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문제 정의
- 근골격계 종 양들이 발현하는 사이토카인이나 케모카인에 대한 연구는 일부 종양의 세포주를 이용하여 시행되고 있는 정도로 다른 종양을 대상으로 한 사이토카인의 연구에 비해 상당히 미흡한 실정이다22 , 24 , 26). 이에 저자들은 근골격계 종양의 종류에 따른 다양 한 종류의 사이토카인 및 케모카인 발현을 탐색하여 전반적인 CC 및 CXC 케모카인의 발현양상을 보고, 골육종의 경우 원발성 골육종과 재발된 골육종, 항 암화학요법 전과 후의 케모카인의 발현도 차이가 있는지를 조사하여 케모카인의 발현도 변화에 대한 기 초 정보를 얻고자 한다.
- 특히 사이토카인 계의 경 우, TNF-α는 가장 활발하게 연구된 대표적 호염증성 사이토카인 중 하나로 종양 조직 괴사 인자로 알려져 있고, IFN-γ는 면역 반응시 Th1 및 자연살 세포에서 분비되어 세포성 면역 반응을 증폭시키고, 대식세포의 활성화를 초래하는 대표적 면역 매개물질이며, IFN-β의 경우 다른 사이토카인 들과는 달리, 자극을 받지 않는 정상 휴식기의 세포에서 세포 내 유전자 발현이 항상 유지되는 대표적 사이토카인으로3, 8) 알려져 있어, 이들 각각의 유전자 발현 양상 또한 궁금하였다. 본 연구를 실시하기에 앞서 정상인의 조직에서의 1 0종의 케모카인 및 사이토카인의 유전자 발현 양상을 관찰해 보았다. 정상인의 경우 IL-8과 IFN-β의 유전자 발현을 제외한 다른 모든 유전자들은 관찰되지 않아 연부조직 종양 및 골종양에서의 유전자 발현 양상과는 확연히 달랐다.
- 연부조직 종양과 골종양에서의 케모카인 및 사이토카인 유전자 발현 분석을 시도한 본 연구는 비록 연 구 대상의 종양 조직 표본의 수가 적어 통계적 분석을 통한 정확한 자료의 제시는 불가능하였으나 연부 조직 종양과 골종양에 있어 일부 케모카인 및 사이토카인의 발현 차이를 확인하고 골육종의 경우 IFN-γ및 TGF-βisoform의 발현 분석이 치료 및 예후 지표에 응용될 가능성이 있음을 관찰하였다. 따라서 본 연구는 아직까지 정립되지 못한 연부 조직 종양과 골 종양에서의 케모카인 및 사이토카인 상호관계 정립에 있어 유용한 기초 자료가 될 것으 로 생각하는 바이다.
제안 방법
- 5 ml 멸균 튜브에 옮겨 trizol B와 잘 섞은 후 100 μl의 클로로포름을 넣고 15 분간 얼음에 정치시켰다. 그 후 4℃에서 12,000 rpm으로 15 분간 원심 분리하여 윗층을 조심스럽게 취한 뒤 동량의 isopropanol을 첨가하여 - 20℃에서 10 분간 정치시킨 후 원심 분리하여 얻어진 침전물은 에탄올로 세척한 후에 공기 중에서 말린 뒤 0.1% DEPC가 첨가된 증류수에 녹여서 이중 2 μl를 취하여 DEPC에 500 배 희석하여 흡광기를 이용하여 농도를 정한 후 RT-PCR 및 RPA의 시료로 사용하였다.
- 여기에 각각 20 μM 의 sense primer 와 antisense primer를 1 μl 첨가하여 PCR을 실시하였다. 처음의 thermal cycling 단계는 MIP-1α와 MIP-1β의 경우 94℃에서 45 초 동안의 불활성화 단계, 62℃에서 1 분 동안 결합 반응 단계와 72℃에서 1 분 동안의 핵산 중합 단계로 구성하여 35회의 thermal cycling을 실시하였고 β- actin , IL-8, MCP-1, IFN-β, RANTES, GRO-α의 경우 95℃에서 15 초 동안의 불활성화 단계, 60℃에서 30 초 동안 결합 반응 단계와 72℃에서 1 분 동안의 핵산 중합 단계로 구성하여 35회의 thermalcycling을 실시하였고, TNF-α와 IFN-γ의 경우 94 ℃에서 1 분 동안의 불활성화 단계, 55℃에서 1 분 동안 결합 반응 단계와 72℃에서 1 분 30 초 동안의 핵산 중합 단계로 구성하여 40회의 thermalcycling을 실시하였고, IP-10의 경우 94℃에서 45 초 동안의 불활성화 단계, 59℃에서 1 분 동안 결합 반응 단계와 72℃에서 1 분 동안의 핵산 중합 단계로 구성하여 31회의 thermal cycling을 실시한 뒤 별도로 72℃에서 10 분 동안 더 핵산 중합 반응을 실시하여 부분적으로 신장된 산물을 완전한 가닥으로 완성시켜 주는 단계로 하였다. 증폭된 상보 DNA는 8% polyacrymaide gel상에서 1배 농도의 TAE buffer로 150 volt에서 50분간 전기 영동시켰다.
