국내 분리 흉막폐렴균의 apxIA, IIA, IIIA 유전자 Cloning, 염기서열 분석 및 단백질 발현 Cloning, Sequencing and Expression of apxIA, IIA, IIIA of Actinobacillus pleuropneumoniae Isolated in Korea원문보기
Actinobacillus pleuropneumoniae causes a highly contagious pleuropneumoniae in swine. The bacterium produces several virulence factors such as exotoxin, LPS, capsular polysaccharide, etc. Among them, the exotoxin, called Apx, has been focused as the major virulence factor, and the toxin consists of ...
Actinobacillus pleuropneumoniae causes a highly contagious pleuropneumoniae in swine. The bacterium produces several virulence factors such as exotoxin, LPS, capsular polysaccharide, etc. Among them, the exotoxin, called Apx, has been focused as the major virulence factor, and the toxin consists of 4 gene cluster. apx CABD. apxA is the structural gene of toxin and has four different types, I, II, III, and IV. As the first step of development of a new subunit vaccine, the three different types of apxA gene were amplified from A. pleuropneumoniae isolated from Korea by PCR with primer designed based on the N- and C-terminal of the toxin. The sizes of apxIA, IIA and IIIA were 3,073, 2,971 and 3,159bps, respectively. The comparison of whole DNA sequences of apxIA, IIA and IIIA genes with those of the reference strain demonstrated 98%, 99% and 98% homology, respectively. In addition, the phylogenetic analysis was performed based on the amino acid sequences compared with 12 different RTX toxin family using the neighbor-joining method. ApxA proteins of Korean isolates were identical with reference strains in this study. All ApxA proteins were expressed in E. coli with pQE expression vector and identified using Western blot with polyclonal antibodies against culture supernatants of A. pleuropneumoniae serotype 2 or 5. The sizes of each expressed ApxA protein were about 120, 110, 125 kDa (M.W.), respectively. The results obtained in this study could be used for the future study to develop a new vaccine to porcine pleuropneumoniae.
Actinobacillus pleuropneumoniae causes a highly contagious pleuropneumoniae in swine. The bacterium produces several virulence factors such as exotoxin, LPS, capsular polysaccharide, etc. Among them, the exotoxin, called Apx, has been focused as the major virulence factor, and the toxin consists of 4 gene cluster. apx CABD. apxA is the structural gene of toxin and has four different types, I, II, III, and IV. As the first step of development of a new subunit vaccine, the three different types of apxA gene were amplified from A. pleuropneumoniae isolated from Korea by PCR with primer designed based on the N- and C-terminal of the toxin. The sizes of apxIA, IIA and IIIA were 3,073, 2,971 and 3,159bps, respectively. The comparison of whole DNA sequences of apxIA, IIA and IIIA genes with those of the reference strain demonstrated 98%, 99% and 98% homology, respectively. In addition, the phylogenetic analysis was performed based on the amino acid sequences compared with 12 different RTX toxin family using the neighbor-joining method. ApxA proteins of Korean isolates were identical with reference strains in this study. All ApxA proteins were expressed in E. coli with pQE expression vector and identified using Western blot with polyclonal antibodies against culture supernatants of A. pleuropneumoniae serotype 2 or 5. The sizes of each expressed ApxA protein were about 120, 110, 125 kDa (M.W.), respectively. The results obtained in this study could be used for the future study to develop a new vaccine to porcine pleuropneumoniae.
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제안 방법
ApxA 단백질 발현을 위해 pQE 발현 vector와 E.coli M15 (Qiagen) 또는 BL21 (DE3) pLysS (Invitrogen) 발현시스템을 이용하였다. 먼저 이oning된 각각의 apx A 유전자를 적당한 제한효소로 처리하고 분리된 apxA 유전자를 Gel Extraction kit (Qiagen)를 이용하여 순수 정제한 후, 같은 제 한효소로 처리된 pQE-30 vector에 ligation 시켰다.
