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문제 정의
- 본 연구에서는 아미노산의 대사 프로필을 하고자 HPLC/FLD를 이용하여 생체액 조건에서 분석 및 실험 조건을 최적화하여 분석하는 방법을 연구하였다. 대상 시료를 최소 배지로 하여 극미량의 19 종 아미노산을 검출하기 위해 OPA/3-MPA 유도체화법을 선택하여 HPLC/FLD 분석조건을 최적화하였다.
- 본 연구에서 생체내 세포 부유물이나 생체액에 존재하는 미량의 19 종의 유리 아미노산 대사체의 검출을 위하여 최소 배지를 바탕 시료로 injector program을 최적화 하여 on-line으로 OPA/3-MPA 유도체화 시킨 후 HPLC/FLD를 사용하였다. 이를 통하여 다량의 시료에서 안정적으로 pmol scale의 정량값을 얻을 수 있는 분석법을 설정하고자 하였다.
제안 방법
- 2). 19 종 아미노산 유도체는 극성의 범위가 넓기 때문에 아미노산 유도체의 분리를 위해 Table 1과 같이 기울기 용리를 최적화 하였다. 형광 검출을 위해서 아미노산 유도체의 특징적인 excitation (340 nm)과 emission (450 nm)에서 검출하였다.
- 예상되는 시료의 농도 (pmol)에 적합하도록 OPA/3- MPA 유도체화 시약을 제조하였고, 유도체화 반응의 안정성을 확인 하였다. OPA/3-MPA 유도체화물의 시간에 대한 안정성을 보완하기 위하여 최적화된 injector program으로 유도체화 반응의 과정을 일률적으로 처리하여 정량성을 개선하였다. 생체시료의 단백질을 제거를 위해서는 acetonitrile로 전처리하는 것이 효율적이었다.
- OPA와 3-MPA 그리고 아미노산의 농도와 시료의 부피의 적정 비를 환산해 총 시료의 부피가 유도체화 반응시약의 부피의 20 배일 때 유도체화가 최적으로 이루어지도록 조절하였다. 이를 injector program에 적용하면 시료 주입량이 20 ㎕일 때 유도체화 반응 시약은 1 ㎕가 loop에서 혼합되어야 한다.
- 단백질이 제거된 상층부만 분취하여 질소 증발기를 사용하여 건조시켰다. 건조된 잔류물질을 200 ㎕의 증류수로 녹인 후 syringe filter(0.2 ㎛ I.D.)를 통과시켜 시료를 분석하였다 (Fig. 1).
- 18 일반적인 유도체화 반응의 경우, 유도체화 시약은 분석물의 농도에 비해 과량을 넣어 유도체화 반응을 시킨다. 그러나 높은 OPA 농도는 isoindole 유도체의 높은 불안정성을 유발시키기 때문에, side product peak의 생성을 최대한 감소시키고 검출 한계를 향상시킬 수 있도록 OPA와 3-MPA 간의 몰농도를 조절하여 유도체화 시약을 제조하였다.
- 여기에 단백질을 제거하기 위해 acetonitrile 2 ㎖ 첨가하여 원심 분리 (3000 rpm, 10분) 하였다. 단백질이 제거된 상층부만 분취하여 질소 증발기를 사용하여 건조시켰다. 건조된 잔류물질을 200 ㎕의 증류수로 녹인 후 syringe filter(0.
- 본 연구에서는 아미노산의 대사 프로필을 하고자 HPLC/FLD를 이용하여 생체액 조건에서 분석 및 실험 조건을 최적화하여 분석하는 방법을 연구하였다. 대상 시료를 최소 배지로 하여 극미량의 19 종 아미노산을 검출하기 위해 OPA/3-MPA 유도체화법을 선택하여 HPLC/FLD 분석조건을 최적화하였다.
- 유도체화 반응은 예상되는 시료의 농도에 적합하도록 o-phthalaldehyde (OPA)와 3-mercaptopropionic acid (3-MPA)의 몰농도 비율을 조절하였다. 또한 과량의 반응시약으로 인한 크로마토그램의 오염을 방지하기 위해서 시료와 반응시약간의 부피비를 20:1 (v/v)이 되도록 농도를 조절하여 혼합하였다.
