연구배경 : Proteasome 억제가 세포의 apoptosis에 미치는 영향은 세포 종류에 따라 차이를 보이고 있다. 그러나 아직까지 폐암 세포에서 proteasome 억제가 미치는 효과 및 그 기전에 관해서는 확실하게 규명되어 있지 못한 상태이다. 본 연구에서는 폐암 세포주에서 proteasome 억제에 의한 apoptosis의 유도 유무를 관찰하고, 그 기전을 규명하고자 하였다. 방 법 : 폐암 세포주인 A549와 NCI-H157 세포에 proteasome 억제제인 MG132와 PS-341을 투여하고 세포의 생존율을 MTT 분석으로 평가하였고, apoptosis 유무를 PARP 단백에 대한 Western 분석으로 확인하였다. Proteasome 억제가 caspase 3와 JNK의 활성화에 미치는 효과를 각각 Western 분석과 immunocomplex kinase 분석으로 평가하였다. Proteasome 억제제를 투여하고 항 apoptosis 경로인 ERK와 cIAP1에 미치는 효과를 Western 분석으로 평가하였다. 결 과 : A549와 NCI-H157 세포에 MG132를 투여하였을 때, 세포생존율의 감소가 관찰되었고, 이는 apoptosis의 유도에 의한 것으로 확인되었다. MG132와 PS-341 처치로 caspase 3와 JNK가 활성화되었다. 반면에 활성화된 ERK의 발현과 cIAP1의 발현은 감소하였다. 결 론 : 폐암 세포에서 proteasome 억제에 의한 apoptosis에는 caspase 3, JNK와 같은 apoptosis 유도 경로의 활성화와 함께 항 apoptosis 경로의 억제가 관여할 것으로 생각된다.
연구배경 : Proteasome 억제가 세포의 apoptosis에 미치는 영향은 세포 종류에 따라 차이를 보이고 있다. 그러나 아직까지 폐암 세포에서 proteasome 억제가 미치는 효과 및 그 기전에 관해서는 확실하게 규명되어 있지 못한 상태이다. 본 연구에서는 폐암 세포주에서 proteasome 억제에 의한 apoptosis의 유도 유무를 관찰하고, 그 기전을 규명하고자 하였다. 방 법 : 폐암 세포주인 A549와 NCI-H157 세포에 proteasome 억제제인 MG132와 PS-341을 투여하고 세포의 생존율을 MTT 분석으로 평가하였고, apoptosis 유무를 PARP 단백에 대한 Western 분석으로 확인하였다. Proteasome 억제가 caspase 3와 JNK의 활성화에 미치는 효과를 각각 Western 분석과 immunocomplex kinase 분석으로 평가하였다. Proteasome 억제제를 투여하고 항 apoptosis 경로인 ERK와 cIAP1에 미치는 효과를 Western 분석으로 평가하였다. 결 과 : A549와 NCI-H157 세포에 MG132를 투여하였을 때, 세포생존율의 감소가 관찰되었고, 이는 apoptosis의 유도에 의한 것으로 확인되었다. MG132와 PS-341 처치로 caspase 3와 JNK가 활성화되었다. 반면에 활성화된 ERK의 발현과 cIAP1의 발현은 감소하였다. 결 론 : 폐암 세포에서 proteasome 억제에 의한 apoptosis에는 caspase 3, JNK와 같은 apoptosis 유도 경로의 활성화와 함께 항 apoptosis 경로의 억제가 관여할 것으로 생각된다.
Background : Proteasome inhibitors can promote either cell survival or programmed cell death, depending on both the specific type and proliferative status of the cell. However, it is not well known whether inhibition of proteasome activity is related to apoptosis in lung cancer cells. In addition, t...