유전자에 대한 특이적인 primer를 제작하여 apx ⅠA, ⅡA, ⅢA 유전자를 각각 cloning하였다. Cloning된 apxA 유전자의 부분 염기서열분석을 통하여 다음 염기서열 분석을 위한 특이적인 primer를 제작하였으며 이를 이용하여 전체 유전자의 염기분석을 실시하였다. 전체 염기서열을 표준균주의 apxA 유전자와 비교하여 유전자 수준에서의 유사성뿐만 아니라 neighbor- joining 방법을 이용하여 아미 노산 염 기서 열에 바탕을 둔 phylogenetic 분석도 실시하였다 [II].
TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen) 이용하여 apxⅠA, apxⅡA, ap:ⅢA 유전자가 삽입된 plasmid vectoi를 E. coli Top 10에 transformation 한 후 50 ㎍/m1의 ampicillin 과 50 mg/ml 의 X-gal 을 이용하여 transformation의 유무를 확인하였으며 그 후, &oRI 제한효소를 이용하여 insert DNA의 유무를 확인하였다. 즉, ttaisformation 에서 추출한 apxl, n 및 fflA 유전자 2㎕에 &oRI 제한효소 1 /, (Invitoren), 10X H buffer 2 ㎕를 가하고 total volume이 20 ㎕가 되도록 멸균 증류수를 첨가하였다.
apxA 유전자 Cloning을 위한 PCKe 각각의 apxA 유전자에 대한의 표준주의 Genbmk에서 유전정보를 이용하여 apxⅠ, Ⅱ, ⅢA에 대한 pHmei를 작성하였으며 각각의 primer 앞에 EcoRI enzyme site를 붙여서 PCR을 통해각각의 유전자를 증폭하였다. PCR 에 쓰인 각각의 primer에 대후}" 염기서열은 Table 1과 같다.
먼저 이oning된 각각의 apx A 유전자를 적당한 제한효소로 처리하고 분리된 apxA 유전자를 Gel Extraction kit (Qiagen)를 이용하여 순수 정제한 후, 같은 제 한효소로 처리된 pQE-30 vector에 ligation 시켰다. apxA-pQE vector를 heat shock의 방법으로 E co/i에 형 질전환 시켰으며 IPTG (Sigma Co.) 1 mM을 첨가하여 3에서 6시간 동안 induction 시킨 후 4 pleuro- pneumoniae serotype 2와 5의 배양 상층액을 이용하여토끼에서 생성한 polyclonal antibody를 이용하여 Western blot으로 ApxA 단백질의 발현 유무를 확인하였다 [12, 21],
coli M15 (Qiagen) 또는 BL21 (DE3) pLysS (Invitrogen) 발현시스템을 이용하였다. 먼저 이oning된 각각의 apx A 유전자를 적당한 제한효소로 처리하고 분리된 apxA 유전자를 Gel Extraction kit (Qiagen)를 이용하여 순수 정제한 후, 같은 제 한효소로 처리된 pQE-30 vector에 ligation 시켰다. apxA-pQE vector를 heat shock의 방법으로 E co/i에 형 질전환 시켰으며 IPTG (Sigma Co.
본 실험에서 cloning된 각각의 ApxA와 다른 RTX toxin 그룹에 속하는 독소와의 상관관계를 분석하기 위하여 GenBank에 등록된 RTX 독소 중 표준주를 포함하여 12가지의 대표적인 RTX A독소를 선택한 후, 본 실험에서 염기서열 분석을 실시한 각각의 ApxAe neighborjoining 방법을 통하여 phylogenetic 분석을 실시하였다 [11].
본 실험에서는 국내 야외에서 분리된 혈청형 2형과 5 형의 A. pleitropneitmoniae를 가지고 apxⅠA, Ⅱ, ⅢA toxin에 특이적인 primer를 제작하여 multiplex PCR을 통해 apxIA, HA, IHA를 확인하였으며 PCR 산물의 분석을 바탕으로 apxIA, HA, ⅢA를 clorning을 한 후, 염기서열을 분석하였다. 그 결과 apIA, HA, IDA의 크기는 각각 3, 073, 2, 971, 3, 159 bps를 나타내었으며 reference strain 의유전자와 비교하여 볼 때 각각는 98%, apxdA는 99%, apxⅢA는 98%의 일치율을 보였다.
