국내 한약재 시장에서 유통되고 있는 백출 건재약재의 기원을 판별하고자 해부형태적 특징과 종 특이적인 SCAR 마커 (SAjR2, SAmR1)를 적용한 실험 결과는 다음과 같다. 해부형태적 특징으로 A. japonica에서는 주피에 코르크층이 매우 발달하여 있었고, 코르크층 내부 또는 아래에 석세포대가 연속적으로 발달하고 있었다. 유실은 A. japonica에서 뿌리횡단면에 전체적으로 다수 분포하여 잘 발달하고 있었으며 피충부분과 잘 발달된 방사조직 내에서도 목섬유다발이 다수 관찰됐다. 또한 유세포 내의 침상 결정물도 A. macrocephala보다 많이 함유하고 있었다. 이러한 특징들을 종합한 결과, 국내 유통 국산 및 수입 백출은 모두 A. japonica의 해부형태적 특징을 따르고 있어 A. japonica로 동정되었다. 한편 RAPD clone으로부터 개발된 A. japonica 특이적인 SAjR2를 이용하여 PCR 한 결과 모든 샘플에서 600bp 크기의 한국백출 특이적인 밴드가 형성되었으며, A. macrocephala 특이적인 SAmR1을 이 용한 결과에서는 작물시험장에서 재배중인 A. macrocephala에서만 1200 bp크기의 특이적인 밴드가 형성되어, 시중에서 유통되고 있는 한국백출과 중국백출은 모두 A. japonica로 동정되었다. 결론적으로 해부형태적 특성과 SCAR 마커는 A. japonica와 A. macrocephala 기원식물의 동정과 유통 건재 약재를 판별하기에 유용한 방법이었다.
국내 한약재 시장에서 유통되고 있는 백출 건재약재의 기원을 판별하고자 해부형태적 특징과 종 특이적인 SCAR 마커 (SAjR2, SAmR1)를 적용한 실험 결과는 다음과 같다. 해부형태적 특징으로 A. japonica에서는 주피에 코르크층이 매우 발달하여 있었고, 코르크층 내부 또는 아래에 석세포대가 연속적으로 발달하고 있었다. 유실은 A. japonica에서 뿌리횡단면에 전체적으로 다수 분포하여 잘 발달하고 있었으며 피충부분과 잘 발달된 방사조직 내에서도 목섬유다발이 다수 관찰됐다. 또한 유세포 내의 침상 결정물도 A. macrocephala보다 많이 함유하고 있었다. 이러한 특징들을 종합한 결과, 국내 유통 국산 및 수입 백출은 모두 A. japonica의 해부형태적 특징을 따르고 있어 A. japonica로 동정되었다. 한편 RAPD clone으로부터 개발된 A. japonica 특이적인 SAjR2를 이용하여 PCR 한 결과 모든 샘플에서 600bp 크기의 한국백출 특이적인 밴드가 형성되었으며, A. macrocephala 특이적인 SAmR1을 이 용한 결과에서는 작물시험장에서 재배중인 A. macrocephala에서만 1200 bp크기의 특이적인 밴드가 형성되어, 시중에서 유통되고 있는 한국백출과 중국백출은 모두 A. japonica로 동정되었다. 결론적으로 해부형태적 특성과 SCAR 마커는 A. japonica와 A. macrocephala 기원식물의 동정과 유통 건재 약재를 판별하기에 유용한 방법이었다.
Finding a means to discriminate the commercial herb medicines when they were dried and sliced is a very important and imminent project in Korea. To differentiate plant origins and the commercial herb medicines of Atractylodes japonica and A. macrocephala, two discriminative methods using anatomical ...
Finding a means to discriminate the commercial herb medicines when they were dried and sliced is a very important and imminent project in Korea. To differentiate plant origins and the commercial herb medicines of Atractylodes japonica and A. macrocephala, two discriminative methods using anatomical characteristics and SCAR marker were applied. It was possible to discriminate plant origins and the commercial herb medicines between A. japonica and A. macrocephala by anatomical characteristics: development of periderm, layer of stone cell, distribution of laticiferous vessels, development of xylem fiber in xylem ray, contained quantity of clustered crystals and others. While, two SCAR markers were developed from RAPD clones: SAjR2 (600 bp) from AjR2 and SAmR1 (1,200 bp) from AmR1. These two markers were enough for discrimination plant origins and the commercial herb medicines between A. japonica and A. macrocephala. The result of application of anatomical characteristics and SCAR markers to investigate current status in domestic herb market, Daegu and Kumsan herb market, it was identified to be current herb medicines of A japonica.
Finding a means to discriminate the commercial herb medicines when they were dried and sliced is a very important and imminent project in Korea. To differentiate plant origins and the commercial herb medicines of Atractylodes japonica and A. macrocephala, two discriminative methods using anatomical characteristics and SCAR marker were applied. It was possible to discriminate plant origins and the commercial herb medicines between A. japonica and A. macrocephala by anatomical characteristics: development of periderm, layer of stone cell, distribution of laticiferous vessels, development of xylem fiber in xylem ray, contained quantity of clustered crystals and others. While, two SCAR markers were developed from RAPD clones: SAjR2 (600 bp) from AjR2 and SAmR1 (1,200 bp) from AmR1. These two markers were enough for discrimination plant origins and the commercial herb medicines between A. japonica and A. macrocephala. The result of application of anatomical characteristics and SCAR markers to investigate current status in domestic herb market, Daegu and Kumsan herb market, it was identified to be current herb medicines of A japonica.
