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문제 정의
- 본 연구에서는 고부가가치를 가진 전통 민속주를 개발하기 위하여 먼저 일부 전통주 제조에 사용되고 있는 발효제의 미생물 분포와 각종 효소 활성을 측정하고 이들로부터 산업적으로 응용성이 큰 콤팡이와 효모를 분리, 동정한 후 이들의 특성을 조사하였다.
제안 방법
- YPD배지에 glucose는 50%, NaCl과 에탄올은 20% 첨가하고 300에서 2~4일간 시험 균주를 배양한 후 생육 정도를 분광 분석기 660nm에서 흡광도를 측정하여 이들의 내 성을 조사하였다"2)
- a-amylase 활성은 이 둥'기의 방법에 따라 다음과 같이 측정하였다. 10개의 시험관에 효소액을 각각 1ml, 0.5ml, 0.25ml 씩 첨가한 후 각 관에 1% 가용성 starch액 5ml와 toluene 2~3방울 첨가한 다음 38℃의 shaking water bath에서 2시간 반응시켰다. 여기에 Iodine액 수 방울을 첨가하여 청색이 나타나지 않는 효소량을 정하여 활성으로 하였다.
- 20%의 glucose를 함유한 YPD배지 (pH 5.0)에 청양군에서 가져온 구기자 전통주 발 효균주 전배양액을 5%첨가하여 30C에서 4일간 발효시켰다. 발효액의 에탄올 함량은 상법에 따라 일반 수증기 증류법으로 측정하였다.
- 각종 당에 대한 자화성과 발효성을 Table 4에 나타내었다. glucose에 대해서는 3, 4, 9, 11번 균주가 발효를 시켰고 glucose, galactose, sucrose, maltose, xylose, sorbitol 등을 모두 자화시켰다.
- 배양한 후 각각의 배지에서 생존하는 세균, 효모, 곰팡이의 colony 수를 측정하여 미생물 분포(microflora)를 조사하였다. 또한 분리 곰팡이들의 동정은 이들을 PDA배지에 접종하여 25℃에서 5일간 slide 배양한 후 형태와 포자, 균사의 특징 등을 광학 현미경으로 조사하여 곰팡이 동정법을 이용하여 동정하였다H
- 또한 화학제에 대한 내성은 효모의 생육을 억제하는 것으로 알려진 cycloheximide를 YPD배지에 lOOOppm까지 첨가한 후 위와 같은 방법으로 시험균주의 내성을 조사하였다.*
- 발효제로부터 50/zg/ml streptomycin을 첨가한 PDA 배지를 사용하여 최종적으로 14개의 곰팡이를 순수분리하였다.
- 전통주 발효제 1g을 30ml의 멸균수에 현탁시킨 후 10분간 실온에서 정치한 다음 상 둥액 10μl를 취하여 100배 희석시킨 후 육종 한천배지, 50㎍/ml의 streptomycin을 함유 한 YPD 배지와 PDA 배지에 각각 도말한 후, 각각 37t, 300, 25C에서 24시간 동안 배양하였다. 배양한 후 각각의 배지에서 생존하는 세균, 효모, 곰팡이의 colony 수를 측정하여 미생물 분포(microflora)를 조사하였다. 또한 분리 곰팡이들의 동정은 이들을 PDA배지에 접종하여 25℃에서 5일간 slide 배양한 후 형태와 포자, 균사의 특징 등을 광학 현미경으로 조사하여 곰팡이 동정법을 이용하여 동정하였다H
- 분리 균주의 당 자화성과 발효성을 조사하기 위해 glucose, galactose, sucrose, lactose, maltose, raffinose, soluble starch, xylose, arabinose, sorbitol, inositol, imilin, erythritol, melezitose, citric acid를 5ml에 대한 0.5%를 4.5ml에 녹인 다음 멸균 한 후 yeast nitrogen base를 제균여과하여 0.5ml첨가한 후 접종하여 300에서 3일간 배양하였다.14)
- 25ml 씩 첨가한 후 각 관에 1% 가용성 starch액 5ml와 toluene 2~3방울 첨가한 다음 38℃의 shaking water bath에서 2시간 반응시켰다. 여기에 Iodine액 수 방울을 첨가하여 청색이 나타나지 않는 효소량을 정하여 활성으로 하였다. 효소 단위는 표준 조건하에서 효소액 hnl가 1분 동안 1g의 starch를 분해하는 것을 lunit로 하였다.