- 증폭된 상보 DNA는 8% polyacrymaide gel상에서 1배 농도의 TAE buffer로 150 volt에서 50분간 전기 영동시켰다. EtBr(0.5 μg /μl )에 20분 염색 후 나타나는 띠(band)를 관찰하였다. DNA marker로는 100 bp DNA ladder를 사용하였다.
- 말린 침전 시료는 5 μl 1X loading buffer로 녹인 뒤 전기 영동의 시료로 사용하였다. 8% acryamide / 8 M urea로 구성된 전기영동 겔의 각 well에 1000-2000 cpm 활성도의 probe size marker와 각각의 시료를 넣 은 뒤 250 V에서 약 2시간 30분동안 전기 영동을 실시하였다. 그 후 겔을 조심스럽게 필터종이에 부착시킨 뒤 1시간 동안 진공 건조시키고 완전히 말린 후 이를 -70℃ 에서 X-ray 필름에 적정시간 노출시켜 결과를 관찰하였다.
- 8% acryamide / 8 M urea로 구성된 전기영동 겔의 각 well에 1000-2000 cpm 활성도의 probe size marker와 각각의 시료를 넣 은 뒤 250 V에서 약 2시간 30분동안 전기 영동을 실시하였다. 그 후 겔을 조심스럽게 필터종이에 부착시킨 뒤 1시간 동안 진공 건조시키고 완전히 말린 후 이를 -70℃ 에서 X-ray 필름에 적정시간 노출시켜 결과를 관찰하였다.
- 연부조직 종양 7예와 골종양 5예의 조직으로부터 total RNA를 분리 후 RT - PCR을 시행하여 CC 케모카인에 속하는 MCP-1, RANTES, CXC 케모카인의 IL-8, IP-10, GRO-α 및 사이토카인 TNF-α 와 IFN-γ의 총 7 종류의 유전자 발현 양상을 관찰하였다. 케모카인 IL- 8과 사이토카인 TNF -α의 경 우 종양의 종류와 관계없이 모든 대상의 조직에서 그 유전자 발현이 관찰되었고 IFN-γ의 경우 양성 연부조직 종양군과 양성 골종양군에서는 모든 예에서 발현되었고, 악성 연부조직 종양군과 악성 골종 양군에서는 각각 4예 중 3예 (75%)에서 발현하였다.
- Lymphotactin(LTN), RANTES, IP-10, MIP-1α, MIP-1β, MCP-1, IL-8, 및 I-309의 8종 케모카인과 TNF-α, TNF-β, LTβ, IFN-β, IFNγ, TGFβ1, TGFβ2, 및 TGFβ3의 8종 사이토카인 유전자 발현을 각각 동시에 관찰할 수 있는 RPA법을 이용하여 일부 연부조직 종양 및 골종양의 케모 카인 및 사이토카인 발현 양상을 관찰하였다. 케모카인 발현양상을 보면 MIP- 1α, MIP-1β의 경우 유전자 발현도가 거대세포종(giant cell tumor)을 제외하고 상당히 미약하나 발현되는 것을 관찰할 수 있었다.
- 원발성 골육종 조직과 치료 후 재발된 조직에서의 케모카인 및 사이토카인의 유전자 발현양상을 비교하였다. 원발성 골육종에 비해 재발된 골육종 조직에서의 케모카인 및 사이토카인의 발현은 IFN-γ를 제외하고, 전반적으로 그 발현도가 훨씬 강하였으며 또한 실험된 모든 종류의 케모카인 및 사이토카인들이 발현되었다.
- 4. 항암화학요법 후 골육종의 케모카인 및 사이토카인 유전자 발현 골육종의 경우 동일환자를 대상으로 항암화학요법 전 과 후의 종양 조직을 취하여 케모카인 및 사이토카인의 발현을 RT-PCR법과 RPA법으로 분석 비교하였다. 항암화학요법 전에 취한 종양의 조직 경우 MCP-1, RANTES, IL-8 IP-10, TNF-α, IFNγ및 IFN -β의 유전자 발현이 관찰된 반면 치료 후의 같은 부위에서 취한 조직의 경우 RANT E S와 IFN-β를 제외한 나머지 케모카인 및 사이토카인의 발현되지 않았다(Fig.