- 본 실험에서는 최소 배지 시료의 아미노산을 OPA/3-MPA로 유도체화하여 형광을 나타내는 isoindole 체 (ex: 340 nm, em: 450 nm)를 형성시켜 분석하였다. OPA 유도체화는 기본적으로 OPA에 alkyl-thiol을 치환시킨 형태로 3-MPA 경우는 카복실기가 OPA를 안정시킴으로써 다른 OPA-thiol 치환체보다 상대적으로 좋은 형광 (10-55%)과 안정성을 가진다.
- 본 연구에서 생체내 세포 부유물이나 생체액에 존재하는 미량의 19 종의 유리 아미노산 대사체의 검출을 위하여 최소 배지를 바탕 시료로 injector program을 최적화 하여 on-line으로 OPA/3-MPA 유도체화 시킨 후 HPLC/FLD를 사용하였다. 이를 통하여 다량의 시료에서 안정적으로 pmol scale의 정량값을 얻을 수 있는 분석법을 설정하고자 하였다.
- 생체 시료에의 적용을 위하여, 위의 분석 조건으로 실제 뇌세포를 배양하여 대사 프로필을 확인하였다. 시상하부의 suprachiasmatic nucleus라는 세포를 배양한 후, 5 세트의 세포에서 자발적으로 용출하는 아미노산을 3 시간 간격으로 60 시간 동안 19 종 아미노산의 변화를 확인하였다.
- 시료 주입은 HPLC의 주입기 내에서 OPA/3-MPA 시약 0.2 ㎕를 취하고 증류수로 needle을 세척한 후 시료 4 ㎕를 취하는 과정을 5번 반복하여, 총 시료량 20 ㎕와 OPA/3-MPA 유도체화 시약 1 ㎕를 injection port 앞부분에 있는 100 ㎕ loop에서 혼합하여 유도체화 한 후에 주입하였다 (Table 1).
- 생체 시료에의 적용을 위하여, 위의 분석 조건으로 실제 뇌세포를 배양하여 대사 프로필을 확인하였다. 시상하부의 suprachiasmatic nucleus라는 세포를 배양한 후, 5 세트의 세포에서 자발적으로 용출하는 아미노산을 3 시간 간격으로 60 시간 동안 19 종 아미노산의 변화를 확인하였다.
- 아미노산의 정량을 위하여 대상 매트릭스인 media에 각 아미노산 0.5 - 100 ppb 범위의 농도가 되도록 하여, 전처리 과정을 통해 내부표준물질에 대한 면적비로 부터 표준 검량선을 구하였다 (Table 5). 모든 아미노산 유도체의 검량선의 직선성은 모두 0.
- 예상되는 시료의 농도 (pmol)에 적합하도록 OPA/3- MPA 유도체화 시약을 제조하였고, 유도체화 반응의 안정성을 확인 하였다. OPA/3-MPA 유도체화물의 시간에 대한 안정성을 보완하기 위하여 최적화된 injector program으로 유도체화 반응의 과정을 일률적으로 처리하여 정량성을 개선하였다.
- 유도체화 반응은 예상되는 시료의 농도에 적합하도록 o-phthalaldehyde (OPA)와 3-mercaptopropionic acid (3-MPA)의 몰농도 비율을 조절하였다. 또한 과량의 반응시약으로 인한 크로마토그램의 오염을 방지하기 위해서 시료와 반응시약간의 부피비를 20:1 (v/v)이 되도록 농도를 조절하여 혼합하였다.
- 컬럼 분리전에 시료를 유도체화를 시켜 (pre-column 법) 컬럼에서 분리 분석하는 OPA/3-MPA 법은 유도체화물이 불안정한 단점을 갖는다. 이를 개선하기 위해 injector program으로 전처리한 생체 시료를 AOLS (Automatic on-line system)를 이용하여 HPLC에 주입하기 전에 동일한 유도체화 과정과 환경으로 유도체화 시킨 후, 시료를 분석하여 유도체화물의 정량 재현성을 개선하였다.
- 19 종 아미노산 유도체는 극성의 범위가 넓기 때문에 아미노산 유도체의 분리를 위해 Table 1과 같이 기울기 용리를 최적화 하였다. 형광 검출을 위해서 아미노산 유도체의 특징적인 excitation (340 nm)과 emission (450 nm)에서 검출하였다. 또한 분리 컬럼을 세척하기 위해 10분간의 post time을 주었으며 시료의 용리액에 대한 용해도를 높이고 용리액의 점도를 감소시켜서 컬럼 내의 압력을 낮추기 위해 column oven 온도를 40 ℃로 고정시켜 주었다.
