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문제 정의
- 따라서 본 연구는 다양한 원천에서 분리한 유산균에서 박테리오신의 생성을 검사하고, 이 중 축산식품내 문제를 유발시키는 병원성균주에 항균능력이 우수한 박테리오신 생산 유산균을 선별, 동정하였으며 생산된 박테리오신의 특성과 S. aweus에 대한 억제활성에 대하여 조사하고자 하였다.
가설 설정
- 1) Bacteriocin activity is expressed as the percentage(%) of original activity.
제안 방법
- Cell-free supernatant를 IN HC1 과 IN NaOH를 사용하여 각각 pH 2에서 12까지 pH 1씩 증가시킨 후 24시간동안 4℃ 에서 보관하고 다시 pH를 6.5로 조정한 후 박테리오신의 활성을 측정하였다. 또한 다양한 온도(65t, 95℃ 및 121℃)에서 20, 40 및 60분 동안 가열하고 상온으로 냉각시킨 후 박테리오신의 활성 변화를 조사하였다.
- S. aureus를 TSB에서 30℃, 18시간 동안 3회 계대 배양한 후 신선한 10 mL TSB 배지에 약 5 X 104 cfu/mL 수준으로 접종하고, 박테리오신 용액을 12,800 AU/mL 수준으로 첨가하였으며 30 ℃ 항온수조에서 배양하면서 30분, 1시간, 2시간, 3 시간 및 4시간에서의 생균수를 측정하였다.
- 선발된 균주는 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology( 1986) 및 Bergey's Manual of Determinative Bacteriology(1994)에 따라 그람염색, 5℃ 및 45℃에서의 성장 유무, catalase 및 oxidase test, gas 형성 등을 조사하였고 API 50 CH carbohydrate test kit(Bio Merieux, France)를 이용한 당 발효성을 조사하여 ATB identification program(Bio Merieux, France)에 입력한 결과를 바탕으로 동정하였다. 균주의 보존을 위해 모든 균주를 MRS 배지에 3회 계대 배양한 후, 원심분리(3,000Xg, 20 min)한 다음 cell pellet에 skim milk(10%), lactose(2%), yeast extract(0.3%)가 함유된 배지를 제조하여 혼합하였다. 이것을 vial에 1 mL씩 분주하여 동결건조하고 -80℃의 냉동고에 보관하면서 사용하였다.
- 김치, 쇠고기 분쇄육, 산양유, 원유 및 신생아의 분변을 시료로 사용하여 bromocresol purple 0.004%를 첨가한 MRS agar(Difco, USA)에 streak plating법으로 도말하고 혐기상태에서 37E, 48시간동안 배양한 다음 노란색 집락을 띄는 균주들을 선택하여 순수 분리하였다. 선발된 균주는 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology( 1986) 및 Bergey's Manual of Determinative Bacteriology(1994)에 따라 그람염색, 5℃ 및 45℃에서의 성장 유무, catalase 및 oxidase test, gas 형성 등을 조사하였고 API 50 CH carbohydrate test kit(Bio Merieux, France)를 이용한 당 발효성을 조사하여 ATB identification program(Bio Merieux, France)에 입력한 결과를 바탕으로 동정하였다.
- 통성 혐기성의 간균이었다. 또한 catalase와 oxidase는 음성이었고, 가스를 생성하지 않았으며 esculin을 가수분해하였다. 또한 혐기상태에서 잘 성장했으며 호기 상태에서도 약간의 성장률을 나타내었다.
- 5로 조정한 후 박테리오신의 활성을 측정하였다. 또한 다양한 온도(65t, 95℃ 및 121℃)에서 20, 40 및 60분 동안 가열하고 상온으로 냉각시킨 후 박테리오신의 활성 변화를 조사하였다.
- 1)으로 처리한 후 활성을 측정하였다. 또한, 균성장 억제 효과가 균이 성장하는 동안 축적되는 과산화수소에 의한 영향을 배제하기 위하여 시료에 catalase(pH 7.0; E.C. I. U. 1. 6)를 처리한 후 박테리오신의 활성을 검사하였다.
- 모든 유산균과 병원성균은 각각 37℃와 30℃에서 MRS 배지와 Tiyptic Soy Broth(TSB, Difco, USA)를 사용하여 배양하였으며, 분리균의 병원성균에 대한 항균활성 검색에는 Brain Heart Infusion(BHI, Difco, USA) agar를 사용하였다. 또한 ground beef의 저장실험에 사용된 S.
- 박테리오신 항균 활성은 시료를 멸균 증류수로 연속 2진희석 (two-fold dilution) 한 용액을 지시균이 1% 접종된 평판배지 표면에 점적한 다음 37℃에서 18시간동안 배양시킨 후 억제 환을 확인하였다. 지시균의 성장을 저하시키는 가장 높은 희석률을 측정하여 그 희석배수의 역수를 취해 상대적 활성도(AU: Arbitrary Units)로 표현하였다.