- 특히 본 연구와 같이 다양한 종류의 양성 및 악성 근골격계 종양환자의 종양 조직을 직접 실험대상으로 하고, 관찰하고자 하는 대 상의 케모카인 및 사이토카인을 다수 선정하여 동시 관찰한 예는 찾을 수 없었고, 관련 연구들은21, 22, 24, 26) 대부분이 세포주를 이용한 in vitro 실험이었다. 본 실험에서 분석된 케모카인 및 사이토카인은 총 10종으로 케모카인 7종, 사이토카인 3종이였고, 7종의 케모카인 중 CC 케모카인으로 MIP-1α, MIP-1β, MCP-1 및 RANTES를, CXC 케모카인은 IL-8 , IP-10 및 GRO-α, 그외 사이토카인은 TNF-α, IFN-γ및 IFN-β의 유전자 발현을 분석하였다. 본 실험에 이용된 케모카인 및 사이토카인들은 그 생리적 작용이나 체내 염증, 면역반응 및 방어 기전에 대부분 그 기능이 밝혀지고 정립된 상태의 종류들이며, 다른 종양 연구에서도 다양하게 분석된 것들이나 골종양을 이용한 이들에 대한 자료는 여전히 불충분하기에 기존의 종양 조직들과 좋은 비교의 대상이 될 수 있어 선택하였다.
- 종양조직으로부터 total RNA의 분리를 위해 Trizol (Gibco/BRL, Life Technologies, Gaithersburg, MD)을 사용하였다. RNase protection assay(RPA)는 RiboQuant multi-probe ribonuclease protection assay system(Pharmingen, San Diego)과 동일한 회사의 lymphotactin(Ltn), RANTES, IP-10, MIP-1β, MIP-α, MCP-1, IL-8, 및 -309의 8종 template DNA로 구성된 hck-5 probe 및 TNF-β, LTβ, TNF-α, IFN-γ, IFN-β, TGFβ1, TGFβ2 및 T G Fβ3의 8종 사이토카인 template DNA로 구성된 hck-3 set를 사용하여 실시하였다. 케모카인 유전자 발현을 관찰하기 위한 reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)은 RNA PCR kit(N808-0017 Perkin Elmer USA)를 사용하였고 RT-PCR에 사용된 케모카인 primer들은 바이오 니아사(충북 청원군)로부터 주문, 구입하였다.
대상 데이터
- 2000년 2월부터 2001년 7월까지 본원에서 종양조 직을 얻을 수 있었던 원발성 양성 및 악성 근골격계 종양 10예, 재발된 골육종 1예, 항암화학요법 후의 골육종 1예 및 정상조직의 대조군 1예를 대상으로 하였다(Table 1).
- 종양조직으로부터 total RNA의 분리를 위해 Trizol (Gibco/BRL, Life Technologies, Gaithersburg, MD)을 사용하였다. RNase protection assay(RPA)는 RiboQuant multi-probe ribonuclease protection assay system(Pharmingen, San Diego)과 동일한 회사의 lymphotactin(Ltn), RANTES, IP-10, MIP-1β, MIP-α, MCP-1, IL-8, 및 -309의 8종 template DNA로 구성된 hck-5 probe 및 TNF-β, LTβ, TNF-α, IFN-γ, IFN-β, TGFβ1, TGFβ2 및 T G Fβ3의 8종 사이토카인 template DNA로 구성된 hck-3 set를 사용하여 실시하였다.
- RNase protection assay(RPA)는 RiboQuant multi-probe ribonuclease protection assay system(Pharmingen, San Diego)과 동일한 회사의 lymphotactin(Ltn), RANTES, IP-10, MIP-1β, MIP-α, MCP-1, IL-8, 및 -309의 8종 template DNA로 구성된 hck-5 probe 및 TNF-β, LTβ, TNF-α, IFN-γ, IFN-β, TGFβ1, TGFβ2 및 T G Fβ3의 8종 사이토카인 template DNA로 구성된 hck-3 set를 사용하여 실시하였다. 케모카인 유전자 발현을 관찰하기 위한 reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)은 RNA PCR kit(N808-0017 Perkin Elmer USA)를 사용하였고 RT-PCR에 사용된 케모카인 primer들은 바이오 니아사(충북 청원군)로부터 주문, 구입하였다. 사용된 10종류의 사이토카인 및 케모카인 primer sequences는 (Table 2)와 같다.
- 5 μg /μl )에 20분 염색 후 나타나는 띠(band)를 관찰하였다. DNA marker로는 100 bp DNA ladder를 사용하였다.
데이터처리
- 양성 연부조직종양군, 양성 골종양군, 악성 연부 조직종양군 및 악성 골종양군간의 각각 케모카인의 발현도 차이가 있는지, 양성 종양군과 악성 종양군 간의 차이가 있는지 그리고 연부조직 종양군과 골종 양군과의 차이가 있는지를 알기위하여 SPSS를 사용 한 Fisher’s exact test를 이용하여 통계적 처리를 하였다.
