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문제 정의
- 이에 저자 등은 중국에서 비방으로 전해 내려오는 한약 처방 중 지방간치료제로써 임상적으로 가장 많이 쓰이고는 있으나 학문적 근거가 약함을 인지하여 청간탕(淸肝湯)의 처방을 택하고 실험적으로 근거를 확립하기 위해 이 처방에 다른 약재들을 가감하여 가미청간탕(加味淸肝湯)을 조제하고 아울러 이전과는 다른 복용방법을 적용하여 알코올성 지방간에 미치는 영향을 측정하여 보고하고자 한다.
제안 방법
- 시약 및 기구 - 본 실험에 사용된 모든 시약 및 용매는 특급으로서 Sigma사 또는 Aldrich사의 시약을 사용하였고 s-GOT와 s-GPT활성 측정을 위해 kit(Asan Pharm. Co. Seoul. Korea)을 사용하였다. 기구로는 UV-spectrophotometer (Spectronics Corporation, Westbury, New York, U.
- 가미청간탕 투여 방법 - 흰쥐에 일주일 동안 30% ethanol 20ml/kg을 1일 1회씩 경구 투여하였고 8일째 되는 날부터 실험이 끝날 때까지 절식시키고 Scheme 1에 의거하여 8 일째의 22시와 9일째의 08시에 음성대조군에는 olive oil(1 ml/마리)만을, 양성대조군에 UDCA(10㎎/㎏)를 olive oil에 현탁시켜 각각 경구 투여하였고 양^대조군인 UDCA 투여군과 가미청간탕 투여군은 8일째 18, 20시와 9일째 06시에 각각 UDCA와 가미청간탕을 경구 투여하였다. Olive oil 의 투여목적은 완하제로 배설물의 배설을 촉진시키는데 있다.
- ) 변형시킨 방법으로 측정하였다. 간을 적출하여 chloroform 으로 추출한 후 saponification에 의해 생긴 glycerol를 산화시킨 다음 chromotropic acid(4, 5-dihyroxy-naphthalene-2, 7- disulfonic acid)를 가해 570nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 간조직 중 Cholesterol 의 함량 측정 - 간조직 중 Cholesterol 함량은 Zlatis와 Zak의 방법12)을 변형하여 측정하였다. 간을 적출하여 chloroform과 methanol(2:1)로 주출한 후 o-phthalaldehyde를 가하고 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- method(3)를 이용하여 측정하였다. 간을 적줄하여 homogenate를 만든 후 원심분리 하여 NADPH 용액과 5, 5'- dithio-bis(20nitrobenzoic acid)용액을 가하고 상온에서 4분 간 방치한 후 412nm에서 약 2분간 흡광도의 변화를 측정하였다.
- 혈중 Transminase 활성 측정 - 실험 10일 째 되는 날에 각 군의 흰쥐를 ether로 마취하여 심장으로부터 혈액을 채취하고 1500rpm에서 15분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 혈청 transaminase의 측정은 Reitman-Frankel 법을 사용하였고, 이를 위해 s-GOT, s-GPT 측정용 kit을 사용하였다.
- 간을 적출하여 chloroform과 methanol(2:1)로 주출한 후 o-phthalaldehyde를 가하고 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.
대상 데이터
- 실험재료 - 인삼(Ginseng Radix), 시호(Bupleuri Radix), 황금(Scutellariae Radix), 반하(Pinelliae Tuber), 인진호 (Artemisiae capillaris Herba), 치자(Gardeniae Fructus), 건강 (Zingiberis Rhizoma), 산조인 (Zizyphi Fructus) 및 감초 (Glycyrrhizae Radix) 등을 서울 경동시장에서 구입하여 생약을 일정 비율로 조합하고 열수 추출하여 가미청간탕을 조제하였다. 표본은 삼육대학교 생약학 교실에 보관하였다(표본번호 가미청간탕-01-001).
- 실험동물 - 흰쥐는 Sprague-Dawley계의 체중 200 ± 20 g의 수컷을 대한실험동물(주)에서 구입하여 사용하였다. 실험동물은 온도 22 ± 2℃, 습도 60 ± 5%에서 사육하여 1주일동안 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
- Korea)을 사용하였다. 기구로는 UV-spectrophotometer (Spectronics Corporation, Westbury, New York, U.S.A.; Spectroline R, Model Cm-10, Fluorescence Analysis Cabinet) 및 Centrifuge (Sigma. 1-15) 등을 사용하였다.
데이터처리
- 통계 처리 - 모든 data는 mean ± standard error mean (S.E.)나 percentage로 나타내었으며 유의성 검정을 위해 Anova test를 실시하였고 정상군 혹은 다른 군과의 비교를 위해 Neuman-Keuls test를 실시 하였고 p < 0.05 수준이하에서 유의성 검정을 실시하였다.
이론/모형
- 간조직 중 Triglyceride의 함량 측정 - 간조직 중 triglyceride 함량은 Van Handel과 Zilversmit의 방법10)을 Butler 등이11) 변형시킨 방법으로 측정하였다. 간을 적출하여 chloroform 으로 추출한 후 saponification에 의해 생긴 glycerol를 산화시킨 다음 chromotropic acid(4, 5-dihyroxy-naphthalene-2, 7- disulfonic acid)를 가해 570nm에서 흡광도를 측정하였다.