- 004%를 첨가한 MRS agar(Difco, USA)에 streak plating법으로 도말하고 혐기상태에서 37E, 48시간동안 배양한 다음 노란색 집락을 띄는 균주들을 선택하여 순수 분리하였다. 선발된 균주는 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology( 1986) 및 Bergey's Manual of Determinative Bacteriology(1994)에 따라 그람염색, 5℃ 및 45℃에서의 성장 유무, catalase 및 oxidase test, gas 형성 등을 조사하였고 API 50 CH carbohydrate test kit(Bio Merieux, France)를 이용한 당 발효성을 조사하여 ATB identification program(Bio Merieux, France)에 입력한 결과를 바탕으로 동정하였다. 균주의 보존을 위해 모든 균주를 MRS 배지에 3회 계대 배양한 후, 원심분리(3,000Xg, 20 min)한 다음 cell pellet에 skim milk(10%), lactose(2%), yeast extract(0.
- 시중에서 판매되는 냉장 쇠고기 분쇄육(ground beef) 50 g 에 약 6X10, cfh/mL수준으로 S. 를 접종하고 박테리오신 용액을 12, 800 AU/g 수준으로 첨가한 다음 잘 혼합하였다. 이것을 불투명 열접착지에 넣고 진공포장(진공도 14.
- 5로 조정하고 다시 멸균 filter (German, Ann Arbor, MI)로 여과하여 상등액을 회수하였다. 이 상등액을 MRS agar 배지에 20㎕ 점적한 후 여기에 지시균(L. delbrueckii ssp. lactis 4797)이 1% 접종된 soft agar (0.8%)를 중층하여 37℃, 24시간 배양한 다음 억제환 생성 유무를 조사하였다.
- 를 접종하고 박테리오신 용액을 12, 800 AU/g 수준으로 첨가한 다음 잘 혼합하였다. 이것을 불투명 열접착지에 넣고 진공포장(진공도 14.5, 접착력 1.1)하였으며 냉장저장하면서 기간별(0, 3, 5, 7, 10, 14일)로 대조구와 박테리오신 처리구 시료를 각각 3개씩 꺼내어 S. 의 생균수를 조사하였다.
- 확인하였다. 지시균의 성장을 저하시키는 가장 높은 희석률을 측정하여 그 희석배수의 역수를 취해 상대적 활성도(AU: Arbitrary Units)로 표현하였다.
대상 데이터
- 10종의 항균물질 생산 균주를 대상으로 24종의 병원성 균주에 대한 항균 능력을 조사하였으며 (data not shown) 그 증 항균 범위가 가장 우수한 쇠고기 분쇄육에서 분리된 1개의 균주를 선정하였다. 선정된 균주의 항균 spectrum을 조사한 결과는 Table 1과 같다.
- 김치, 쇠고기 분쇄육, 산양유, 원유 그리고 신생아의 분변으로부터 colony주위로 전형적인 노란색 환이 나타난 130개의 균주를 분리하였다. 이들 균주를 대상으로 L.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 반복하여 수행하였으며 통계처리는 SAS package(1996)의 GLM procedure# 이용하여 LS(least square) means를 비교하였다.
이론/모형
- 항균 물질에 대한 단백질 분해효소의 영향을 조사하기 위하여 Ferreira와 Gilliland(1988)의 방법을 이용하여 trypsin (pH 7.6; Type H, crude) 및 pepsin(pH 2.0; E.C. 3.4.23.1)으로 처리한 후 활성을 측정하였다. 또한, 균성장 억제 효과가 균이 성장하는 동안 축적되는 과산화수소에 의한 영향을 배제하기 위하여 시료에 catalase(pH 7.
성능/효과
- 15℃에서의 생장이 확인되었으나 45℃에서는 거의 생장하지 못하는 것으로 나타났다. API 50 CH kit를 사용하여 당 발효성 실험을 실시하였으며 그 결과를 ATB identification program에 입력한 결과, 95% 수준에서 L. plantarum ssp.로 동정되었다.
- Fig. 3에서 보는 바와 같이, 대조구에서는 저장 3일째부터 S. aureus 균주의 유의적 증가가 나타났지만, 박테리오신 처리 구에서는 저장 7일째까지 최초의 균수와 유의적 차이 없이 일정한 균수를 유지함을 알 수 있었다(p<005). 시료저장 10 일째부터는 모든 처리구에서 공히 유의적인 균수의 증가를 나타냄으로써 박테리오신의 저장효과가 둔화됨을 알 수 있었으나 여전히 대조구에 비해서는 유의적으로 현저히 적은 균수를 나타내고 있었다<0.
- delbrueckii ssp. lactis 4797에 대한 항균활성을 조사한 결과 김치에서 9 균주, 분쇄육에서 7균주, 산양유에서 5균주, 원유에서 1 균주 그리고 분변에서 3균주 총 25개의 균주가 항균활성 또는 유사 항균활성을 나타내었다(data not shown). 그 중 agar spot test에 의해 배양 상등액에서 항균활성을 보이며 pepsin 및 trypsin 등의 단백질 분해효소 처리에 의해 항균활성이 소실되고 catalase 처리시에도 항균활성이 소실되지 않아 항균물질이 단백질성 물질임을 추측할 수 있는 균주는 총 10균주로 확인되었다(data not shown).
