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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 다량의 비타민 C가 정상 세포매개면역에 미치는 영향을 알아보고자 하였으며, 이를 위해 생쥐에게 다량의 비타민 C를 복강으로 투여한 후 DTH (Delayed Type Hypersensitivity, 지연형 과민반응)를 유도하고 그 진행과정을 살펴보았다. 또한 혈장을 비롯한 여러 장기 내의 비타민 C 축적 정도를 확인하여 비타민 C가 세포매개면역반응에 영향을 미치는 기전을 파악하고자 하였다.
- 따라서 본 연구에서는 다량의 비타민 C가 정상 세포매개면역에 미치는 영향을 알아보고자 하였으며, 이를 위해 생쥐에게 다량의 비타민 C를 복강으로 투여한 후 DTH (Delayed Type Hypersensitivity, 지연형 과민반응)를 유도하고 그 진행과정을 살펴보았다. 또한 혈장을 비롯한 여러 장기 내의 비타민 C 축적 정도를 확인하여 비타민 C가 세포매개면역반응에 영향을 미치는 기전을 파악하고자 하였다.
- 본 실험에서는 다량 투여된 비타민 C가 세포매개 면역반응(cell-mediated immune response)에 미치는 영향을 DNFB로 유도한 DTH 반응을 통해 알아보고자 하였다. 대개의 척추동물과는 달리 사람은 비타민 C 생합성 단계의 마지막 효소인 L-gulonolactone oxidase의 돌연변이로 인하여 비타민 C의 자체 생합성을 하지 못하고 외부에서 섭취하여야 한다(27).
제안 방법
- 3주간 지속적으로 매일 2.5 mg, 5 mg, 10 mg의 비타민 C를 투여한 후 생쥐를 희생시키고 지라를 적출하여 세포 5,000개당 비타민 C의 농도를 측정하였다. 그 결과 비타민 C를 투여하지 않은 대조군의 지라세포에는 세포 5,000개당 약 1.
- 2% in 4：1 acetone/olive oil)를 생쥐의 오른쪽 귓바퀴 표면에 발라주어 DTH를 유발하였다(25). DTH 유발 정도는 귓바퀴 두께의 증가를 constant-loading dial micrometer (Mitutoyo, Tokyo)로 측정함으로써 확인하였고, 두께 측정은 DTH 유발 후 6일 동안 매일 동일한 시각에 시행하였다.
- DTH에 의한 염증반응이 완전히 가라앉은 시기에 생쥐를 목뼈탈골로 희생시키고 양쪽 귓바퀴, 간, 허파, 콩팥과 심장을 적출하였다. 이 장기들은 적출된 후 즉시 무게를 측정하고 얼린 후 막자사발에서 갈아 얼렸다 녹이기를 4회 반복하여 세포막을 파괴하였다.
- DTH에 의해 촉발된 염증이 일어나는 장소에서도 비타민 C는 직접적인 작용을 수행할 가능성이 있기 때문에 DTH를 유발하고 다시 정상적인 두께로 돌아온 귓바퀴와, 동일 개체에서 다른 쪽 귓바퀴에서의 비타민 C 농도를 측정하였다.
- DTH의 유발 및 측정: 실험군과 대조군 생쥐의 등 표면에 1×1 cm 면적의 털을 깎아 피부를 노출시키고 DNFB (Sigma) 25 l (0.5% in 4：1 acetone/olive oil)를 발라주어 감작시켰다. 다음 날에도 같은 방법으로 감작시키고 두 번째 감작으로부터 4일 후에 DNFB 20 l (0.
- 감작단계(sensitization phase)를 거친 개체에서 기억 T 세포가 만들어지고, 다시 주어진 항원에 대하여 진피 내 T 세포가 반응하고 IFN- 등의 사이토카인이 분비되면 큰포식세포가 동원되며 이들 큰 포세포에 의해 분비되는 TNF- , IL-1 , IL-6 등의 사이토카인에 의해 염증반응이 증강된다. 과민반응을 유발하는 전형적인 항원들은 매우 작은 합텐으로 본 실험에서는 DNFB를 사용하여 DTH를 유발하였다(25). 피부에 침투된 DNFB는 개체의 자체 단백질과 결합 하여 단백-합텐 복합체를 생성한 후 MHC (주조직적합성복합체)에 결합하여 T 세포에 의해 이종항원으로 인지된다.