Background : Proteasome inhibitors can promote either cell survival or programmed cell death, depending on both the specific type and proliferative status of the cell. However, it is not well known whether inhibition of proteasome activity is related to apoptosis in lung cancer cells. In addition, the exact mechanisms responsible for apoptosis induced by proteasome inhibition are not well understood. In the present study, we have examined the effect of proteasome inhibition on lung cancer cells and tried to test the mechanisms that may be associated with the apoptosis of these cells. Methods : We examined the effect of proteasome inhibition with MG132 or PS-341 on cell survival in A549 and NCI-H157 lung cancer cells using MTT assay, and analyzed the cleavage of PARP by Western blot analysis to find evidence of apoptosis. Next, we evaluated the activation of caspase 3 by Western blot analysis and the activity of JNK by immunocomplex kinase assay. We also examined the changes in anti-apoptotic pathways like ERK and cIAP1 by Western blot analysis after inhibition of proteasome function. Results : We demonstrated that MG132 reduced cell survival by inducing apoptosis in A549 and NCI-H157 cells. Proteasome inhibition with MG132 or PS-341 was associated with activation of caspase 3 and JNK, reduced expression of activated ERK, and downregulation of cIAP1. Conclusion : Apoptosis induced by proteasome inhibition may be associated with the activation of pro-apoptotic pathways like caspase 3 and JNK and the inactivation of anti-apoptotic pathways in lung cancer cells.
Background : Proteasome inhibitors can promote either cell survival or programmed cell death, depending on both the specific type and proliferative status of the cell. However, it is not well known whether inhibition of proteasome activity is related to apoptosis in lung cancer cells. In addition, the exact mechanisms responsible for apoptosis induced by proteasome inhibition are not well understood. In the present study, we have examined the effect of proteasome inhibition on lung cancer cells and tried to test the mechanisms that may be associated with the apoptosis of these cells. Methods : We examined the effect of proteasome inhibition with MG132 or PS-341 on cell survival in A549 and NCI-H157 lung cancer cells using MTT assay, and analyzed the cleavage of PARP by Western blot analysis to find evidence of apoptosis. Next, we evaluated the activation of caspase 3 by Western blot analysis and the activity of JNK by immunocomplex kinase assay. We also examined the changes in anti-apoptotic pathways like ERK and cIAP1 by Western blot analysis after inhibition of proteasome function. Results : We demonstrated that MG132 reduced cell survival by inducing apoptosis in A549 and NCI-H157 cells. Proteasome inhibition with MG132 or PS-341 was associated with activation of caspase 3 and JNK, reduced expression of activated ERK, and downregulation of cIAP1. Conclusion : Apoptosis induced by proteasome inhibition may be associated with the activation of pro-apoptotic pathways like caspase 3 and JNK and the inactivation of anti-apoptotic pathways in lung cancer cells.
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문제 정의
그러나아직까지 폐암 세포에서 proteasome 억제가 미치는 효과 및 그 기전에 관해서는 확실하게 규명되어 있지 못한 상태이다. 본 연구에서는 폐암 세포주에서 proteasome 억제에 의한 apoptosis의 유도 유무를 관찰하고, 그 기전을 규명하고자 하였다.
본 연구에서는 폐암 세포주에서도 proteasome 억제에 의해 apoptosis가 유발되는지를 확인하였고, apoptosis 유도 경로와의 관린성을 평가하였으며, proteasome 억제가 항 apoptosis 경로에 미치는 효과를 규명하였다.
6). 이상의 결과는 폐암 세포에서 proteasome 억제에 의한 apoptosis의 유도에 항 apoptosis 경로의 억제가 관여할 가능성을 시사하는 소견이다.
제안 방법
WC는 강한 oxidant나 자외선 조사 등의 stress가 가해졌을 때 활성화되는데, 활성화된 JNK。】】 의해 apoptosis를 유발하는 신호 전달 체계가 작동된다는 사실이 잘 알려져 있다. 20-22 일부 세포주에서 proteasome 억제제에 의한 JNK의 활성화가 보고되어 있다H 폐암 세포에서도 proteasome 억제제에 의해 JNK의 활성화가 일어나는지를 평가하기 위하여 세포에 prote -asome 억제제를 처치하고 JNK의 활성화 유무를 immunocomplex kinase assay로 즉정하였1主 NCI-H157 세포에 20 11M의 MG132투여하고 4시간이 경과한 후부터 JNK 활성도가 증가하였고 24시간까지 지속되었다(Fig. 4A). A549 세포에서도 MG132를 투여하고 8시간 후부터 JNK 활성도가 증가하여 24시간까지 지속되었다(Fig.
