성 빈혈 유무를 기준으로 나눈 군 간의 feoB 유전자와 임상적 표현형 간의 관계를 확인하였다. 0.
- Sequencing용 젤은 6% acrylamide solution 50μL, TEMED 35μL, 10% ammonium persulfate 250 L를 첨가하여 기포가 생기지 않도록 잘 섞은 뒤, 젤 판에 부어한 시간 정도 굳힌 다음 사용하였으며, 시료는 끓는 물에서 3분 동안 변성시킨 뒤 젤에 올려 ABI prism 377 Genetic analyzer (Perkin Elmer, Norwalk, CT, USA)를 사용하여 sequencing하였다. Sequencing한 결과는 NCBI의 Blast 프로그램을 사용하여 표준 균주와 비교되었다. DNA 번역 소프트웨어로 염기 서열을 아미노산 서열로 바꾸었으며 표준 균주와 상동성이 비교되었다.
성능/효과
- 5개의 PCR 산물을 연결함으로써 1.93 kb의 feoB region이 생성되었다. 14개의 H.
- 2). Genbank의 표준 균주와 비교해본 결과 이들 중에 3개의 다형성(Glu/Thr254Ala, Ile263Val, 그리고 Lys511Gln)은 외국 보고에서는 발견되지 않아 한국에만 있는 고유한 것이라고 판단되었다. Start codon에도 차이가 있었는데, 표준 균주의 start codon은 ATG였으나 한국의 임상 균주에서는 GTG였다(Fig.
- 염기서열의 비교는 철 결핍성 빈혈 유무군 간에도 이루어졌다. feoB 유전자의 완전한 염기 분석으로 16개의 다형성 돌연변이가 확인되었다(Fig. 2). Genbank의 표준 균주와 비교해본 결과 이들 중에 3개의 다형성(Glu/Thr254Ala, Ile263Val, 그리고 Lys511Gln)은 외국 보고에서는 발견되지 않아 한국에만 있는 고유한 것이라고 판단되었다.
- 결론적으로, 저자들은 한국의 임상 균주에서 표준 균주와는 다른 16개의 다형성 위치들을 발견하였다. 철 결핍성 빈혈유무에 따른 군간 비교에서 유의한 통계적인 차이는 발견되나, 실제적 차이라고 보기에는 표본의 수가 너무 적다.
- pylori 양성은 CLO test (Delta West, Perth, Australia)와 Giemsa 염색에서 양성 소견이 나올 때로 정의하였다. 내시경으로 채취한 생검 조직들에 대한 CLO test와 Giemsa 염색의 결과 모든 환자들이 H. pylori에 양성인 것으로 나타났다. H.
- 이 단백질들은 세포질막 단백질인 Tonb, ExbB 그리고 ExbD와 함께 철 수송에 관여할 것으로 여겨진다17). 둘째, H. pylori는 E. coli의 membrane permiase와 ATPbinding protein인 fecD와 fecE 유전자와 유사한 유전자를 갖고 있다. 셋째, H.
- coli의 membrane permiase와 ATPbinding protein인 fecD와 fecE 유전자와 유사한 유전자를 갖고 있다. 셋째, H. pylori는 feoB 유전자와 상동성을 보임으로써 이것이 혐기성 조건 하에서의 철 획득에 관여하는 E. coli FeoAB system과 닮았음을 보여준다. 그러나 feoA homolog는 H.
- pylori J99와 26695의 DNA 염기 서열을 비교해 보면 잠재적인 철 흡수 시스템이 존재함을 알 수 있다14∼16). 첫째, H. pylori는 Escherichia coli의 Fe3+-dicitrate 운반체인 fec 유전자와 염기서열의 상동성이 있다. 이들은 fecA1, fecA2와 fecA3으로서 알려져 있고 세포 외막의 운반체로 간주된다.
- 한국의 임상 균주와 표준 균주 26695, J99간의 H. pylori feoB region의 서열 분석을 통해 한국의 H. pylori feoB 유전자에서 16개의 다형성을 발견할 수 있었다. 임상 균주의 아미노산 서열은 표준 균주와 상당한 유사성을 보였으나 몇몇에서는 차이를 보였다.
후속연구
- 0003) 위치에서 유의한 통계적인 차이가 발견되었는데 실험 대상 수가 적어 이에 대해서는 더 많은 임상 균주들의 분석이 필요할 것으로 보인다. 또한, DNA 서열의 변이가 전체 단백질 기능에 영향을 미치는 돌연변이인지 아니면 염기 배열상의 단순한 다형성인지를 감별하기 위해서도 FeoB 단백질의 기능에 대한 다양한 연구가 필요할 것으로 보인다.
- E/T254A, I263V와 K511Q는 한국 임상 균주의 고유한 다형성이었다. 철 결핍성 빈혈 유무에 따른 군 간에 127 (p=0.0150), 273 (p=0.0067), 438 (p=0.0310)과 441 (p=0.0003) 위치에서 유의한 통계적인 차이가 발견되었는데 실험 대상 수가 적어 이에 대해서는 더 많은 임상 균주들의 분석이 필요할 것으로 보인다. 또한, DNA 서열의 변이가 전체 단백질 기능에 영향을 미치는 돌연변이인지 아니면 염기 배열상의 단순한 다형성인지를 감별하기 위해서도 FeoB 단백질의 기능에 대한 다양한 연구가 필요할 것으로 보인다.
- 철 결핍성 빈혈유무에 따른 군간 비교에서 유의한 통계적인 차이는 발견되나, 실제적 차이라고 보기에는 표본의 수가 너무 적다. 철 결핍성 빈혈과 H. pylori 감염의 연관성을 증명하기 위해, 더 많은 다원적 연구가 필요할 것이다.
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