이론/모형
- 위에 제시한 8종 케모카인과 8종의 사이토카인 mRNA 발현을 분석하기 위하여 RPA 시약을 구입 한 회사에서 제시한 RiboQuant 실험 방법에 따라 실행하였다. 먼저 probe 합성을 위하여 [α32P] UTP 10 ul, GACU pool 1 μl, DTT 2 μl, 5X transcription buffer 4 μl, RPA template set(hck-5) 1 μl, RNasin 1 μl, T7 polymerase 1 μl를 혼합하여 37℃, 1 시간 정치후 2 μl DNase를 첨가하여 반응을 정지시킨 뒤 20 mM EDTA 26 μl, Tris-saturated phenol 25 μl, chloroform:isoamylalchol (50:1) 25 μl, Yeast tRNA 2 μl chloroform:isoamyl alcohol (50:1)와 반응시켜 원심분리하여 다시 위층을 취하고 50ul 4M ammonium acetate, 250 μl ice cold 100% 에탄 올을 가하여 - 70℃에서 30분간 방치한 뒤 다시 원심 분리 후 그 침전물을 100 μl의 냉각된 90% 에탄올 로 한번 씻은 후 공기 중에 말렸다.
성능/효과
- 연부조직 종양 7예와 골종양 5예의 조직으로부터 total RNA를 분리 후 RT - PCR을 시행하여 CC 케모카인에 속하는 MCP-1, RANTES, CXC 케모카인의 IL-8, IP-10, GRO-α 및 사이토카인 TNF-α 와 IFN-γ의 총 7 종류의 유전자 발현 양상을 관찰하였다. 케모카인 IL- 8과 사이토카인 TNF -α의 경 우 종양의 종류와 관계없이 모든 대상의 조직에서 그 유전자 발현이 관찰되었고 IFN-γ의 경우 양성 연부조직 종양군과 양성 골종양군에서는 모든 예에서 발현되었고, 악성 연부조직 종양군과 악성 골종 양군에서는 각각 4예 중 3예 (75%)에서 발현하였다. RANTES의 경우 연부조직의 종양 7예 중 5예, 골종양 5예 중 4예에서 유전자가 발현되고 GRO-α 의 경우 연부조직 종양 2예 중 1예, 골종양 5예 중 2예에서 유전자 발현이 관찰되어 종양의 종류에 따른 이들 유전자들의 발현은 유의성이 없었다.
- IP-10의 경우 발현도의 차이는 있지만, 모든 연부조직 종양에서 유전자 발현이 가능하였으나 골종양의 악성종 양의 경우 MCP-1의 발현이 음성이었던 동일한 조직에서 역시 IP - 10의 유전자 발현을 관찰할 수 없었다. IFN-γ의 경우 연부조직의 악성종양 1예(유잉육 종)에서 비록 유전자 발현이 관찰되지 않았고 다른 1예 (지방육종)의 경우 미약한 발현도를 보였으나 전반적으로 연부 조직 종양의 발현도에 비해 골종양 의 IFN-γ발현도는 상당히 약하게 나타났다.
- 케모카인 발현양상을 보면 MIP- 1α, MIP-1β의 경우 유전자 발현도가 거대세포종(giant cell tumor)을 제외하고 상당히 미약하나 발현되는 것을 관찰할 수 있었다. 신경초종(schwannoma)과 활액막육종(synovial sarcoma)의 경우 케모카인의 발현은 유사한 양상을 띄었으며 MCP-1의 발현이 다른 케모카인에 비해 강하게 나타났다. 간엽성 연골육종와 말초신경 악성종양(Malignant peripheral nerve sheath tumor) 또한 유사한 발현 양상을 보였으며 이들은 다른 케모카인에 비해 IL-8을 상대적으로 강하게 발현하였다.
- 신경초종(schwannoma)과 활액막육종(synovial sarcoma)의 경우 케모카인의 발현은 유사한 양상을 띄었으며 MCP-1의 발현이 다른 케모카인에 비해 강하게 나타났다. 간엽성 연골육종와 말초신경 악성종양(Malignant peripheral nerve sheath tumor) 또한 유사한 발현 양상을 보였으며 이들은 다른 케모카인에 비해 IL-8을 상대적으로 강하게 발현하였다. 거대세포종의 경우 MCP-1이 가장 강하게 발현되면서 다른 종양들에 비해 다른 케모카인들도 뚜렷하게 발현되었다(Fig.
- 2). 사이토 카인의 유전자 발현 양상을 분석해보면 간엽성 연골 육종과 말초신경 악성종양의 경우를 제외하고는 TGFβisoform 중, TGFβ1, TGFβ2의 강한 발현을 관찰할 수 있었다(Fig. 3).