- 5% in 4：1 acetone/olive oil)를 발라주어 감작시켰다. 다음 날에도 같은 방법으로 감작시키고 두 번째 감작으로부터 4일 후에 DNFB 20 l (0.2% in 4：1 acetone/olive oil)를 생쥐의 오른쪽 귓바퀴 표면에 발라주어 DTH를 유발하였다(25). DTH 유발 정도는 귓바퀴 두께의 증가를 constant-loading dial micrometer (Mitutoyo, Tokyo)로 측정함으로써 확인하였고, 두께 측정은 DTH 유발 후 6일 동안 매일 동일한 시각에 시행하였다.
- 앞의 실험결과는 다량 투여된 비타민 C에 의한 DTH 반응 경과의 변화가 혈중 비타민 C 농도 증가에 의해서 유도되는 것이 아님을 시사하는 것으로 생각된다. 따라서, 또 다른 기전의 가능성으로 면역반응에 관여하는 세포 내의 비타민 C 축적 여부를 확인하기 위하여 지라세포에서의 비타민 C 농도를 측정하였다.
- 생쥐 7마리에게 3주 동안 매일 비타민 C (L-ascorbic acid, Sigma) 10 mg을 복강에 투여 하였다. 마지막 비타민 C 투여 후 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 24시간에 각 생쥐의 눈확정맥얼기에서 혈액을 채취한 후 혈청을 얻었다. 혈청 내 비타민 C의 농도는 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH)법(26)을 변형하여 측정하였다.
- 생쥐 7마리에게 3주 동안 매일 비타민 C (L-ascorbic acid, Sigma) 10 mg을 복강에 투여 하였다. 마지막 비타민 C 투여 후 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 24시간에 각 생쥐의 눈확정맥얼기에서 혈액을 채취한 후 혈청을 얻었다.
- 앞서 실험처럼 생쥐에게 3주간 지속적으로 매일 2.5 mg, 5 mg, 10 mg의 비타민 C를 복강으로 투여한 후 24시간째에 DNFB로 DTH를 유발시킨 오른쪽 귓바퀴를 두께가 정상수준으로 돌아온 시점에 귓바퀴를 잘라서 무게를 재고 얼려 보관하였다. 이때 DTH를 유발시키지 않은 왼쪽 귓바퀴도 같이 준비하였다.
- 이 장기들은 적출된 후 즉시 무게를 측정하고 얼린 후 막자사발에서 갈아 얼렸다 녹이기를 4회 반복하여 세포막을 파괴하였다. 이 후 원심분리하여 상층액을 얻고 앞서 기술한 방법으로 비타민 C 농도를 재고 각 장기의 무게당 비타민 C의 농도를 구하였다.
- 이때 국소도포하거나 경구 투여한 비타민 C는 ROS를 중화시키는 항산화제(anti-oxidant)로 작용하여 세포매 개면역반응의 감소를 방지한다는 것이다. 이들 실험과 달리 본 실험에서는 정상적인 생쥐에서, 저하된 DTH의 회복이 아닌 정상 DTH 반응에 미치는 다용량 비타민 C의 영향을 확인하였다. 실험 결과, DTH 반응 첫날에는 투여된 비타민 C 양에 비례하여 보다 증가된 양상을 나타내어 대조군이 가장 낮은 증가율을 보였으나 2일부터는 투여된 비타민 C 양에 비례하여 덜 증가된 양상을 보여서 대조군이 가장 높은 증가율을 보였고, 이후 이러한 경향을 유지하였다(Fig.
- 귀 두께와 조직학적인 변화로 살펴본바, 비타민 C 다량 투여로 세포매개성 면역의 변화가 초래되었음을 확인하였다. 이러한 변화가 다량 투여로 인한 혈중 비타민 C 농도 증가에 기인한 것인지를 확인하기 위하여 투여 전과 투여 후의 혈중 비타민 C의 농도를 측정하여 비교하였다. 비타민 C 투여 전 정상 생쥐의 혈청 내 비타민 C 농도는 2.
- 조직절편은 5 m 두께로 만들어 microscope slide에 올린 후 실온에 두었다. 이후 xylene으로 5분 간 2회에 걸쳐 paraffin을 제거하였고, 100%, 95%, 90%, 70%, 50% ethanol에서 재수화(rehydration)시킨 후 Hematoxylin & Eosin 염색을 시행하였다.