30 曲의 세포 단백을 10% SDS-polyacrylamide gel에서 전기영동 시켰다. 4시간 동안 400 mA의 일정한 전류로 단백질들을 nitrocellulose membrane으로 transfer시키고, °] membrane을 blocking solution(5% skim milk in IXPBS/Tween 20)으로 1 시간동안 block 시킨 후 rabbit polyclonal anti-PARP 항체, anti-procaspase 3 항체, anti-JNKl 항체, anti-ERK 힝-체, anti-phospho-ERK 항체, 혹은 anti-cIAPl 항체를 1 : 1,000으로 첨가하여 12시간 동안 반응시켰다. 세척 후 이차 항체를 1 : 2,000으로 첨가하여 반응시킨 후 면역신호의 검출은 ECL Western blotting detection system을 이용하였다.
조사하였다. A549와 NCI-H157 세포에 50 贝\4의 MG132 투여하고 24시간이 경과한 후 PARP의 분해 시에 관찰되는 86 kD 분절이 관찰되어 48시간까지 지속되었다(Fig. 2A). 여러 농도의 MG132를 세포에 투여하고 24시간 후에 PARP의 분절을 관찰하였는데, NCI-H157 세포는 A549 세포에 비해 훨씬 낮은 농도인 1 uM의 MG132 투여시 PARP의 분절이 관찰되어, 세포의 생존율에 미치는 결과와 같은 양상이 관찰되었다(Fig.
MG132의 투여에 의해 관찰되는 세포 생존율의 감소가 apoptosis에 의한 것인지를 확인하기 위하여, A549와 NCI-H157 세포주에 MG132를 투여하고 apoptosis시 특징적으로 관찰되는 poly(ADP-ribose) polymerase(PARP)의 분해 유무를 시간 경과와 농도 증가에 따라 Western blot으로 조사하였다. A549와 NCI-H157 세포에 50 贝\4의 MG132 투여하고 24시간이 경과한 후 PARP의 분해 시에 관찰되는 86 kD 분절이 관찰되어 48시간까지 지속되었다(Fig.
5A). NCI-H157 세포에 20 UM의 MG132를 투여하고 시간 경과에 따라 전체 ERK와 활성화된 형태인 인산화 ERK를 Western blot 분석으로 관찰하였는데, 8시간 후부터 활성화된 인산화 ERK가 현저히 감소하여 24시간 후에는 완전히 소실되었다(Fig. 5A). MG132에 의한 활성화 ERK의 발현 감소는 1 UM 의 낮은 농도에서부터 관찰되었다(Fig.
확인하였다. Proteasome 억제가 caspase 3와 JNK의 활성화에 미치는 효과를 각각 Western 분석과 immunocomplex kinase 분석으로 평가하였다. Proteasome 억제제를 투여하고 항 apoptosis 경로인 ERK와 cIAPl에 미치는 효과를 Western 분석으로 평가하였다.
Proteasome 억제에 의한 폐암 세포의 apoptosis와 세포 생존 signal과의 관련성을 평가하고자, proteasome 억제가 extracellular signal-regulated pro- tein kinases(ERK)으] 활성화와 c-inhibitor of apoptosis 1 (cIAPL)의 발현에 미치는 효과를 평가하였다. ERK는 생존 신호인 성장 인자의 자극에 의해 활성화되는 효소로서 apoptosis를 억제하며, 실험적으로 ERK를 억제하면 apoptosis가 유발되는 것이 알려져 있다20 NCI-H157 세포의 기저 상태에서 ERK가 활성화되어 있었다(Fig.
Proteasome 억제가 caspase 3와 JNK의 활성화에 미치는 효과를 각각 Western 분석과 immunocomplex kinase 분석으로 평가하였다. Proteasome 억제제를 투여하고 항 apoptosis 경로인 ERK와 cIAPl에 미치는 효과를 Western 분석으로 평가하였다.