- 원발성 골육종 조직과 치료 후 재발된 조직에서의 케모카인 및 사이토카인의 유전자 발현양상을 비교하였다. 원발성 골육종에 비해 재발된 골육종 조직에서의 케모카인 및 사이토카인의 발현은 IFN-γ를 제외하고, 전반적으로 그 발현도가 훨씬 강하였으며 또한 실험된 모든 종류의 케모카인 및 사이토카인들이 발현되었다. 원발성 골육종의 경우 IFN-β를 제외하고 전반적인 발현도는 극히 약하였고, GRO-α 와 RANTES는 아예 관찰되지 않았다.
- 원발성 골육종의 경우 IFN-β를 제외하고 전반적인 발현도는 극히 약하였고, GRO-α 와 RANTES는 아예 관찰되지 않았다. 그러나 IFN-γ유전자의 경우 다른 유전자들과는 달리 원발성 골육종에 비해 재발된 골육종 조직에서 더 약하게 관찰되었다(Fig. 4). TGFβisoform의 발현 양 상으로 원발성 골육종 조직은 TGFβ1, TGFβ2, 및 TGFβ3의 3종 isoform 중 TGFβ1, TGFβ2가 뚜렷하게 발현되었으나, 재발된 골육종 조직의 경우 TGFβ1만이 관찰되고, 발현도 또한 원발성 골육종 조직에 비해 상당히 떨어졌다(Fig.
- 4). TGFβisoform의 발현 양 상으로 원발성 골육종 조직은 TGFβ1, TGFβ2, 및 TGFβ3의 3종 isoform 중 TGFβ1, TGFβ2가 뚜렷하게 발현되었으나, 재발된 골육종 조직의 경우 TGFβ1만이 관찰되고, 발현도 또한 원발성 골육종 조직에 비해 상당히 떨어졌다(Fig. 5). 4.
- 6). RPA를 통한 TGFβisoform의 발현 변화도 관찰하였는데, 치료 전의 조직은 TGFβ3를 제외한 TGFβ1, 및 TGFβ2의 유전자 발현 에 확인된 반면 치료후의 조직에서는 TGFβ1유전자의 발현만 관찰되었다(Fig. 7).
- 본 연구를 실시하기에 앞서 정상인의 조직에서의 1 0종의 케모카인 및 사이토카인의 유전자 발현 양상을 관찰해 보았다. 정상인의 경우 IL-8과 IFN-β의 유전자 발현을 제외한 다른 모든 유전자들은 관찰되지 않아 연부조직 종양 및 골종양에서의 유전자 발현 양상과는 확연히 달랐다. 연부 조직 종양 및 골종양의 경우 종양의 종류에 따라 다소 발현도의 차이는 있었으나 MCP-1, IP-10 및 IFN-γ를 제외하고는 유전자 발현 유무에 있어 큰 차이를 나타내지 못했다.
- 그에 반해 IP-10은 CXC 케모카인에 속하면서 호중구의 교통을 조절하기 보다는 단핵구의 교통 조절에 일익을 담당하고 이들의 생산에는 IFN-γ의 조절을 받고 있는 것으로 알려진 대표적 케모카인으로15-17) 종양 형성 과정 시 신생 혈관을 억제시킨다는 다수의 연구 보고에 따라 종양 발생에 있어 억제 효과를 가지는 케 모카인군 중 하나로 알려진 대표적 케모카인이다. 본 연구의 연부조직의 종양의 경우 이들 두 케모카인의 발현이 모두 발현된 반면, 악성 골종양의 경우 일부는 발현을 관찰할 수 없었고, 골육종에서도 결과의 차이를 보였으나, 대상 종양의 수가 너무 적어 어떠한 통계적 의의를 찾을 수는 없었다. 위에 언급 되었듯이 IFN-γ에 의해 유도되는 IP-10의 성향에 따라 IFN-γ의 발현도에 따른 IP-10 유전자 발현도의 관계를 분석해 보았지만 큰 의미를 찾을 수 없어, 이는 근골격계 종양시 체내의 IP-10의 발현을 유도 하는 것은 IFN-γ이외의 다른 인자들에 의해 좌우되는 것이 아닌가 추측되었다.
- RPA를 이용한 8종 케모카인 유전자 발현 양상을 보면 MIP-1α와 MIP-1β의 발현 역시 관찰되었다. 대상 조직의 수가 너무 적어 이들 종양과 케모카인 발현양상 간의 관계 분석은 불가능 하지만 본 실험의 RPA 연구 결과 악성 골 종양인 간엽성 연골육종과 악성 연부조직 종양인 말초신경 악성종양, 그리고 양성 연부조직 종양인 신경초종과 악성 연부 조직 종양인 활액막 육종의 경우 8종 케모카인의 발현 양상이 각각 동일하게 나타나, 많은 조직을 대상으로 한 이들 종양간의 케모 카인 발현 분석 연구는 의의가 있을 것으로 추측되었다. 8종 사이토카인의 발현을 관찰한 RPA의 경 우 TNF-α나 IFN-γ, IFN-β의 발현 외에서 TNF-β, LTβ의 발현도 관찰되었으며 특히 종양의 종류에 관계없이 이들에 비해 TGFβi soform들이 위에 언 급된 사이토카인들보다 강하게 발현됨으로써 대상 조직의 수를 많이 확보하여 TGFβisoform의 발현 양상의 분석을 시도하면 관련 골종양과 TGFβ의 관계 정립에 유용한 자료가 될 수 있을 것으로 생각되었다.