대상 데이터
- 19 종의 아미노산 표준품과 내부표준물질 (norvaline)은 각각 0.1M HCl 용액에 녹여 1000 ㎍/㎖가 되도록 조제하여 -20 ℃에 보관하고 필요에 따라 묽혀서 사용하였다. 최소 배지는 NaCl, MgSO4, NaH2PO4, KCl, CaCl2, D-glucose, HEPES (N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N'-(2-ethanesulfonic acid)의 적정 배합으로 제조하였다.
- A)의 HPLC 1100 Series (DR5 solvent delivery system, variable volumn autoinjector, temperature controlled column compartment)를 사용하였다. 검출기로는 Agilent Technologies 1046A fluorescence detector (FLD)를 사용하였고, 자료의 정리에는 HP Vectra 5000 컴퓨터와 HP 870K Deskjet 프린터를 사용하였다. 분리용 컬럼은 Agilent Technologies 사 (Palo alto, CA, U.
- 본 연구에 사용된 19 종의 아미노산 표준품과, 내부표준물질 (norvaline), o-phthalaldehyde (OPA), 3-mercaptopropionic acid (3-MPA) 등은 Sigma사 (St. Louis, MO, U.S.A.) 제품이며, methanol, acetonitrile 등은 HPLC 용을 Whatman (Kent, UK)사의 membrane filter (pore size 0.2 ㎛)로 여과하여 사용하였고, 기타 시약들은 1급 또는 특급 시약을 사용하였다. 증류수는 Milli-Q 및 Milli-RO system을 통과한 3차 증류수를 Whatman사의 membrane filter (pore size 0.
- 본 연구에서 사용한 기기는 유도체화된 표준물질을 분리시키기 위하여 Agilent Technologies 사 (Palo alto, CA, U.S.A)의 HPLC 1100 Series (DR5 solvent delivery system, variable volumn autoinjector, temperature controlled column compartment)를 사용하였다. 검출기로는 Agilent Technologies 1046A fluorescence detector (FLD)를 사용하였고, 자료의 정리에는 HP Vectra 5000 컴퓨터와 HP 870K Deskjet 프린터를 사용하였다.
- 검출기로는 Agilent Technologies 1046A fluorescence detector (FLD)를 사용하였고, 자료의 정리에는 HP Vectra 5000 컴퓨터와 HP 870K Deskjet 프린터를 사용하였다. 분리용 컬럼은 Agilent Technologies 사 (Palo alto, CA, U.S.A)의 Zorbax Extended-C18 (4.6 ㎜ I.D.×150 ㎜, 5㎛)을 사용하였고, 시료의 전처리를 위해 Thermolyne사 (Spark, NV, U.S.A)의 16500 Dry bath와 Zymark (Hopkinton, MA, U.S.A) 사의 Turbo Vap LV evaporator 및 Heeaeus사의 Varifuge-F 원심분리기를 사용하였다.
- 2 ㎛)로 여과하여 사용하였고, 기타 시약들은 1급 또는 특급 시약을 사용하였다. 증류수는 Milli-Q 및 Milli-RO system을 통과한 3차 증류수를 Whatman사의 membrane filter (pore size 0.2 ㎛)로 여과한 것을 사용하였다.
- 1M HCl 용액에 녹여 1000 ㎍/㎖가 되도록 조제하여 -20 ℃에 보관하고 필요에 따라 묽혀서 사용하였다. 최소 배지는 NaCl, MgSO4, NaH2PO4, KCl, CaCl2, D-glucose, HEPES (N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N'-(2-ethanesulfonic acid)의 적정 배합으로 제조하였다.
성능/효과
- 19 종 아미노산의 표준 검정 곡선은 0.5 - 100.0 ppb 의 범위에서 r2=0.99 이상의 직선성을 나타냈으며, 검출 한계는 1.70 pmol(GLU) - 23.81 pmol(SER) 범위로 측정되었다. 이를 통해 다량의 세포를 대상으로 하는 대사 프로필을 위해 감도가 우수하고 안정적으로 정량할 수 있는 분석법을 응용한 결과 suprachiasmatic nucleus의 19 종 아미노산의 시간에 따른 정량적인 프로필 변화를 확인할 수 있었다.