- 과 Aspergillus sp.을 각각의 PDA 액체배지에서 5일 배양하여 원심 분리한 후 각각의 상등액의 amylase 활성을 측정하였다. Table 6에서 보는 바와 같이 Aspergillus sp.
- 5ml을 가하여 상온에서 20분간 방치한 다음 5000rpm에서 15분 동안 원심분리 하였다. 이 상등액 1ml에 O.55M Na2CO3 2.5ml와 IN fblin 시약 0.5ml을 가하여 381에서 30분간 발색 시킨 후 660nm에서 흡광도를 측정하였고, 효소 단위는 표준 조건하에서 1분 에 l㎍ tyrosine 상당량의 folin 발색성 비단백성 물질을 생성하는 것을 lunit로 하였다.10)
- 전통주 발효제 1g을 30ml의 멸균수에 현탁시킨 후 10분간 실온에서 정치한 다음 상 둥액 10μl를 취하여 100배 희석시킨 후 육종 한천배지, 50㎍/ml의 streptomycin을 함유 한 YPD 배지와 PDA 배지에 각각 도말한 후, 각각 37t, 300, 25C에서 24시간 동안 배양하였다. 배양한 후 각각의 배지에서 생존하는 세균, 효모, 곰팡이의 colony 수를 측정하여 미생물 분포(microflora)를 조사하였다.
- 전통주 발효제에서 최종 6주의 각기 다른 효모들을 분리하였고, 이들의 형태학적, 배양학적, 및 생리 생화학적 특성과 당 이용성(발효성) 등을 조사하였다. 먼저 Table 2 은 형태학적 특성을 나타낸 것으로 난형 또는 구형의 모양으로 출아에 의한 무성생식 을 하였고 모자 모양의 포자를 형성하였으며 의균사를 형성하지 않았다.
대상 데이터
- 전통 발효제는 현재 시판되고 있는 DS 민속주의 발효제를 구입하여 사용하였다H 에탄올과 염류 등의 각종 내성 실험과 알코올 발효 실험에는 20% glucose를 함유한 YPD배지를 사용하였고 곰팡이와 세균의 분리용 배지로는 각각 Streptomycin을 50㎍/ml 함유한 PDA 배지와 육즙배지를 사용하였다.9)
이론/모형
- a-amylase 활성은 이 둥'기의 방법에 따라 다음과 같이 측정하였다. 10개의 시험관에 효소액을 각각 1ml, 0.
- 0)에 청양군에서 가져온 구기자 전통주 발 효균주 전배양액을 5%첨가하여 30C에서 4일간 발효시켰다. 발효액의 에탄올 함량은 상법에 따라 일반 수증기 증류법으로 측정하였다.8,13)
- 효모들도 각 균들의 형태학적, 생화학적 특성 등을 효모의 분류동정법10)에 따라 조 사한 후 Lodder의 The Yeast, a taxonomic study11)로 동정하였다.
성능/효과
- 발효제는 전분을 당화시키는 효소를 생산하는 곰팡이를 배양해 놓은 것으로 국, 입 국, 분국 등으로 구분된다.4) 즉 누룩은 조분쇄한 생전분질 원료와 물을 혼합해 일정한 크기로 성형하여 원료에 부착한 미생물뿐 아니라 공기 중의 야생 미생물의 자연 접종 으로 제조된다한국의 전통적 누룩은 오래전부터 쌀 약주와 탁주 제조에서 전분 분 해 효소 및 발효 미생물원으로 사용된 긴 역사를 지닌 미생물 유기체로서 소맥을 주 원료로 하여 제조되어 왔으며, 소맥의 분쇄 정도에 따라 거친 것은 조곡, 고운 것을 분곡으로, 계절에 따라 춘곡, 하곡, 절곡, 동곡으로 분류되고 있다. 제조방법은 증자과정을 거치지 않고 분쇄한 생소맥분에 수분을 약 30-40%로 가하고 원형판으로 성형하여 충분한 발효기간을 거친 후 건조시키는 것으로 이러한 과정 중 세균, 효모, 곰팡이 등의 미생물이 착생, 번식하게 되고 이들은 주조시 액화 및 당화, 알콜 발효 등의 중요한 역할을 하게 된다.
