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문제 정의
- 본 연구는 Melatonin의 강력한 유리기제거 기능과 림프구들을 자극해 Interferon gamma(IFN- Y)유도체로서 Ge-1327} 갖고 있는 면역강화 작용을 이용하여 방사선피폭 시 주 사망원인인 급성 조혈계 증후군에 대하여 melatonin 전처치가 갖는 방어효과를 알아보고 Ge-132 후처치가 생존율에 미치는 영향을 동물실험을 통해 연구하여 유효한 단독 또는 복합 방사선방어제로서의 활용 가능성을 확인하고자 시행하였다.
- 전혈구 검사(CBC)는 임상적으로 골수억제 정도를 파악하여 급성조혈계증후군의 발생유무를 예측하는데 가장 접근성을 지닌 검사라고 판단되는데 본 연구에서는 피폭 10 - 15일 후에 동물에서 급성 조혈계 증후군으로 인한 최대사망빈도를 보인다는 점과 피폭 후 7 - 10일째에 백혈구가 최저수준의 수치를 보이는 점을 고려하여 측정시점을 8 일째로 선택하였다. 또한 본 연구에서 방어제들에따른 LD5O/3O수치를 구하여 실험군별로 선량 감소계수(dose reduction factor, DRFX 직접 비교하지는 않았으나 생존율 비교는 방어제들의 효과를 판정하는데 가장 널리 사용되고 실제 사용 가능성을 예측하는데 가장 중요한 연구일 것이다. 대개의 연구들에서 전신피폭 시 위장관계증후군에 기인한 사망은 피폭 후 7 - 10일까지의 생존분석을 통해서, 그리고 조혈계증후군으로 인한 사망은 30일째까지의 생존분석으로 판단한다.
제안 방법
- 고용량의 방사선에 의한 급성, 전신피폭 상황을 7 - 8주령의 수컷 ICR 마우스와 방사선 발생 장치인 6MV 선형가속기 (Siemens, PA)를 통해 재현하여 3 Gy/min의 고선량률로 급성조혈계 증상을 유발하기 위해 8 Gy의 선량을 전신피폭 시켰다. Melatonin(Sigma, St.
- Melatonin(Sigma, St. Louis)은 70% DMSO 용액에서 완전히 용해시킨 후 200 ㎎/㎏의 용량으로 피폭 1시간 전에 복강주사를 실시해 전처 치하였으며, Ge-132(Sigma, St. Louis)는 피폭 후 감염에 가장 취약한 시기를 고려하여 피폭 5일째부터 20일째까지 130 - 150 ㎎/㎏/d의 용량으로 식수에 녹여 경구복용 시켰다.
- 3 실험군(정상대조군, 피폭단독군, melatonin 전처치군)에서 피폭 6시간째에 Spleen을 절제하여 고정 후, 파라핀 포매 조직을 4 ㎛ 두께로 박절한 종단면 상에서 ApopTag plus peroxidase in situ apoptosis detection kit(Intergen, NY)를 사용해 Terminal transferase-mediated dUDT- digoxigenin nick end labeling(TUNEL) assay를 시행하였다. xylene에 탈파라핀한 후 알코올로 함수 과정을 거친 다음 PBS로 세척하였다.
- xylene에 탈파라핀한 후 알코올로 함수 과정을 거친 다음 PBS로 세척하였다. 40 M 농도의 Proteinase K로 20분간 처리한 후 PBS로세 척하고 내인성 과산화효소 활성을 제거하기 위해 3% 과산화수소(H2O2)로 15분간 처리하여 즉시 PBS 로 세척하였다. 20분간 equilibration buffer로 전처리한 후 TdT혼합액을 슬라이드 당 40 ㎍씩 분주하여 37℃ 의 humidified chamber에서 1시간 동안 반응시켰다.
