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문제 정의
- acidophilus GP4A 박테리오신인 acidocin 4A는 Staphylococcus aureus, Yersinia enterocolitica 균주를 비롯한 여러 병원성균들과 다양한 유산균들에게 항균작용을 나타내며 열에 안정한 박테리오신으로 알려져 있다(한 등, 1999). 본 연구는 다양한 단백질 정제 방법을 통해 acidocin 4A를 분리, 정제하여 분자량을 조사하고 전자현미경 관찰을 통한 표적 세포의 성장억제 양상과 생산 관련 유전자의 위치를 파악하고자 실시되었다.
제안 방법
- 3회 계대배양시킨 L. acidophilus GP4A 균주를 1 I MRS 배지에 37℃, 18시간동안 배양시킨 다음 원심분리하여 회수된 상징 액에 50% 농도로ammonium sulfhte를첨가하였다. 침 전물을 2-(4-morpholino)-ethane sulfonic acid(Fisher Biotech, USA) buffer(50 mM, pH 7.
- Acidocin 4A의 항균 작용기 작은 Fig. 3에서 와 같이 표적 세포의 세포벽 구조에 변화를 일으켜 여러 곳의 해리된 세포벽사이로 세포내용물의 유출을 유도하고 cell lysis를 유발, 사멸시키는 bacteriolytic 양상을 나타내었다. 이러한 현상은 대부분의 유산균 박테리오신에서 발견되어진다.
- HPLC gel fHtratioii에서 분리 된 활성 peak를 동결건조하고 tricine SDS・PAGE를 실시하였다.*Schagger와 Jagow, 1987).
- Lactobacillus acidophilus GP4A 균주가 생산하는 acidocin 4A를 정제하고자 ammonium sulphate 짐 전법, Octyl-sepharose CL-4B column chromatography, C, 8 Sep-Pak cartridge, Ci8 RP HPLC, HPLC gel filtration을 실시 하였고 tricine SDS-PAGE# 통해 약 4.1 kQa의 박테리오신임을 확인하였다. Acidocin 4A 의 항균작용 기 작을 £.
- Lactobacillus acidophilus GP4A 균주를 EtBr이 함유된 MRS 배지(25㎍/㎖)에 3번 연속 계대 배양시키고 성 장된 균주를 희 석 하여 MRS agar 에 spread plating 하였다.의 50~100개의 colony?} 관찰된 plate에 L.
- MRS 배지에 L. acidophilus GP4A 균주를 1% 접종하고 37℃, 18시간동안 배양한다음 원심분리(3, 000X g, 15 min)하여 상징 액을 회수하였다. 회수된 상징 액을 pH 6.
- Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis ATCC 4797 균주를 MRS 배지에 2% 접종하고 37℃, 4시간 배양시킨 후 조박테리오신(acidocin 4A)을 1, 600 AU/m£ 농도로 첨가하였다. 동일한 온도에서 1시간 추가 배양시킨 후 원심분리하여 회수된 균체를 40에서 2.
- dolbmeckii subsp. lactis ATCC 4797이 접종된 MRS agar위에 연속2진 희석된 시료를 점적하여 억제환여부를 관찰하고 억제환이 나타난최대 희석배수를 역수로 취 하여 Activity Unit(AU)로 나타냈다.
- delbrueckii subsp. lactis ATCC 4797이 접종된 MRS softagar(0.8%)를overlay시키고 억제환이 형성된 균락과 형성되지 않은균락을 각각선발하였다. 선발된 균주의 plasmid는 Osullivan과 Klaenhammer(1993)의 방법을 변형하여 분리하였으며 lysozyme과 mutanolysin을 사용하여 세포벽을 제거하고 isopropanol 처리과정과 EtBi을 함유한 anunonium acetate를 사용하여 분리 순도를 향상시 켰으며 분리 된 plasmid는 agarose gel(0.
- 1M cacodylate buff&로 두 번 세척한 후 2% osmium teroxide가 함유된 동일 buffer로 4℃, 4시간 처리 하였다. 다시 0JM cacodylate buffer로세척한 후 acetone를 이용하여 탈수시킨 다음 spurr mediunml으로 고정 된 균체를 3% uranyl acetate와 lead citrate로 염색, 절단하여 TEM(H-600, Hitachi, Japan)으로 관찰하였다.
- *Schagger와 Jagow, 1987). 두 장의 gel을 멸균증류수로 세척한후 한 장은 지시균(£. delbrueckii subsp. lactis ATCC 4797) 이 접종된 MRS soft agar로 활성을 확인하는데 사용하였고 나머지 한 장은 silver stain(Bio-rad, USA)을 실시하여 polypeptide SDS-PAGE standard (Bio-rad, USA)와 이동도를 비교하여 분자량을 추정하였다.
- 8%)를overlay시키고 억제환이 형성된 균락과 형성되지 않은균락을 각각선발하였다. 선발된 균주의 plasmid는 Osullivan과 Klaenhammer(1993)의 방법을 변형하여 분리하였으며 lysozyme과 mutanolysin을 사용하여 세포벽을 제거하고 isopropanol 처리과정과 EtBi을 함유한 anunonium acetate를 사용하여 분리 순도를 향상시 켰으며 분리 된 plasmid는 agarose gel(0.8%) 전기 영동을 하였다.