- 6은 시료 20 ㎕와 유도체 시약 1 ㎕를 단순히 혼합했을 경우 (general)와, 같은 양을 5번 분할 (separate control)하여 혼합했을 때를 비교한 것이다. Injector에서 mixing step은 100 ㎕의 loop에서 이루어지는 것으로 반응시약과 시료간의 혼합이 어렵기 때문에, 같은 양을 5번 분할하여 혼합함으로써 크로마토그램에서 mixing의 비효율로 후반 시간대 나타나는 hydrophobic한 side product peak을 감소시키고 바탕선을 안정화시킬 수 있었다.
- 4는 OPA/3-MPA 시약에서 3-MPA의 몰농도 비율에 따른 크로마토그램을 비교한 것이다. OPA:3-MPA의 몰농도 비율이 1:30인 경우와 1:3일 경우를 비교한 결과 OPA:3-MPA=1:3인 경우 side product의 생성이 감소하여 LC 크로마토그램상의 base line이 안정화되어 분리도와 감도를 향상시킬 수 있었다. OPA/3-MPA 유도체의 경우 좋은 감도를 나타내는 1-alkylthio-2-alkyl substituted isoindole을 형성하지만, 이와 같은 impurity peak이 나타나는 이유는 과량의 3-MPA 시약이 첨가될 경우 1,3-dithio-substituted-2-alkyl substituted isoindole을 형성하기 때문으로 알려져 있다.
- 5 - 100 ppb 범위의 농도가 되도록 하여, 전처리 과정을 통해 내부표준물질에 대한 면적비로 부터 표준 검량선을 구하였다 (Table 5). 모든 아미노산 유도체의 검량선의 직선성은 모두 0.99이상이었고, 검출 한계 (S/N=3)는 1.70 pmol (0.5 ppb; GLU)에서 23.81 pmol (5 ppb; SER) 범위로 측정되었다.
- OPA/3-MPA 유도체화물의 시간에 대한 안정성을 보완하기 위하여 최적화된 injector program으로 유도체화 반응의 과정을 일률적으로 처리하여 정량성을 개선하였다. 생체시료의 단백질을 제거를 위해서는 acetonitrile로 전처리하는 것이 효율적이었다.
- 실제 배양한 시료에서 모든 종류의 아미노산이 검출 한계 이상으로 검출 되었고, 시간에 따른 유무 및 증감의 변화가 나타났다. 이런한 증가 감소가 시간에 따른 주기적인 패턴으로 확인 되지는 않았지만, 각 아미노산의 최대 검출량은 5 세트에서 모두 비슷한 경향으로 나타났다 (Table 6).
- 81 pmol(SER) 범위로 측정되었다. 이를 통해 다량의 세포를 대상으로 하는 대사 프로필을 위해 감도가 우수하고 안정적으로 정량할 수 있는 분석법을 응용한 결과 suprachiasmatic nucleus의 19 종 아미노산의 시간에 따른 정량적인 프로필 변화를 확인할 수 있었다. 이는 대조군 실험의 추가를 통해 본 세포에서의 아미노산 대사체의 구체적 변화형태를 확인 할 수 있으리라 예상된다.
후속연구
- 결과적으로 위와 같은 분석법의 응용을 통하여 suprachiasmatic nucleus의 세포에서 용출하는 pmol 수준의 아미노산량의 프로필 확인이 가능하였으며, 본 세포의 대조군의 프로필과 비교가 이루어 진다면, suprachiasmatic nucleus에 있어서 아미노산 대사의 프로필 변화가 확인되리라 예상된다.
- 이를 통해 다량의 세포를 대상으로 하는 대사 프로필을 위해 감도가 우수하고 안정적으로 정량할 수 있는 분석법을 응용한 결과 suprachiasmatic nucleus의 19 종 아미노산의 시간에 따른 정량적인 프로필 변화를 확인할 수 있었다. 이는 대조군 실험의 추가를 통해 본 세포에서의 아미노산 대사체의 구체적 변화형태를 확인 할 수 있으리라 예상된다.
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