Proteasome 억제제인 MG132가 폐암 세포의 생존에 미치는 영향을 평가하기 위하여, A549와 NCI-H157 세포주에 MG132를 투여하고 시간 경과 및 농도에 따른 세포의 생존율을 측정하였다. 50 UM 의 MG132 투여 후 시간이 지남에 따라 세포의 생존율이 점차적으로 감소하였고, 24시간 후에는 기저상태에 비해 통계적으로 유의한 차이를 보여 A549 세포의 생존율은 기저 상태의 65%, NCI-H157 세포의 생존율은 기저상태의 25%로 감소하였다(Fig.
Proteasome 억제제는 전체 ERK의 발현에는 영향을 미치지 않았다. 다음 단계로 caspase와 결합하여 caspase의 작용을 억제함으로써 항 apoptosis 작용을 보이는23, 24 cIAPl에 미치는 proteasome 억제의 효과를 평가하였다. NCI-H157 세포와 A549 세포에 24시간동안 PS-341 을 농도별로 투여한 후 cIAPl의 발현을 관찰하였는데, 50 nM 이상의 농도에 cIAPl 발현이 감소되었다(Fig.
1A). 다음 단계로 여러 농도의 MG132를 투여하고 24시간 후에 세포의 생존율을 측정하였다. A549 세포는 5 UM의 MG132 투여로 세포의 생존율이 통계적으로 유의하게 감소하였고, 농도가 증가해도 더 이상의 생존율 감소는 관찰되지 않았다(Fig.
SDS protein sample buffer를 가하여 반응을 종료시킨 후 10% SDS-PAGE 를 시행하고 nitrocellulose membrane 에 transfer하여 autoradiography# 시행하였다. 또한, 동량의 JPK가 immunoprecipitation 되었는지를 확인하기 위하여 같은 membrane을 이용하여 anti-JNK1 항체로 immunoblot을 시행하였다.
배양된 세포에 MG132 혹은 PS-341 을 투여하고 일정 시간동안 배양한 후 whole lysis buffer(0.1% Nonidet P-40, 5 mM EDTA, 50 mM Tris(pH 7.5 —8.0), 250 mM NaCl, 50 mM NaF)를 이용하여 총 세포 단백을 추출하였다. 30 曲의 세포 단백을 10% SDS-polyacrylamide gel에서 전기영동 시켰다.
폐암 세포주인 A549와 NCI-H157 세포에 proteasome 억제제인 MG132와 PS-341 을 투여하고 세포의 생존율을 MTT 분석으로 평가하였고, apoptosis 유무를 PARP 단백에 대한 Western 분석으로 확인하였다. Proteasome 억제가 caspase 3와 JNK의 활성화에 미치는 효과를 각각 Western 분석과 immunocomplex kinase 분석으로 평가하였다.
활성화된 caspase에 의한 단백 분해는 apoptosis에서 관찰되는 특징적인 소견으로서, DNA의 분절 화와 함께 세포 사멸 과정을 비가역적인 과정이 되게 한다I' 폐암 세포에서 proteasome 억제제에 의해 유발되는 apoptosis에서 caspase 3의 관련성을 평가하기 위하여 MG132와 PS-341 을 투여한 후 pro-caspase 3의 활성을 Western blot 분석으로 조사하였다. 32 kD의 pro-caspase 3는 12 kD 분절로 분해되어 활성화됨이 알려져 있다.
대상 데이터
Proteasome inhibitors decreases pro-ca-spase 3. A549 and NCI-H157 cells were treated with 50 " M of MG132 for the indicated times(A). NCI-H157 cells were incubated with PS-341 (50 nM) for the/ithindicated times(B), and were treated v 240, 2, 10, 50, 100 nM of PS-341 for h(C).
(Beverly, MA, USA) 에서 구입하였다. Horseradish peroxidase(HRP) 가 conjugation된 goat anti-rabbit 이차 항체는 Promega (Madison, WI, USA)에서, protein-G sepharose beads 오]" ECL kit는 Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden)에서, protease 억제제는 Roche (Mannlieim, Germany)에서, [y-"p]ATP는 ICN Pharmaceuticals, Inc, (Costa Mesa, CA, USA)에서 각각 구입하였다.
96-well plate에 well당 2><103개의 세포를 분주하고 1일 후 proteasome 억제제를 투여하여 정해진 시간 동안 배양하였다. 배양된 세포에 MTT 용액을 0.