이러한 노력의 첫 번째 단계로서 국내에서 유행하는 흉막폐렴균 혈청형 2 형과 5형에서 Apx 독소를 확인하고 GenBank의 표준 균주를 바탕으로 각각의 apxA. 유전자에 대한 특이적인 primer를 제작하여 apx ⅠA, ⅡA, ⅢA 유전자를 각각 cloning하였다. Cloning된 apxA 유전자의 부분 염기서열분석을 통하여 다음 염기서열 분석을 위한 특이적인 primer를 제작하였으며 이를 이용하여 전체 유전자의 염기분석을 실시하였다.
Cloning된 apxA 유전자의 부분 염기서열분석을 통하여 다음 염기서열 분석을 위한 특이적인 primer를 제작하였으며 이를 이용하여 전체 유전자의 염기분석을 실시하였다. 전체 염기서열을 표준균주의 apxA 유전자와 비교하여 유전자 수준에서의 유사성뿐만 아니라 neighbor- joining 방법을 이용하여 아미 노산 염 기서 열에 바탕을 둔 phylogenetic 분석도 실시하였다 [II]. 또한 대장균 발현 시스템을 이용하여 각각의 ApxA 단백 질을 발현시 켰고, 이들에 대한 특이 적 인 항체를 이용하여 이를 Western blot을 통하여 확인하였다.
coli Top 10에 transformation 한 후 50 ㎍/m1의 ampicillin 과 50 mg/ml 의 X-gal 을 이용하여 transformation의 유무를 확인하였으며 그 후, &oRI 제한효소를 이용하여 insert DNA의 유무를 확인하였다. 즉, ttaisformation 에서 추출한 apxl, n 및 fflA 유전자 2㎕에 &oRI 제한효소 1 /, (Invitoren), 10X H buffer 2 ㎕를 가하고 total volume이 20 ㎕가 되도록 멸균 증류수를 첨가하였다. 37 ℃ 에서 한 시간 incubation을 한 다음 1.
final polymerization 하였다. 증폭된 DNA는 1.0% agarose gel에 전기영동을 실시한 후 UV illuminator로 확인한 후, QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen)을 이용하여 apx Ⅰ, Ⅱ, ⅢA genes를 순수 분리하여 각각 cloning에 사용하였다.
처음 cloning 한 TOPO vector 와 insert DNA plasmid를정제하여 각각의 primer# 이용하여 sequencing 한 결과를 바탕으로 다음 primer# 제작하여 forward, backward 쪽으로 전체 유전자의 염기서열 분석을 실시하였다. 각각의 부분 염기서열에 쓰인 primer는 Table 2와 같다.
대상 데이터
본 연구에서 사용한 균주는 서울대학교 수의과 대학 전염병학 교실에서 병성감정 의뢰된 가검물의 폐에서 분리한 혈청형 2형과 5형의 Actinobacillus pleuropneumoniae 야외 균주를 실험에 공시하였다.
데이터처리
각각의 부분 염기서열에 쓰인 primer는 Table 2와 같다. 염기서열 분석은 Automatic sequencer ABI PRISM 377XL을이용하였으며 유전자 분석을 통하여 확립된 apxⅠA apxⅡA 그리고 apxⅢA를 GenBank에 등록한 후, 기존의 표준 주와 비교 분석하였다.
이론/모형
Phylogenetic analysis based on amino acid alignments of 15 different RTX A toxins. This tree was constructed by using the neighbor joining method. The distance between two strains is the sum of the branch lengths between them.