- 대상 조직의 수가 너무 적어 이들 종양과 케모카인 발현양상 간의 관계 분석은 불가능 하지만 본 실험의 RPA 연구 결과 악성 골 종양인 간엽성 연골육종과 악성 연부조직 종양인 말초신경 악성종양, 그리고 양성 연부조직 종양인 신경초종과 악성 연부 조직 종양인 활액막 육종의 경우 8종 케모카인의 발현 양상이 각각 동일하게 나타나, 많은 조직을 대상으로 한 이들 종양간의 케모 카인 발현 분석 연구는 의의가 있을 것으로 추측되었다. 8종 사이토카인의 발현을 관찰한 RPA의 경 우 TNF-α나 IFN-γ, IFN-β의 발현 외에서 TNF-β, LTβ의 발현도 관찰되었으며 특히 종양의 종류에 관계없이 이들에 비해 TGFβi soform들이 위에 언 급된 사이토카인들보다 강하게 발현됨으로써 대상 조직의 수를 많이 확보하여 TGFβisoform의 발현 양상의 분석을 시도하면 관련 골종양과 TGFβ의 관계 정립에 유용한 자료가 될 수 있을 것으로 생각되었다. 비록 동일인은 아니나 골육종의 경우 재발된 상태와 원발성 골육종 조직에서의 케모카인 및 사이토카인 유전자 발현을 비교 분석한 결과, 원발성 조직에 비해 재발된 조직에서, IFN-γ를 제외한 모든 유전자에서의 강한 발현이 관찰됨에 따라 재발 시 체내 케모카인 및 사이토카인의 상호관계가 상당히 달라진다는 것을 추측할 수 있었으며 IFN-γ의 경우 세포성 면역 반응의 증폭과 대식세포의 활성화와 같이 면역 반응의 활성화를 담당하는 사이토카인으로 써의 중요성과 비록 연구의 방향을 다르나, nudemouse에 골육종을 이식한 뒤 IFN-γ와 IFN-β의 항 종양 효과를 관찰한Gomi등9) 의 연구 결과를 참고로 할 때, 골육종 치료 후 재발하는 경우 임상적 증 이 원발성일 때 보다 심하고 병리조직학적으로도 세포조직의 악성도가 더 높아지며 예후가 나빠지는 현상과의 관련을 추측할 수 있으며 골육종 치료에 있어 IFN-γ역할이 기대되었다.
- 따라서 동일한 유형의 많은 조직을 확보하여, 골육종의 재발에 있어 IFN-γ의 관련성을 분석하는 작업은, 골육종과 사이 토카인 상호관계 중 IFN-γ역할 정립에 유용한 자료가 될 것으로 생각된다. 또한 동일인을 대상으로 한 항암화학요법 전, 후의 케모카인 및 사이토카인의 발현 변화를 분석시, 치료 전에 비해 치료 후 RANTES 및 IFN-β를 제외한 모든 케모카인 및 사이토카인 유전자 발현이 음성으로 나타났다. 이 환자의 경우 항암화학요법 후 광범위 종양 적출수술을 하였고, 종양 세포의 괴사 정도를 보기 위해 시행하는 조직학적 구축(mapping)에서 90 %이상의 괴사 를 보였었다.
- 종양과 TGFβ발현과 관계된 연구보고는 다수12, 19, 20, 25) 있으나 TGFβisoform 발현의 체계적 분석을 행한 연구는 매우 미흡한 가운데 대장암을 이용한Bellone등4) 의 연구 보고에 따르면 암환자의 경우 정상인에 비해 TGFβ1, TGFβ2의 생성은 TGFβ3에 비해 두드러진다고 보고하였다. 본 연구의 골육종 경우 비록 한 환자의 조직의 결과이 기는 하나 TGFβ1 및 TGFβ2의 발현만을 관찰할 수 있었으며 치료 후나 재발된 조직의 경우 TGFβ1 유전자 발현만 관찰되어 골육종 경우 TGFβisoform 발현 분석은 IFN-γ와 함께 치료 또는 예후의 판정 에 응용 가능한 지표로써의 가능성을 시사하였다. 연부조직 종양과 골종양에서의 케모카인 및 사이토카인 유전자 발현 분석을 시도한 본 연구는 비록 연 구 대상의 종양 조직 표본의 수가 적어 통계적 분석을 통한 정확한 자료의 제시는 불가능하였으나 연부 조직 종양과 골종양에 있어 일부 케모카인 및 사이토카인의 발현 차이를 확인하고 골육종의 경우 IFN-γ및 TGF-βisoform의 발현 분석이 치료 및 예후 지표에 응용될 가능성이 있음을 관찰하였다.