- 지라를 분쇄하여 세포 성분을 얻고 RBC lysis buffer를 이용하여 지라세포만을 얻어냈다. 이후 얼렸다 녹이기를 4회 반복하여 세포막을 파괴하고 원심분리하여 얻은 상층액을 10% metaphosphoric acid와 반응시키고 앞서 기술한 방법에 따라서 비타민 C 농도를 재고 세포 5,000개 당 비타민 C의 양을 계산하였다.
- 마지막 비타민 C 투여 후 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 24시간에 각 생쥐의 눈확정맥얼기에서 혈액을 채취한 후 혈청을 얻었다. 혈청 내 비타민 C의 농도는 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH)법(26)을 변형하여 측정하였다.
대상 데이터
- 실험동물로는 7주된 수컷 Balb/c 생쥐를 사용하였다. 모든 생쥐는 12시간 간격으로 밤낮주기(12 h light/12 h dark)가 조절되어 있는 서울대학교 의과대학 실험동물실에서 사육하였으며, 동일한 사료와 물이 충분히 공급되었다.
데이터처리
- 산출된 값은 각 군의 평균값 (means±S.D.)을 사용하였고 정량적으로 측정된 모든 값은 통계분석을 위해 PRISM software one-way ANOVA를 이용하였다.
성능/효과
- 비타민 C 다량 투여와 DTH 반응. 10일 동안 매일 비타민 C를 각각 2.5 mg, 5 mg, 10 mg씩 투여한 실험군과 대조군은 모두 DNFB로 감작한 4일 후, DTH를 유발 시키고 6일 간 귓바퀴 두께를 재어 DTH를 유발시키기 전의 값에 대한 증가%를 그래프로 나타내었다(Fig. 1). 실험군과 대조군 모두 DTH를 유발시킨 후 2일째 귓바퀴의 두께가 가장 두꺼워졌다.
- 3에 나타낸 바와 같다. 3주간 비타민 C를 다량 투여하여도 혈중 비타민 C 농도는 투여 30분 후에 정상치의 4배 가량 증가한 후 지속적으로 감소하여 투여한 시간으로부터 8시간 이후에는 비타민 C를 투여하기 전의 농도와 유사한 수준으로 감소하여(Fig. 3) 장기 투여된 비타민 C가 혈중에 축적되지는 않음을 확인하였다.
- DNFB로 감작하기 전 정상 귓바퀴 조직은 귀의 앞면과 뒷면이 지방세포층을 기준으로 대칭을 이루며 진피 내 샘조직, 근육섬유다발, 혈관 등이 관찰된다. DTH를 유발시킨 후 24시간째 대조군의 귓바퀴에서는 침투된 세포와 림프구들이 진피에서 많이 보이며 혈관 내 중성구도 관찰되지만 비타민 C를 2.5 mg, 10 mg 투여한 실험군에서는 농도에 비례하여 침투된 염증세포와 호중구가 덜 관찰되며 귀 두께가 가장 두꺼운 상태인 DTH 유발 후 48시간째 귓바퀴 조직은 대조군에서 염증세포의 진피 내 침투정도, 혈관 내 중성구, 근육다발의 와해 정도가 가장 심하며 실험군에서는 그 정도가 농도에 비례하게 감소하여서, 귀 두께 측정 결과와 잘 일치하는 소견을 보여주었다.
- 실험군과 대조군 모두 DTH를 유발시킨 후 2일째 귓바퀴의 두께가 가장 두꺼워졌다. DTH를 유발한 후 1일째에는 실험군에서 대조군보다 귓바퀴의 두께가 더 두꺼웠던 반면에 2일째에는 대조군에서는 31.9±3.9%, 비타민 C를 2.5, 5, 10 mg 투여한 군에서 각각 25.0±6.0%, 21.7±3.1%, 16.1±3.83%가 증가하여 대조군에 비해 실험군에서 투여해 준 비타민 C 농도에 비례하여 귓바퀴의 두께가 덜 증가하였으며, 이러한 추세는 이후로도 계속 관찰되었다. DTH 유발 3일부터는 투여군과 대조군 모두에서 귓바퀴의 두께가 지속적으로 감소하였다.