Proteasome 억제제인 MG132(Z-Leu-Leu-Leu-H) 는 Peptide Institute, Inc. (Osaka, Japan) 에서 구입하였다. Rabbit polyclonal anti-PARP(poly(ADP-ribose) polymerase) 항체, anti-pro-caspase 3 항체, anti-JNKl 항체, anti-cIAPl 항체, 그리고 recombinant GST-c-june Santa Cruz Biote -chnology, Inc.
(Santa Cruz, CA, USA) 에서 구입하였다. Rabbit polyclonal anti-ERK(ERKl/ERK2) 항체, anti-phospho-ERK 항체는 Cell Signaling Teclmology, Inc. (Beverly, MA, USA) 에서 구입하였다. Horseradish peroxidase(HRP) 가 conjugation된 goat anti-rabbit 이차 항체는 Promega (Madison, WI, USA)에서, protein-G sepharose beads 오]" ECL kit는 Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden)에서, protease 억제제는 Roche (Mannlieim, Germany)에서, [y-"p]ATP는 ICN Pharmaceuticals, Inc, (Costa Mesa, CA, USA)에서 각각 구입하였다.
(Osaka, Japan) 에서 구입하였다. Rabbit polyclonal anti-PARP(poly(ADP-ribose) polymerase) 항체, anti-pro-caspase 3 항체, anti-JNKl 항체, anti-cIAPl 항체, 그리고 recombinant GST-c-june Santa Cruz Biote -chnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA) 에서 구입하였다. Rabbit polyclonal anti-ERK(ERKl/ERK2) 항체, anti-phospho-ERK 항체는 Cell Signaling Teclmology, Inc.
본 연구에서는 두 종류의 폐암 세포주에 대하여 각각 실험을 진행하였다. 그 결과를 살펴보면 proteasome 억제에 대한 반응은 폐암 세포의 종류에 따라 예민도에 차이가 있음을 알 수 있다.
베양액을 제거한 후 50 μ1 의 DMSO를 첨가하여 녹이고 분광광도계를 이용하여 590 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 4개 well의 성적을 분석하였다.
시간 혹은 농도별 세포 생존율의 차이는 SPSS for Windows Release 11.0 프로그램의 Mann-Whitey U-test를 이용하여 분석하였다.
이론/모형
Cells were incubated with 0, 1, 5, 10, 20, 50 μM of MG132 for 24 hrs. Cell viability was assayed by MTT assay. Open bar repre -sents for A549 cells, and black bar for NCI-H157 cells.
JNK 활성도를 immunocomplex kinase assay로 평가하였다. JNK는 c-JSJ의 N-terminal에 위치하는 serine 63, 73을 phosphorylation 시켜 c-JRJN의 transactivation potential과 DNA-binding affinity 를 증가시키는 kinase이므로, JNK의 활성도는 c-JUN의 phosphorylation을 평가하면 알 수 있다.
4시간 동안 400 mA의 일정한 전류로 단백질들을 nitrocellulose membrane으로 transfer시키고, °] membrane을 blocking solution(5% skim milk in IXPBS/Tween 20)으로 1 시간동안 block 시킨 후 rabbit polyclonal anti-PARP 항체, anti-procaspase 3 항체, anti-JNKl 항체, anti-ERK 힝-체, anti-phospho-ERK 항체, 혹은 anti-cIAPl 항체를 1 : 1,000으로 첨가하여 12시간 동안 반응시켰다. 세척 후 이차 항체를 1 : 2,000으로 첨가하여 반응시킨 후 면역신호의 검출은 ECL Western blotting detection system을 이용하였다.
세포 생존율은 3-(4, 5-dimethyl tliiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide assay를 이용하여 측정하였다. 96-well plate에 well당 2><103개의 세포를 분주하고 1일 후 proteasome 억제제를 투여하여 정해진 시간 동안 배양하였다.