- Glutathione의 활성 측정 - Glutathionee enzymatic recycling method(3)를 이용하여 측정하였다. 간을 적줄하여 homogenate를 만든 후 원심분리 하여 NADPH 용액과 5, 5'- dithio-bis(20nitrobenzoic acid)용액을 가하고 상온에서 4분 간 방치한 후 412nm에서 약 2분간 흡광도의 변화를 측정하였다.
- 간조직 중 Lipid peroxidation의 함량 측정 - 간조직 중 Lipid peroxidatione thiobarbituric acid법14)을 이용하여 즉정하였다. 간을 적출하여 간조직 1 g당 9배량의 1.
- 혈청 transaminase의 측정은 Reitman-Frankel 법을 사용하였고, 이를 위해 s-GOT, s-GPT 측정용 kit을 사용하였다.
성능/효과
- 함량 변화를 조사하여 Table Ⅰ에 나타내었다. 에탄올이 1 일 1회 1주일간 경구투여 되었을 때 간조직의 중성지방인 Triglyceride 함량을 대조군의 2배 가까운 41.77과 15.77로 유의성 있게 증가시킴으로 지방간 생성을 유발하는 것을 확인할 수 있었고 이는 알코올 대사에 의한 지방산 공급 과다 또는 acetyl Co A로부터 지방산의 합성 증가 또는 간세포 막의 손상으로 인한 triglyceride의 분비장애에 의해 야기된 것으로 추정된다지 Triglyceride의 함량이 가미청간탕 투여군에서 14.02로 유의성(p<0.01)있게 억제됨을 확인할 수있었고 또한 간조직의 cholesterol 값도 8.05로 유의성 있게 (p<0.01) 감소되었음을 확인할 수 있었다.
- 15) 아울러 지방의 과산화작용에 의해 생성되는 물질인 MDA는 triglyceride의 함량과 비례하는 것으로 알려져 있다. 알코올의 일주일 연속적인 투여로 인해서 알코올 투여군의 간조직중의 glutathion 함량이 3.41 로감소되었음을 확인할 수 있었다. 아울러 MDA의 함량은 343.
- 41 로감소되었음을 확인할 수 있었다. 아울러 MDA의 함량은 343.34로 증가되었음을 확인하였다. 반면 가미청간탕을 투여한 투여군의 간세포내의 이utathion 함량이 4.
- 01) 감소치를 나타내었다. 본 실험에서도 MDA 함량이 Triglyceride 함량과 비례하는 것을 확인할 수 있었다.
- 활성에 미치는 결과는 Table Ⅲ과 같다. 본 실험에서 유의성 있는 결과를 확인할 수는 없었지만 가미청간탕이 GOT와 GPT 수치를 저하시키는 경향이 있음을 확인하였다.
- 1. 가미청간탕이 에탄올 투여로 인한 triglyceride와 cholesterol level 상승을 모두 유의성 있게 억제함으로서 에탄올에 의한 지방간 생성에 대한 억제작용을 확인할 수 있었다.
- 2. 가미청간탕은 에탄올 투여로 인한 간 homogenate에서의 MDA 함량증가와 glutathione 함량저하에 유효하게 억제시키는 효과를 보였다.
- 3. 본 실험에서는 일주일간 에탄올 투여에 의해 혈청 중 GOT와 GPT 수치가 충분하게 증가하지 않았기 때문에 가미청간탕의 간보호 효과를 뚜렷하게 관찰할 수는 없었지만 혈청 중 GOT와 GPT 수치를 저하시키는 경향을 확인하였다. 따라서 본 실험에서 가미청간탕이 알콜성 지방간 생성을 억제하는 활성이 있는 새로운 생약복합 처방임을 확인할 수 있었으나 작용기전은 명확하지 않다.
- 본 실험에서는 일주일간 에탄올 투여에 의해 혈청 중 GOT와 GPT 수치가 충분하게 증가하지 않았기 때문에 가미청간탕의 간보호 효과를 뚜렷하게 관찰할 수는 없었지만 혈청 중 GOT와 GPT 수치를 저하시키는 경향을 확인하였다. 따라서 본 실험에서 가미청간탕이 알콜성 지방간 생성을 억제하는 활성이 있는 새로운 생약복합 처방임을 확인할 수 있었으나 작용기전은 명확하지 않다. 따라서 추후 작용 기전을 밝히는 연구가 지속되어야 할 것 같다.
- 34로 증가되었음을 확인하였다. 반면 가미청간탕을 투여한 투여군의 간세포내의 이utathion 함량이 4.91 로 UDCA 투여군의 3.75에 비해서 유의성 있는gO.Ol) 증가효과를 확인할 수 있었고 MDA측정치는 203.67로 Control 보다도 나은 유의성 있는(p<0.01) 감소치를 나타내었다. 본 실험에서도 MDA 함량이 Triglyceride 함량과 비례하는 것을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 따라서 본 실험에서 가미청간탕이 알콜성 지방간 생성을 억제하는 활성이 있는 새로운 생약복합 처방임을 확인할 수 있었으나 작용기전은 명확하지 않다. 따라서 추후 작용 기전을 밝히는 연구가 지속되어야 할 것 같다.
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