- 귀 두께와 조직학적인 변화로 살펴본바, 비타민 C 다량 투여로 세포매개성 면역의 변화가 초래되었음을 확인하였다. 이러한 변화가 다량 투여로 인한 혈중 비타민 C 농도 증가에 기인한 것인지를 확인하기 위하여 투여 전과 투여 후의 혈중 비타민 C의 농도를 측정하여 비교하였다.
- 5 mg, 5 mg, 10 mg의 비타민 C를 투여한 후 생쥐를 희생시키고 지라를 적출하여 세포 5,000개당 비타민 C의 농도를 측정하였다. 그 결과 비타민 C를 투여하지 않은 대조군의 지라세포에는 세포 5,000개당 약 1.14 mg의 비타민 C가 검출되었으나 매일 비타민 C를 2.5 mg, 5 mg, 10 mg 투여한 실험군의 경우 각각 1.76 mg, 2.97 mg, 4.91 mg의 비타민 C가 검출되어 복강으로 투여한 다량의 비타민 C는 농도에 비례하게 지라세포에 축적됨을 확인하였다 (Fig. 4A). 실험 방법에 대한 검증으로서 같은 생쥐에서 다른 장기-간, 콩팥, 허파에서의 비타민 C 농도를 살펴본 결과 허파에서는 대조군과 실험군에서 모두 높은 농도의 비타민 C가 검출되었고 간과 콩팥에서는 투여한 비타민 C 농도에 비례하여 비타민 C가 검출되었다(Fig.
- 실험동물로는 7주된 수컷 Balb/c 생쥐를 사용하였다. 모든 생쥐는 12시간 간격으로 밤낮주기(12 h light/12 h dark)가 조절되어 있는 서울대학교 의과대학 실험동물실에서 사육하였으며, 동일한 사료와 물이 충분히 공급되었다.
- 반면에 생쥐에서는 자체 생합성이 되기 때문에 생쥐에서의 실험 상황이 사람에서와는 다를 수 있다. 본 실험에서 생쥐에게 주어진 비타민 C 2.5 mg, 5 mg, 10 mg은 생쥐에게 평소에 필요한 양 이외에 추가로 주어진 것이라고 보아야 할 것이다. 이 양을 단위 체중으로 환산하면 100 mg/kg, 200 mg/kg, 400 mg/kg으로 성인 권장비타민 C 섭취량인 10 mg/kg의 최고 40배가 넘는 고 용량이며 체중 60 kg의 성인 기준으로는 각각 6 gm, 12 gm, 24 gm에 해당된다.
- 실험동물과 인체 실험의 결과 추가로 보충된 비타민 C는 T 세포의 증식을 촉진하며, 튜버큘린 반응을 향상 시켜 세포매개면역반응을 증강함이 보고된 바 있다 (7,41). 본 실험에서도 투여된 비타민 C는 지라의 백혈구들에 비례적으로 축적된 결과를 보여서 이들 세포의 기능에 영향을 미쳤을 것으로 생각된다. 실험의 편의상 지라세포를 실험대상으로 하였으나, 말초에 있는 백혈구에도 유사하게 비타민 C가 축적되었을 것으로 생각되며, 이에 따라 DTH에 관여하는 T 세포들이 기능이 향상되었을 것도 가능할 것이다.
- 본 실험의 결과 DTH 유발 첫날에 비타민 C 투여군의 염증 정도는 모두 대조군보다 높았으며 또한 투여군 내에서는 투여된 양에 비례하여 귓바퀴의 두께가 증가하였다. 이는 주어진 비타민 C에 의해서 DTH 초기 반응의 정도가 증강된 것으로 해석할 수 있다.
- 한편 비타민 C는 단순히 ROI를 제거하는 것뿐만이 아니라 다량 주어졌을 경우에 다핵백혈구의 침윤을 저해하고(38) 전사인자인 NF- B의 활성화를 억제하여 TNF, IL-1, IL-6 등 염증 관련 cytokine의 분비를 저해함으로써 염증을 막아주기도 한다(39,40). 본 실험의결과 비타민 C 투여군에서는 첫날을 제외한 전 과정에서 투여된 비타민 C 농도에 비례하여 염증반응의 정도가 낮게 나타난 것은 비타민 C에 의한 소염작용의 결과라고 생각된다. 복강으로 투여된 비타민 C가 혈중에 축적되지는 않았지만 일부 장기에 축적이 되고, 특히 염증이 유발되었던 귓바퀴에 상대적으로 매우 높은 농도가 주어진 양에 비례하여 축적된 결과 (Fig.