전체 염기서열을 표준균주의 apxA 유전자와 비교하여 유전자 수준에서의 유사성뿐만 아니라 neighbor- joining 방법을 이용하여 아미 노산 염 기서 열에 바탕을 둔 phylogenetic 분석도 실시하였다 [II]. 또한 대장균 발현 시스템을 이용하여 각각의 ApxA 단백 질을 발현시 켰고, 이들에 대한 특이 적 인 항체를 이용하여 이를 Western blot을 통하여 확인하였다.
성능/효과
ApxⅠ과 Ⅱ를 분비 하는 혈 청형 5형 과 ApxII와 ApxⅢ를분비하는 혈청형 2형의 배양상층액을 이용하여 생산한 polyclonal antibody를 이용, Western blot을 실시한 결과 Fig. 2에서 보는 바와 같이 IPTG로 단백질 발현을 유도시킨 lane 3부터 6은 약 120 kDa (M.W.)에서 백터를 보유하지 않은 lane 1과 IPTG를 첨가하지 않은 lane2와는 구별되게 발현된 120 kDa (MW.)의 ApxIA 단백질을 확인할 수 있었다.
MEGA 2 프로그램을 이용하여 아미노산 서열 일치 정도를 분석한 후, 이를 바탕으로 거리 관계의 연관성을 규명하기 위한 phylogenetic 분석에서는 국내 분리 흉막폐 렴균의 각각의 ApxA와 표준주의 ApxA와 동일하였으며 다른 RTX독소와도 상당히 밀접한 것으로 나타났다. 특히, ApxIIA는 Actinobacillus s* 의 cytolysin인 Ash A와도 밀접한 관계가 있음이 나타났다 (Fig.
871, 3, 159bps로 나타났다. Pubmed의 Nucleotide Blast program을 이용하여 GenBank에 등록된 표준주 (apⅠA: D16582, apxHA: M30602, apⅢA: X8OO55)의 유전자와비교분석한 결과, apxⅠA는 98%, 야기HIA는 99%, apx HIA 는 98%의 일치율을 보였다.
국내 분리 흉막 폐렴균의 apxA 유전자의 전체 염기서열을 분석한 후 GenBank에 등록하여 砂IA는 AF363361, apⅡIA는 AF363362, apⅢA✻ AE363363의 accession number 를 부여받았으며 ap ⅡA, mA의 크기는 각각 3, 069, 2, 871, 3, 159bps로 나타났다. Pubmed의 Nucleotide Blast program을 이용하여 GenBank에 등록된 표준주 (apⅠA: D16582, apxHA: M30602, apⅢA: X8OO55)의 유전자와비교분석한 결과, apxⅠA는 98%, 야기HIA는 99%, apx HIA 는 98%의 일치율을 보였다.
이러한 유전적 염기서열의 유사성을 바탕으로 국내 분리 균주의 ApxA 재조합 단백질을 생산한 결과 그 크기 또한 자연 감염시 생성되는 독소와 비슷하였다. 국내에서 가장 유행하는 혈청형 2형과 5형의 배양상층액을 토끼에 접종하여 얻은 혈청을 이용하여 Western Blot한 결과 Apx ⅢA가 125kDa (MW.)으로 그 크기가 가장 컸으나 시간에 따른 발현 양상에는 별 차이가 없는 것으로 나타났다. ApxIIA의 경우 그 크기는 110 kDa (MW.
pleitropneitmoniae를 가지고 apxⅠA, Ⅱ, ⅢA toxin에 특이적인 primer를 제작하여 multiplex PCR을 통해 apxIA, HA, IHA를 확인하였으며 PCR 산물의 분석을 바탕으로 apxIA, HA, ⅢA를 clorning을 한 후, 염기서열을 분석하였다. 그 결과 apIA, HA, IDA의 크기는 각각 3, 073, 2, 971, 3, 159 bps를 나타내었으며 reference strain 의유전자와 비교하여 볼 때 각각는 98%, apxdA는 99%, apxⅢA는 98%의 일치율을 보였다. 이는 GenBank 에 등록된 표준주와 유전적으로 거의 동일한 유사성을 나타내며 아미노산 염기서열 분석에서는 동일한 단백질을 생성한다고 생각되어 진다.
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