- lactis 4797에 대한 항균활성을 조사한 결과 김치에서 9 균주, 분쇄육에서 7균주, 산양유에서 5균주, 원유에서 1 균주 그리고 분변에서 3균주 총 25개의 균주가 항균활성 또는 유사 항균활성을 나타내었다(data not shown). 그 중 agar spot test에 의해 배양 상등액에서 항균활성을 보이며 pepsin 및 trypsin 등의 단백질 분해효소 처리에 의해 항균활성이 소실되고 catalase 처리시에도 항균활성이 소실되지 않아 항균물질이 단백질성 물질임을 추측할 수 있는 균주는 총 10균주로 확인되었다(data not shown).
- camis가 생산하는 박테리오신도 pH 2~11의 넓은 범위에서도 안정하다고 보고되었다(De Vuyst and Vandam- me, 1994). 따라서, 본 연구에서 선발된 박테리오신은 다른 연구자들에 의해 보고된 박테리오신들에 비해 비교적 pH 안정성이 우수한 것으로 나타났다.
- plantarum KU107이 생산하는 항균물질은 trypsin처리에 의해서 억제 활성이 소실되었으며, pepsin을 처리한 경우에서도 항균활성이 나타나지 않았다. 또한 catalase처리한 경우 활성이 유지되는 것으로 보아 박테리오신임을 알 수 있었다.
- 또한 catalase와 oxidase는 음성이었고, 가스를 생성하지 않았으며 esculin을 가수분해하였다. 또한 혐기상태에서 잘 성장했으며 호기 상태에서도 약간의 성장률을 나타내었다. 15℃에서의 생장이 확인되었으나 45℃에서는 거의 생장하지 못하는 것으로 나타났다.
- cremor/s에서 분리한 diplococcine 100℃에서 1분간 처리로 항균 활성이 소실되는 것으로 나타났다(Davey, 1981; Bare-hoot and Klaenhammer, 1983). 본 실험에서는 65 ℃와 95 ℃ 모두 60분까지의 열처리와 121 ℃, 20분 열처리시에도 어떠한 활성의 소실없이 안정하였으며, 121 ℃, 40분과 60분 열처리에는 각각 50% 및 75%씩 감소하여 열에 매우 안정한 박테리오신을 생산하는 것으로 나타났다{Table 2). 그러나, 박테리오신의 구조를 포함한 분자 생물학적 특성을 알기 위해서는 추가적인 실험 이 필요할 것으로 생각된다.
- aureus 균주의 유의적 증가가 나타났지만, 박테리오신 처리 구에서는 저장 7일째까지 최초의 균수와 유의적 차이 없이 일정한 균수를 유지함을 알 수 있었다(p<005). 시료저장 10 일째부터는 모든 처리구에서 공히 유의적인 균수의 증가를 나타냄으로써 박테리오신의 저장효과가 둔화됨을 알 수 있었으나 여전히 대조구에 비해서는 유의적으로 현저히 적은 균수를 나타내고 있었다<0.05). 저장 10일째부터는 S.
- sake 19개 균주 중 6개 균주뿐이었다고 보고하였다. 이와 같이, 박테리오신검색 방법 중 직접적인 검색방법인 agar spot test와 배양 상징액을 이용한 간접적인 검색방법의 결과가 일치하지 않음을 알 수 있었으며 이는 박테리오신을 제외한 다른 항균물질에 의해 나타나는 효과를 제거시키지 않은 차이로 판단된다. 또한, De Vuyst 와 Vandamrne(1994) 은 젖산균 중 박테리오신 생산균주의 빈도가 연구자마다 크게 다른 것은 박테리오신 생산 균주의 확인이 전적으로 지시균주에 달려있기 때문이라고 설명하고 있다.
- 05). 저장 10일째부터는 S. aureus 균수의 증가가 두드러지는 것으로 보아 박테리오신의 항균활성도 일정기간이 지나면 소멸되는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 분쇄육에서 유리되는 효소 등에 의한 박테리오신의 분해에 따른 활성의 소실로 추정된다.
- 조박테리오신 용액(12, 800 AU/mL)은 중성 pH인 6~8에서 어떠한 활성의 소실없이 안정하였고 그 밖의 범위에서는 점차 활성이 감소하는 경향을 나타내었으나 pH 2와 12에서도 그 활성이 완전하게 소실되지는 않았다(Table 2).
후속연구
- 본 실험에서는 65 ℃와 95 ℃ 모두 60분까지의 열처리와 121 ℃, 20분 열처리시에도 어떠한 활성의 소실없이 안정하였으며, 121 ℃, 40분과 60분 열처리에는 각각 50% 및 75%씩 감소하여 열에 매우 안정한 박테리오신을 생산하는 것으로 나타났다{Table 2). 그러나, 박테리오신의 구조를 포함한 분자 생물학적 특성을 알기 위해서는 추가적인 실험 이 필요할 것으로 생각된다.
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