- 그 후 슬라이드를 stop/wash buffer에 10분간 두어 효소작용을 중지시킨 후 PBS로 세척하였다. 실온에서 30분간 anti-digoxigenin conjugate 용액과 반응시킨 후 PBS로 세척하고 diethyl amino benzidine(DAB)을 처리하여 5분간 발색반응을 거쳐 thionin blue로 대조염색한 후 봉입하여 광학현미경 하에서 관찰하였다. 양성 대조표본은 쥐의 유선(mammary 이and) 절편을 사용하였고 음성 대조표본은 TdT 혼합액 대신 equilibration buffer로 대체하여 사용하였다.
- 양성 대조표본은 쥐의 유선(mammary 이and) 절편을 사용하였고 음성 대조표본은 TdT 혼합액 대신 equilibration buffer로 대체하여 사용하였다. AI는 Spleen white pulp당 TUNEL(+) 세포들의 %로 정의하였고 실험군 당 5 마우스, 그리고 마우스 당 5 white pulps에서 측정하였다.
- 3 실험군(정상대조군, 피폭단독군, melatonin 전처치군) 당 7 마우스에서 피폭 후 2일(44-46시간)째에 심장천자를 실시해 혈액을 채취하여 동물용 CBC 계측기인 HEMAVET® 850(CDC Technologies, Oxford, CT)로 총 백혈구 수치와 림프구 비율을 구하여 측정하였다.
- 3 실험군(정상대조군, 피폭단독군, melatonin 전처치군) 당 7 마우스에서 피폭 후 8일째에 심장 천자를 실시해 혈액을 채취하여 총 백혈구 수치를 측정하였다.
- 4 실험군(피폭단독군, melatonin 전처치군, Ge- 132 후처치군, melatonin 전처치 및 Ge-132 후처치군)에서 실험군 당 16 마우스를 배정하여 피폭 후 30일째까지 매일 날짜경과에 따라 사망한 마우스를 측정하였다.
- 본 연구에서 피폭 후 림프구 생존수준을 측정하기 위해 Spleen white pulps 내의 세포 고사 지수와 혈액 내 림프구 수치를 측정하였는데, 림프구 자체는 방사선에 매우 민감한 세포로 방사선 유도성 림프구 사망은 대개 세포고사성 사망(apoptotic death)으로 알려지며 피폭 후 6 - 8시간에 최대의 세포 고사 빈도를 보인다고 한다. 또한 전신 피폭 후 24 - 48시간째의 혈액 내 림프구 수치는 피폭의 정도를 예측하는데 유효한 정보로 이용되는데 [14] 본 연구에서는 피폭 후 기저수준을 보이는 시기로 알려진 피폭 2일째를 측정 시기로 선택하였다.
- 빈도를 보인다고 한다. 또한 전신 피폭 후 24 - 48시간째의 혈액 내 림프구 수치는 피폭의 정도를 예측하는데 유효한 정보로 이용되는데 [14] 본 연구에서는 피폭 후 기저수준을 보이는 시기로 알려진 피폭 2일째를 측정 시기로 선택하였다. 결과에서 피폭단독군과 melatonin 전처치군 모두에서 정상대조군에 비해 현저히 낮은 수치를 확인할 수 있었고 8 Gy 의 고선량 하에서 melatonin 전처치로 인한 림프구 보호효과를 확인할 수 없어, 이는 Ge-132 투여로 인한 림프구에서 IFN-Y 유도증가가 이루어지지 않아 감염에 의한 사망을 막을 수 없는 결과로 이어졌다고 판단된다.
- 결과에서 피폭단독군과 melatonin 전처치군 모두에서 정상대조군에 비해 현저히 낮은 수치를 확인할 수 있었고 8 Gy 의 고선량 하에서 melatonin 전처치로 인한 림프구 보호효과를 확인할 수 없어, 이는 Ge-132 투여로 인한 림프구에서 IFN-Y 유도증가가 이루어지지 않아 감염에 의한 사망을 막을 수 없는 결과로 이어졌다고 판단된다. 전혈구 검사(CBC)는 임상적으로 골수억제 정도를 파악하여 급성조혈계증후군의 발생유무를 예측하는데 가장 접근성을 지닌 검사라고 판단되는데 본 연구에서는 피폭 10 - 15일 후에 동물에서 급성 조혈계 증후군으로 인한 최대사망빈도를 보인다는 점과 피폭 후 7 - 10일째에 백혈구가 최저수준의 수치를 보이는 점을 고려하여 측정시점을 8 일째로 선택하였다. 또한 본 연구에서 방어제들에따른 LD5O/3O수치를 구하여 실험군별로 선량 감소계수(dose reduction factor, DRFX 직접 비교하지는 않았으나 생존율 비교는 방어제들의 효과를 판정하는데 가장 널리 사용되고 실제 사용 가능성을 예측하는데 가장 중요한 연구일 것이다.