- Table 3는 생리 생화학적 특성을 나타낸 것으로 모두 질산염을 자화시켰으며 urease 활성은 2, 9, 11번 균주를 제외하고는 없었다. 또한 cycloheximide에 대하여 lOOOppm까 지도 내성을 나타내었고 pellicles를 형성하는 것으로 관찰되었다.
- cerevisiae 등과 같은 Saccharomyces 속균은 분리되 지 않았는데 이는 아마도 분리 균주중 일부가 생성하는 killer toxin에 의해 이들의 생 육이 억제되었거나 발효제 제조중 첨가되는 특정 약용식물에서 이들의 생육을 저해시 키는 물질이 용출되었기 때문인 것으로 추정된다. 또한 이와 같이 발효제에 주로 Hansenula 속균들이 많이 분포하는 것으로 보아 자체의 알콜 발효력이 매우 미약할 것으로 추정되고 따라서 전통주 제조시 보다 효율적인 에탄올 생산을 위해 별도의 효 모를 첨가하는 것이 좋을 것으로 추정된다.
- 발효제 추출물 일정량을 각각 NBA 배지, 50㎍/ml streptomycin을 첨가한 YPD 배지, 50/zg/ml streptomycin을 첨가한 PDA 배지에 spreading한 후, 373*00, 25C에서 배양 한 후 생균수를 측정한 결과 Table L에서 보는 바와 같이 세균의 집락수는 1.3 x 107(CFU/g), 곰팡이는 4.4 X lOeCFU/g)이었다. 세균이 다른 두 미생물보다 많은 것은 아마도 발효제의 보관 장소가 다습한 곳이었고 따라서 발효제의 수분활성도(Aw)가 높 아 세균의 생육에 적합하였기 때문인 것으로 추정된다.
- 발효제의 amylase 활성과 protease의 활성을 측정한 결과 amylase 활성은 120.0 Unit/g 이었고, protease 활성은 36.6 Unit/g이었다어ata not shown). 주류제조에서는 protease 활 성보다 amylase 활성이 술의 생산 수율에 직접적으로 영향을 미치므로 매우 중요하다.
- 또한, Rhizopus sp과 Aspergillus sp.을 각각의 PDA 액체배지에서 5일 배양하여 protease 활성을 측정한 결과 1번과 39번 균주들롤 제외하고 모든 균주들이 protease 활 성을 갖고 있었다. 특히 8번 균주는 45.
- 형태학적인 특성을 광학 현미경을 이용하여 조사한 결과 청록색~검정색을 띠는 포 자와 균사를 가진 균들과 검정색만 띠는 포자와 균사를 가진 곰팡이들이 주로 분리되었다. 이들 균들의 포자낭, 가근과 포복지 형성, 정낭과 분생포자 등을 관찰하여 동정 한 결과 1번 균주부터 41번 균주까지는 대체로 Rhizopus 속균으로 추정되었고 46번, 53번, 64번 균주들은 Aspergillus 속균으로 추정되었다(data not shown).
- 이러한 특성들을 종합하여 The Yeast, a taxonomic study로 동정한 결과 6균주 중 1 번 균주는 Hansenula alni 로, 2번 균주는 Hansenula canadensis 로 동정되었다. 나머지 3번 균주는 Hansenula silvicola 로, 4번 균주는 Hansenula caltfornica 로, 9번 균주는 Hansenula beijerinckii 로 동정되었고 마지막 11번 균주는 Hansenula saturnus var.
- 한편 최종 분리 균주의 알콜 생성량을 조사한 결과(Table 5), 3번 균주가 약 3% 정도의 낮은 알콜 생성량을 보였을 뿐 여타의 효모는 알콜을 생성하지 않았다.
- 형태학적인 특성을 광학 현미경을 이용하여 조사한 결과 청록색~검정색을 띠는 포 자와 균사를 가진 균들과 검정색만 띠는 포자와 균사를 가진 곰팡이들이 주로 분리되었다. 이들 균들의 포자낭, 가근과 포복지 형성, 정낭과 분생포자 등을 관찰하여 동정 한 결과 1번 균주부터 41번 균주까지는 대체로 Rhizopus 속균으로 추정되었고 46번, 53번, 64번 균주들은 Aspergillus 속균으로 추정되었다(data not shown).
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