- 본 연구의 골육종 경우 비록 한 환자의 조직의 결과이 기는 하나 TGFβ1 및 TGFβ2의 발현만을 관찰할 수 있었으며 치료 후나 재발된 조직의 경우 TGFβ1 유전자 발현만 관찰되어 골육종 경우 TGFβisoform 발현 분석은 IFN-γ와 함께 치료 또는 예후의 판정 에 응용 가능한 지표로써의 가능성을 시사하였다. 연부조직 종양과 골종양에서의 케모카인 및 사이토카인 유전자 발현 분석을 시도한 본 연구는 비록 연 구 대상의 종양 조직 표본의 수가 적어 통계적 분석을 통한 정확한 자료의 제시는 불가능하였으나 연부 조직 종양과 골종양에 있어 일부 케모카인 및 사이토카인의 발현 차이를 확인하고 골육종의 경우 IFN-γ및 TGF-βisoform의 발현 분석이 치료 및 예후 지표에 응용될 가능성이 있음을 관찰하였다. 따라서 본 연구는 아직까지 정립되지 못한 연부 조직 종양과 골 종양에서의 케모카인 및 사이토카인 상호관계 정립에 있어 유용한 기초 자료가 될 것으 로 생각하는 바이다.
- 그러나 MCP-1과 IP-10의 경우 양성 연부조직 종양군, 양성 골종양군 및 악성 연부조직 종양군에서는 모두 발현되었으나, 악성 골종양군에서는 2예(50%)만이 발현되었다(Table 3). 이들의 결과를 통하여 연부조 직 종양과 골종양에서 유전자 발현의 차이를 보이는 MCP-1, IP-10 및 IFN-γ의 발현도를 비교한 결과, Fig. 1.에서 관찰되듯이 MCP-1의 경우 골종양 중 일부 악성종양을 제외한 다른 대상 조직에서는 뚜렷 한 발현도가 관찰되지만 간엽성 연골육종( m e senchymal chondrosarcoma)과 골육종 각 1 예에 서는 MCP-1의 발현은 관찰되지 않았다. IP-10의 경우 발현도의 차이는 있지만, 모든 연부조직 종양에서 유전자 발현이 가능하였으나 골종양의 악성종 양의 경우 MCP-1의 발현이 음성이었던 동일한 조직에서 역시 IP - 10의 유전자 발현을 관찰할 수 없었다.
- Lymphotactin(LTN), RANTES, IP-10, MIP-1α, MIP-1β, MCP-1, IL-8, 및 I-309의 8종 케모카인과 TNF-α, TNF-β, LTβ, IFN-β, IFNγ, TGFβ1, TGFβ2, 및 TGFβ3의 8종 사이토카인 유전자 발현을 각각 동시에 관찰할 수 있는 RPA법을 이용하여 일부 연부조직 종양 및 골종양의 케모 카인 및 사이토카인 발현 양상을 관찰하였다. 케모카인 발현양상을 보면 MIP- 1α, MIP-1β의 경우 유전자 발현도가 거대세포종(giant cell tumor)을 제외하고 상당히 미약하나 발현되는 것을 관찰할 수 있었다. 신경초종(schwannoma)과 활액막육종(synovial sarcoma)의 경우 케모카인의 발현은 유사한 양상을 띄었으며 MCP-1의 발현이 다른 케모카인에 비해 강하게 나타났다.
- 원발성 골육종에 비해 재발된 골육종 조직에서의 케모카인 및 사이토카인의 발현은 IFN-γ를 제외하고, 전반적으로 그 발현도가 훨씬 강하였으며 또한 실험된 모든 종류의 케모카인 및 사이토카인들이 발현되었다. 원발성 골육종의 경우 IFN-β를 제외하고 전반적인 발현도는 극히 약하였고, GRO-α 와 RANTES는 아예 관찰되지 않았다. 그러나 IFN-γ유전자의 경우 다른 유전자들과는 달리 원발성 골육종에 비해 재발된 골육종 조직에서 더 약하게 관찰되었다(Fig.