대상 데이터
- 실온에서 30분간 anti-digoxigenin conjugate 용액과 반응시킨 후 PBS로 세척하고 diethyl amino benzidine(DAB)을 처리하여 5분간 발색반응을 거쳐 thionin blue로 대조염색한 후 봉입하여 광학현미경 하에서 관찰하였다. 양성 대조표본은 쥐의 유선(mammary 이and) 절편을 사용하였고 음성 대조표본은 TdT 혼합액 대신 equilibration buffer로 대체하여 사용하였다. AI는 Spleen white pulp당 TUNEL(+) 세포들의 %로 정의하였고 실험군 당 5 마우스, 그리고 마우스 당 5 white pulps에서 측정하였다.
데이터처리
- SPSS를 이용하여 AI는 Student t-test로 피폭 단독 군과 melatonin 전처치군 간에 평균치 검정을 실시하였고, 림프구와 백혈구 수치들은 비모수 검정으로 Mann-Whiteny U-test를 실시하여 분석하였다. 생존분석은 Kaplan-Meier method로 분석하였고, 실험군들 간에 생존율의 차이는 Log rank test로 유의성을 검정하였다.
- 생존분석은 Kaplan-Meier method로 분석하였고, 실험군들 간에 생존율의 차이는 Log rank test로 유의성을 검정하였다. p값이 0.
성능/효과
- 피폭 6시간째에 Spleen에서 시행한 TUNEL assay(Fig. 1)에서 진한 갈색으로 염색되는TUNEL (+) 세포들은 림프구들로 구성된 white pulps 내에서 주로 관찰되었으며, 실험군에 따른 평균 AI 는 3.3%(정상대조군), 47.8%(피폭단독군), 그리고 45.9% (melatonin 전처치군)로 피폭단독군과 melatonin 전처치군 간에 유의한 차이가 없었고 (p=0.385), 피폭 2일째의 평균 림프구 수치에서도 2367㎕(정상대조군), 97/㎕(피폭단독군), 그리고101/㎕ (melatonin 전처치군)로 피폭단독군과 melatonin 전처치군 간에 유의한 차이가 없었다 (p=0.898).
- 피폭 8일째의 실험군별 평균 총 백혈구 수치는 3273/㎕(정상대조군), 147/㎕(피폭단독군), 그리고 306/㎕(melatonin 전처치군)로 피폭단독군에 비해 melatonin 전처치군에서 유의하게 높은 수치를 보였다 (p=0.010).
- Kaplan-Meier method로 분석한 피폭 30일째까지의 생존율 그래프(Fig. 2)에서 피폭단독군은 피폭 후 12일째부터 23일째까지 사망이 관찰되었으며, 실험군별로 30일째의 생존율은 각각 21.4%(피폭 단독 군), 100%(melatonin 전처치 군), 35.7%(Ge- 132 후처치군), 그리고 85.7%(melatonin 전처치 및 Ge-132 후처치군)였다. 실험군들 간에 생존율의 차이는 melatonin 전처치로 인한 피폭단독군 (p=0.
- 7%(melatonin 전처치 및 Ge-132 후처치군)였다. 실험군들 간에 생존율의 차이는 melatonin 전처치로 인한 피폭단독군 (p=0.000)이나 Ge-132 후처치군(p=0.0003)에 유의하게 비교되는 생존을 볼 수 있었고, 피폭단독군 vs Ge-132 후처치군(p=0.7030), 그리고 melatonin 전처치군 vs melatonin 전처치 및 Ge-132 후 처치군(p=0.1496) 간에는 유의한 생존율의 차이를 보이지 않았다.