- 이들 실험과 달리 본 실험에서는 정상적인 생쥐에서, 저하된 DTH의 회복이 아닌 정상 DTH 반응에 미치는 다용량 비타민 C의 영향을 확인하였다. 실험 결과, DTH 반응 첫날에는 투여된 비타민 C 양에 비례하여 보다 증가된 양상을 나타내어 대조군이 가장 낮은 증가율을 보였으나 2일부터는 투여된 비타민 C 양에 비례하여 덜 증가된 양상을 보여서 대조군이 가장 높은 증가율을 보였고, 이후 이러한 경향을 유지하였다(Fig. 1). 다시 말해서 정상적인 상황에서는 주어진 비타민에 의해서 DTH 자체는 빨리 일어나지만 이로 인한 염증반응은 오히려 감소함을 알 수 있으며 조직학적 소견에서 관찰된 바 조직 내의 염증세포 침윤 등의 양상도 이를 뒷받침하고 있다.
- 4A). 실험 방법에 대한 검증으로서 같은 생쥐에서 다른 장기-간, 콩팥, 허파에서의 비타민 C 농도를 살펴본 결과 허파에서는 대조군과 실험군에서 모두 높은 농도의 비타민 C가 검출되었고 간과 콩팥에서는 투여한 비타민 C 농도에 비례하여 비타민 C가 검출되었다(Fig. 4B).
- 이상의 결과를 볼 때 비타민 C는 정상 생쥐에서 DNFB에 대한 DTH 반응을 초기에는 증가시키지만 뒤따라 수반되는 염증반응은 억제한다. 초기 효과는 비타민 C가 염증세포에 축적되어 이들 세포의 기능을 향상시킨 결과로 생각되며, 후기의 효과는 비타민 C 자체의 여러 기전에 의한 소염작용의 결과로 생각 된다.
- 34 g/ml의 Vitamin C가 검출되었다. 투여된 Vitamin C의 양이 많을수록 DTH가 유발된 오른쪽 귓바퀴에서 검출되는 vitamin C의 양은 vitamin C 투여 양과 비례하게 높아지는 반면 DTH가 유발되지 않은 왼쪽 귓바퀴에서는 투여한 비타민 C 양과 상관없이 일정한 양의 vitamin C가 검출되었다.
후속연구
- 언급한 바와 같이 T 세포가 분비한 cytokine에 의해서 큰포식세포가 모여들고 활성화되어 염증반응을 유도하게 된다. 비타민 C를 포함한 몇몇 항산화제가 큰포식세포의 접착성이나 이동성, superoxide anion의 생산성 등을 높인다는 보고(15)가 있어서 본 실험에서도 사전에 주어진 비타민 C에 의한 큰 포식세포 기능이 향상되었거나 큰포식세포의 동원이 좀 더 빨리 이루어져 DTH 유발 첫날의 염증 반응을 증가시켰을 가능성이 제시될 수 있지만, 이에 관해서는 좀 더 많은 연구가 있어야 할 것으로 생각된다.
- 본 실험에서도 투여된 비타민 C는 지라의 백혈구들에 비례적으로 축적된 결과를 보여서 이들 세포의 기능에 영향을 미쳤을 것으로 생각된다. 실험의 편의상 지라세포를 실험대상으로 하였으나, 말초에 있는 백혈구에도 유사하게 비타민 C가 축적되었을 것으로 생각되며, 이에 따라 DTH에 관여하는 T 세포들이 기능이 향상되었을 것도 가능할 것이다. 그러나 한편으로는 in vitro에서 고농도의 비타민 C에 노출된 T 세포는 활성이 떨어지고 증식 능력도 회복되지 않는다는 보고(23)가 있어서, 본 실험의 결과 첫날에 투여 군에서 나타난 높은 염증 반응이 T 세포에서 기인한 것으로 보기에는 아직 근거가 미약한 것으로 생각된다.
- 초기 효과는 비타민 C가 염증세포에 축적되어 이들 세포의 기능을 향상시킨 결과로 생각되며, 후기의 효과는 비타민 C 자체의 여러 기전에 의한 소염작용의 결과로 생각 된다. 염증세포 중에서 구체적으로 어떤 종류의 세포가 영향을 받는지를 확인하기 위해서는 좀 더 심층적인 연구가 요구된다.
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