성능/효과
농도에 따른 세포의 생존율을 측정하였다. 50 UM 의 MG132 투여 후 시간이 지남에 따라 세포의 생존율이 점차적으로 감소하였고, 24시간 후에는 기저상태에 비해 통계적으로 유의한 차이를 보여 A549 세포의 생존율은 기저 상태의 65%, NCI-H157 세포의 생존율은 기저상태의 25%로 감소하였다(Fig. 1A). 다음 단계로 여러 농도의 MG132를 투여하고 24시간 후에 세포의 생존율을 측정하였다.
A549와 NCI-H157 세포에 MG132를 투여하였을 때, 세포생존율의 감소가 관찰되었고, 이는 apoptosis의 유도에 의한 것으로 확인되었다. MG132 와 PS-341 처치로 caspase 3와 JW가 활성화되었다.
32 kD의 pro-caspase 3는 12 kD 분절로 분해되어 활성화됨이 알려져 있다. MG132 50 UM을 투여하고 24시간 후에 A549와 NCI-H157 세포 모두에서 pro-caspase 3의 발현이 감소되었고, 이는 48시간 후까지 지속되었다. 6-actin을 controle 하여 pro-caspase 3 band의 density를 비율로 표시해 보면 AS의 경우 0, 4, 8, 24, 48 시간째에 각각 1.
그 결과를 살펴보면 proteasome 억제에 대한 반응은 폐암 세포의 종류에 따라 예민도에 차이가 있음을 알 수 있다. NCI-H157 세포는 A549 세포에 비해 훨씬 낮은 농도의 proteasome 억제제에 의해 세포 생존율의 감소가 유발되었으며, 같은 농도의 proteasome 억제제를 투여했을 때 세포 생존율의 감소가 더욱 크게 관찰되었다. 이러한 양상은 apoptosis를 평가한 결과에서도 마찬가지로 관찰되었다.
4B). NCI-H157 세포에서 PS-341 처치로 시간과 농도 의존성으로 JNK 활성도가 증가하였다(Fig. 4C, D). 이상의 결과로 폐암 세포에서 proteasome 억제로 JW의 활성화가 유도됨을 확인할 수 있었다.
다음 단계로 caspase와 결합하여 caspase의 작용을 억제함으로써 항 apoptosis 작용을 보이는23, 24 cIAPl에 미치는 proteasome 억제의 효과를 평가하였다. NCI-H157 세포와 A549 세포에 24시간동안 PS-341 을 농도별로 투여한 후 cIAPl의 발현을 관찰하였는데, 50 nM 이상의 농도에 cIAPl 발현이 감소되었다(Fig. 6). 이상의 결과는 폐암 세포에서 proteasome 억제에 의한 apoptosis의 유도에 항 apoptosis 경로의 억제가 관여할 가능성을 시사하는 소견이다.
실험을 진행하였다. 그 결과를 살펴보면 proteasome 억제에 대한 반응은 폐암 세포의 종류에 따라 예민도에 차이가 있음을 알 수 있다. NCI-H157 세포는 A549 세포에 비해 훨씬 낮은 농도의 proteasome 억제제에 의해 세포 생존율의 감소가 유발되었으며, 같은 농도의 proteasome 억제제를 투여했을 때 세포 생존율의 감소가 더욱 크게 관찰되었다.
또한, proteasome 억제제 투여에 의해 caspase 3, JNK의 활성화가 유발됨을 관찰하였고, 다른 한편으로는 활성화된 ERK의 발현이 감소되고 cIAPl0] down regulation 되는 것을 발견할 수 있었다. 이로부터 유추해 볼 수 있는 가설은 proteasome 억제제가 caspase 3, JW와 같은 apoptosis 유도 경로를 활성화시키고, ERK, cIAPl 과 같은 항 apoptosis 경로를 억제함으로써 apoptosis 를 유발할 수 있을 것이라는 가능성이지만 아직 결론을 내릴 수는 없다.
IB). 반면에 NCI-H157 세포는 1 11M의 MG132 투여로 생존율이 통계적으로 유의하게 감소하였고, 농도를 증가시킴에 따라 농도 의존성으로 세포의 생존율이 감소하였다(Fig. IB). 이상 의결과는 폐암세포는 proteasome 억제제로 세포의 생존율이 감소하는데, 세포에 따라 예민도의 차이를 보여 NCI-H157 세포가 A549 세포보다 민감함을 시사하는 소견이다.