- 또한 전신 피폭 후 24 - 48시간째의 혈액 내 림프구 수치는 피폭의 정도를 예측하는데 유효한 정보로 이용되는데 [14] 본 연구에서는 피폭 후 기저수준을 보이는 시기로 알려진 피폭 2일째를 측정 시기로 선택하였다. 결과에서 피폭단독군과 melatonin 전처치군 모두에서 정상대조군에 비해 현저히 낮은 수치를 확인할 수 있었고 8 Gy 의 고선량 하에서 melatonin 전처치로 인한 림프구 보호효과를 확인할 수 없어, 이는 Ge-132 투여로 인한 림프구에서 IFN-Y 유도증가가 이루어지지 않아 감염에 의한 사망을 막을 수 없는 결과로 이어졌다고 판단된다. 전혈구 검사(CBC)는 임상적으로 골수억제 정도를 파악하여 급성조혈계증후군의 발생유무를 예측하는데 가장 접근성을 지닌 검사라고 판단되는데 본 연구에서는 피폭 10 - 15일 후에 동물에서 급성 조혈계 증후군으로 인한 최대사망빈도를 보인다는 점과 피폭 후 7 - 10일째에 백혈구가 최저수준의 수치를 보이는 점을 고려하여 측정시점을 8 일째로 선택하였다.
- 또한 본 연구에서 방어제들에따른 LD5O/3O수치를 구하여 실험군별로 선량 감소계수(dose reduction factor, DRFX 직접 비교하지는 않았으나 생존율 비교는 방어제들의 효과를 판정하는데 가장 널리 사용되고 실제 사용 가능성을 예측하는데 가장 중요한 연구일 것이다. 대개의 연구들에서 전신피폭 시 위장관계증후군에 기인한 사망은 피폭 후 7 - 10일까지의 생존분석을 통해서, 그리고 조혈계증후군으로 인한 사망은 30일째까지의 생존분석으로 판단한다. 결과에서 피폭 단독 군에서 피폭 10일째까지 사망한 마우스는 관찰되지 않아 최소한 8 Gy의 선량 하에서 위장관계 증후군으로 인한 사망은 없었다고 생각되며, melatonin 전처치군에서 총 백혈구 수치가 정상 대조군 보다는 현저히 낮은 수치를 보이지만 피폭 단독 군과는 유의하게 비교되는 높은 수치를 보여 실험군들 간의 생존분석에서 melatonin 전처치로 인한 생존율에서 유의한 증가의 결과로 나타났다고 판단된다.
- 대개의 연구들에서 전신피폭 시 위장관계증후군에 기인한 사망은 피폭 후 7 - 10일까지의 생존분석을 통해서, 그리고 조혈계증후군으로 인한 사망은 30일째까지의 생존분석으로 판단한다. 결과에서 피폭 단독 군에서 피폭 10일째까지 사망한 마우스는 관찰되지 않아 최소한 8 Gy의 선량 하에서 위장관계 증후군으로 인한 사망은 없었다고 생각되며, melatonin 전처치군에서 총 백혈구 수치가 정상 대조군 보다는 현저히 낮은 수치를 보이지만 피폭 단독 군과는 유의하게 비교되는 높은 수치를 보여 실험군들 간의 생존분석에서 melatonin 전처치로 인한 생존율에서 유의한 증가의 결과로 나타났다고 판단된다.
- Melatonin 전처치는 피폭단독군에 비해 총 백혈구 수치에서 유의한 증가를 가져왔고, 피폭 단독 군이나 Ge-132 후처치군에 비교되는 생존율의 향상을 보였다.
- 본 연구결과는 방사선피폭 후 급성 조혈계 증후군에 대하여 melatonin 전처치제가 방사선 방어 제로서 효능을 지님을 보여주고 있으며, Ge-132 단독 및 추가 후처치로 인한 생존율에서의 향상은 관찰 할 수 없었다.
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