- 8종 사이토카인의 발현을 관찰한 RPA의 경 우 TNF-α나 IFN-γ, IFN-β의 발현 외에서 TNF-β, LTβ의 발현도 관찰되었으며 특히 종양의 종류에 관계없이 이들에 비해 TGFβi soform들이 위에 언 급된 사이토카인들보다 강하게 발현됨으로써 대상 조직의 수를 많이 확보하여 TGFβisoform의 발현 양상의 분석을 시도하면 관련 골종양과 TGFβ의 관계 정립에 유용한 자료가 될 수 있을 것으로 생각되었다. 비록 동일인은 아니나 골육종의 경우 재발된 상태와 원발성 골육종 조직에서의 케모카인 및 사이토카인 유전자 발현을 비교 분석한 결과, 원발성 조직에 비해 재발된 조직에서, IFN-γ를 제외한 모든 유전자에서의 강한 발현이 관찰됨에 따라 재발 시 체내 케모카인 및 사이토카인의 상호관계가 상당히 달라진다는 것을 추측할 수 있었으며 IFN-γ의 경우 세포성 면역 반응의 증폭과 대식세포의 활성화와 같이 면역 반응의 활성화를 담당하는 사이토카인으로 써의 중요성과 비록 연구의 방향을 다르나, nudemouse에 골육종을 이식한 뒤 IFN-γ와 IFN-β의 항 종양 효과를 관찰한Gomi등9) 의 연구 결과를 참고로 할 때, 골육종 치료 후 재발하는 경우 임상적 증 이 원발성일 때 보다 심하고 병리조직학적으로도 세포조직의 악성도가 더 높아지며 예후가 나빠지는 현상과의 관련을 추측할 수 있으며 골육종 치료에 있어 IFN-γ역할이 기대되었다. 따라서 동일한 유형의 많은 조직을 확보하여, 골육종의 재발에 있어 IFN-γ의 관련성을 분석하는 작업은, 골육종과 사이 토카인 상호관계 중 IFN-γ역할 정립에 유용한 자료가 될 것으로 생각된다.
후속연구
- 위에 언급 되었듯이 IFN-γ에 의해 유도되는 IP-10의 성향에 따라 IFN-γ의 발현도에 따른 IP-10 유전자 발현도의 관계를 분석해 보았지만 큰 의미를 찾을 수 없어, 이는 근골격계 종양시 체내의 IP-10의 발현을 유도 하는 것은 IFN-γ이외의 다른 인자들에 의해 좌우되는 것이 아닌가 추측되었다. 또한 IFN-γ의 발현이 연부조직 종양들에 비해 골종양에서 상당히 약하거나 음성적으로 나타나, 좀더 많은 대상을 확보하여 IFN-γ와 골종양간의 상호 작용기전에 대한 추후의 연구를 하는 것이 요구되었다. RPA를 이용한 8종 케모카인 유전자 발현 양상을 보면 MIP-1α와 MIP-1β의 발현 역시 관찰되었다.
- 비록 동일인은 아니나 골육종의 경우 재발된 상태와 원발성 골육종 조직에서의 케모카인 및 사이토카인 유전자 발현을 비교 분석한 결과, 원발성 조직에 비해 재발된 조직에서, IFN-γ를 제외한 모든 유전자에서의 강한 발현이 관찰됨에 따라 재발 시 체내 케모카인 및 사이토카인의 상호관계가 상당히 달라진다는 것을 추측할 수 있었으며 IFN-γ의 경우 세포성 면역 반응의 증폭과 대식세포의 활성화와 같이 면역 반응의 활성화를 담당하는 사이토카인으로 써의 중요성과 비록 연구의 방향을 다르나, nudemouse에 골육종을 이식한 뒤 IFN-γ와 IFN-β의 항 종양 효과를 관찰한Gomi등9) 의 연구 결과를 참고로 할 때, 골육종 치료 후 재발하는 경우 임상적 증 이 원발성일 때 보다 심하고 병리조직학적으로도 세포조직의 악성도가 더 높아지며 예후가 나빠지는 현상과의 관련을 추측할 수 있으며 골육종 치료에 있어 IFN-γ역할이 기대되었다. 따라서 동일한 유형의 많은 조직을 확보하여, 골육종의 재발에 있어 IFN-γ의 관련성을 분석하는 작업은, 골육종과 사이 토카인 상호관계 중 IFN-γ역할 정립에 유용한 자료가 될 것으로 생각된다. 또한 동일인을 대상으로 한 항암화학요법 전, 후의 케모카인 및 사이토카인의 발현 변화를 분석시, 치료 전에 비해 치료 후 RANTES 및 IFN-β를 제외한 모든 케모카인 및 사이토카인 유전자 발현이 음성으로 나타났다.
- 다양한 근골격계 종양의 케모카인 및 사이토카인 발현 형태를 조사한 본 연구는 대상의 수가 적어 통계적 분석을 통한 정확한 자료의 제시는 불가능하였으나, 연부조직 종양과 골종양에 있어 일부 케모카인 및 사이토카인의 발현 차이가 있음을 확인하였 고, 골육종의 경우 IFN-γ 및 TGF-βisoform의 발현 분석이 종양의 재발과 치료 후 변화에 대한 지표에 응용될 가능성이 있음을 제시하였다.
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