- acidophilus GP4A 균주를 1 I MRS 배지에 37℃, 18시간동안 배양시킨 다음 원심분리하여 회수된 상징 액에 50% 농도로ammonium sulfhte를첨가하였다. 침 전물을 2-(4-morpholino)-ethane sulfonic acid(Fisher Biotech, USA) buffer(50 mM, pH 7.0) 로 현탁 시킨 후 Octyl sepharose CL-4B(Pharmacia Biotech AB, Sweden) column chromatography# 실시한 다음 활성 peak를 회수한 후 다시 Cis Sep-Pak cartridge (Waters Co., USA) 에 흡착시 켜 20, 40, 60 및 80% 농도의 methanol로 용출, 활성을 조사하였다. 활성 분획을 Cis RP column(Sephasil peptide Cis SC 2.
- , USA) 에 흡착시 켜 20, 40, 60 및 80% 농도의 methanol로 용출, 활성을 조사하였다. 활성 분획을 Cis RP column(Sephasil peptide Cis SC 2.1/10)이 장착된 HPLC(Pharmacia Biotech SMART System)에서 0.1% TFA 함유 acetonitrile buffer로 용줄시켰으며 활성 peak를 회수한 다음 다시 HPLC gel filtration(3.2X 300 mm, Superdex Peptide PC 3.2/30 column)을 실시하여 순수한 박테 리오신 peak를 회수하였다.
대상 데이터
- 4 와 같다. 대조구로 사용한 L. acidophilus GP4A wild type 균주의 경우 4개의 plasmid를 보유하고 있었으며 curing 과정을 거쳐고 활성을 나타냈던 균주(VA2)는 약 20 kb의 plasmid만을 보유하였다. 반면, curing 과정에서 활성을소실한균주(VA1)의 경우 활성 보유균주 (VA2)와는 달리 plasmid가 전혀 존재하지 않았다.
성능/효과
- 한다. Acidocin 4A의 분리를 위해 일련의 단백질 정제과정을 적용하였으며 순도를 향상시키고자 Ci8 Sep-Pak cartridge로 소수성 물질을 농죽하는 단계가 주가 되었고 활성은 60%와 80% methanol 분획에서 나타났다. 활성 분획을 다시 CI8 RP column이 장착된 HPLC로 분별하였으며 용출을 위해 사용된 acetonitrile에 의해서는 어떠한 박테리오신 활성도 저해되지 않았다.
- delbrueckii subsp. lactis ATCC 4797을 대상으로 TEM을 이용해 관찰한 결과 세포벽이 해리되고 세포벽사이로 세포내용물이 용출되어 궁극적 으로 cell lysis가 일어 나는 bacteriolytic 현상을 확인하였다. 또한, acidocin 4A의 생산에 관련된 유전자의 존재 위치를 파악하고자 EtBr을 이용한 curing 방법을 실시하였으며 그 결과 약 20 kb 크기의 plasmid에 acidocin 4A 생산과 자체 면역에 관련된 유전자가 존재함을 알 수 있었다
- lactis ATCC 4797을 대상으로 TEM을 이용해 관찰한 결과 세포벽이 해리되고 세포벽사이로 세포내용물이 용출되어 궁극적 으로 cell lysis가 일어 나는 bacteriolytic 현상을 확인하였다. 또한, acidocin 4A의 생산에 관련된 유전자의 존재 위치를 파악하고자 EtBr을 이용한 curing 방법을 실시하였으며 그 결과 약 20 kb 크기의 plasmid에 acidocin 4A 생산과 자체 면역에 관련된 유전자가 존재함을 알 수 있었다
- 그러나 Kelly 등(1996)에 따르면 Plantaricin KW30 박테리오신의 생산능력을 소실시켰을 때에도 균주에 대한 자체 면역 능이 계속 보유되어 본 연구와는 반대의 결과를 나타내었다. 본실험에서는EtBr을이용한curing 방법이 acriflavin, novobiocin 등 다양한 항생제를 사용하였을 때 보다 효과적으로 이루어짐을 알 수 있었다.
- 반면, curing 과정에서 활성을소실한균주(VA1)의 경우 활성 보유균주 (VA2)와는 달리 plasmid가 전혀 존재하지 않았다. 이러 한 결과를 바탕으로 약 20 kb 크기의 plasmid에 박테리오신 생산에 관련된 유전자가존재함을 알 수 있었다. 여 러 박테리오신 생산균주의 경우 자체 면역에 관련된 유전자도 생산유전자와 밀접하게 구성되어 있음이 보고되어진 바(Kanatani 등, 1992) 생산 관련 plasmid가소실되어진 비활성 균주를 다시 지시균으로 사용하여 acidocin 4A 를 첨가(1, 600 AU/㎖)하고 그성장을 조사한 결과 성 장 억 제 현상이 나타남으로 약 20 kb plasmid 에는 생산과 자체 면역에 관련된 유전자가 모두 존재하고 있음을 주정 할 수 있 었다(data not shown).
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