본 연구에서는 다른 여러 세포들과 마찬가지로 폐암 세포에서도 proteasome 억제제인 MG132나 PS-341 을 투여하였을 때 apoptosis가 유발됨을 확인하였다. 또한, proteasome 억제제 투여에 의해 caspase 3, JNK의 활성화가 유발됨을 관찰하였고, 다른 한편으로는 활성화된 ERK의 발현이 감소되고 cIAPl0] down regulation 되는 것을 발견할 수 있었다.
2A). 여러 농도의 MG132를 세포에 투여하고 24시간 후에 PARP의 분절을 관찰하였는데, NCI-H157 세포는 A549 세포에 비해 훨씬 낮은 농도인 1 uM의 MG132 투여시 PARP의 분절이 관찰되어, 세포의 생존율에 미치는 결과와 같은 양상이 관찰되었다(Fig. 2B). 이 결과는 proteasome 억제제에 의한 폐암 세포 생존율의 감소는 apoptosis에 의한 것임을 시사하는 소견이다.
IB). 이상 의결과는 폐암세포는 proteasome 억제제로 세포의 생존율이 감소하는데, 세포에 따라 예민도의 차이를 보여 NCI-H157 세포가 A549 세포보다 민감함을 시사하는 소견이다.
4C, D). 이상의 결과로 폐암 세포에서 proteasome 억제로 JW의 활성화가 유도됨을 확인할 수 있었다.
후속연구
이에 반해 새로 개발된 dipeptidyl boronic acid인 PS-341 등은 prote -asome에 대해 매우 강력하면서도 특이적인 억제작용을 나타내는 것으로 밝혀져 있다29. 본 연구와 같은 여러 생체 외 실험에서 이들 proteasome 억제제들은 암세포에 대하여 apoptosis를 유발함이 관찰되었고 1°*, 생체 내 실험에서도 현저한 항종양 효과를 나타내었다案"罚 또한 혈관 신생과 암세포의 전이를 억제하였으며32, 33, 암세포의 apoptosis에 대한 감수성도 증가시킴이 확인되었다 12-15 더욱 주목할 만한 것은, proteasome 억제제가 활발히 증식을 하거나 형질변환된 세포에 대하여 선택적인 세포 독성을 보이는 것으로 관찰되에% 기존의 항암제에 대해 내성을 보이는 암세포에 대한 새로운 항암제로서 관심이 모아지고 있는 실정이며 추후 현재 진행 중인 몇몇 임상 연구 결과들이 발표될 예정이다34.
Proteasome 억제와 apoptosis와의 관련성에 대한 연구는 폐암 세포의 발병에 있어서 중심이 되는 apoptosis의 이상과 그 기전에 대한 새로운 지식을 제공해 줄 수 있으며, 향후 이를 이용한 새로운 치료법의 개발에 많은 도움이 될 것으로 기대된다.
향후 이러한 가설을 뒷받침하기 위해서는 caspase 3나 JNK의 활성화를 억제한 후 proteasome 억제제에 의해 유발되는 apoptosis도 역시 억제되는지를 조사해 보아야 할 것이다. 또한, ERK와 cIAPl을 overexpression 시킨 후 apoptosis 양상에 변화가 나타나는지에 대한 연구도 필요할 것으로 생각된다.
이로부터 유추해 볼 수 있는 가설은 proteasome 억제제가 caspase 3, JW와 같은 apoptosis 유도 경로를 활성화시키고, ERK, cIAPl 과 같은 항 apoptosis 경로를 억제함으로써 apoptosis 를 유발할 수 있을 것이라는 가능성이지만 아직 결론을 내릴 수는 없다. 향후 이러한 가설을 뒷받침하기 위해서는 caspase 3나 JNK의 활성화를 억제한 후 proteasome 억제제에 의해 유발되는 apoptosis도 역시 억제되는지를 조사해 보아야 할 것이다. 또한, ERK와 cIAPl을 overexpression 시킨 후 apoptosis 양상에 변화가 나타나는지에 대한 연구도 필요할 것으로 생각된다.
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