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문제 정의
RAPD 방법으로부터 개발된 SCAR 마커를 실제 응용하기 위하여, 충남 금산과 경북 대구의 한약재 시장에서 한국백출과 중국 백출로 명명되어 유통되고 있는 한약재의 기원을 판별하고자 실험한 결과는 다음과 같다. 600 bp 크기의 .
국내 한약재 시장에서 유통되고 있는 백출 건재약재의 기원을 판별하고자 해부 형 태적 특징과 종특이 적인 SCAR 마커 {SAjR2, SAmRl)를 적용한 실험 결과는 다음과 같다.
식물학적 특성으로는 잎의 모양이나 꽃의 색깔, 꽃의 크기 및 근경의 형태로 종간의 구별이 가능하지만 이용부위인 근 경은 건조 과정을 거쳐 얇게 썰어 유통이 되면 구별이 어렵다. 따라서 본 연구에서는 RAPD clone으로부터 개발된 A. japonica와 A. macrocephala의 특이적인 SCAR 마커와 해부 형태적 특성을 이용하여 시중에 유통 중인 건조된 약재를 무작위로 수집하여 두 종간의 식별이 가능한지를 확인코자 하였다.
제안 방법
macrocephala의 기원식물과 시중 유통 건재약재 DNA는 QIAGEN DNeasy Plant Kit의 실험방법에 준하여 추출하였다 (Dellaporta, 1983； Doyle & Doyle, 1987). DNA 함량을 측정하기 위하여 ziDNA를 Hind로 처리한 DNA 단편을 기준으로 1.0%의 아가로스 겔상에서 전기 영동한 밴드의 강도를 비교하여 정량하였고, 각 DNA는 5 ng/로 희석하였으며, DNA의 농도는 3회 반복 측정하여 그 평균값으로 DNA의 양을 정하였다
SCAR 마커를 개발하기 위하여 우선 A. japonica와 A. macrocephala를 판별하기에 유용한 OPERON primer (OPA11, OPBODt 선발하였고, 이들 primer를 이용하여 PCR을 한 후 1.0% 아가로스겔에 전기영동하여 목적하는 DNA의 다 형성을 재확인하였다. 그 후종 특이적인 DNA 밴드를 오려내어, Geneclean D kit를 이용하여 아가로스 겔에서 target DNA를 회수하였으며, 회수된 DNA는 pGEM-vector로 ligation 시킨 후 E.
2 cm의 것을 선택하여 사용하였고, 건재약재는 상온에서 3시간 물에 불려서 각각 5 mm 길이로 잘라 사용하였다. 각 시료는 Freezing Microtom (Leica CM3050)을 이용하여 8~ 12의 두께로 절편을 만들었으며, 만들어진 절편은 50~ 100% alcohol로 탈수 과정을 거쳐 1% safranin으로 염색하고 Canada balsam으로 봉입하여 영구 프레파라트를 제작하였다. 조직은 광학현미경을 이용하여 관찰, 측정 및 사진촬영을 하였다.
0% 아가로스겔에 전기영동하여 목적하는 DNA의 다 형성을 재확인하였다. 그 후종 특이적인 DNA 밴드를 오려내어, Geneclean D kit를 이용하여 아가로스 겔에서 target DNA를 회수하였으며, 회수된 DNA는 pGEM-vector로 ligation 시킨 후 E. coli DH5 (Sambrook et al., 1989)에 transformation 시켰다. 성공적으로 transformation된 colony는 염기서열 분석을 수행 하였다.
본 시험에서 A japonica와 A. macrocephala의 기원을 구분하기 위하여 RAPD 분석을 수행한 결과, 다 형성을 나타내는 다양한 DNA 밴드들을 얻을 수 있었으며 이 밴드들을 cloning, sequencing 하여 두 개의 종특이적인 SCAR primer (SAjR2, SAmRl)^ 제작하였다.
, 1989)에 transformation 시켰다. 성공적으로 transformation된 colony는 염기서열 분석을 수행 하였다.
염기서열 분석은 automatic DNA sequencer (ABI377) 를 이 용하였으며, 분석된 염 기서열 데이터는 BLAST (Altshul et al., 1997)를 이용하여 기존에 알려진 유전자 염기서열과 유사성이 있는지를 확인하였다. 염기서열 분석을 통해 얻은 데이터를 바탕으로 새로운 primer들을 디자인하였으며 (표2), 이primer를 이용하여 시중에 유통 중인 한국백출 (A japonica)과 중국 백출 (A.
, 1997)를 이용하여 기존에 알려진 유전자 염기서열과 유사성이 있는지를 확인하였다. 염기서열 분석을 통해 얻은 데이터를 바탕으로 새로운 primer들을 디자인하였으며 (표2), 이primer를 이용하여 시중에 유통 중인 한국백출 (A japonica)과 중국 백출 (A.macrocephala)의 판별을 시도하였다.
각 시료는 Freezing Microtom (Leica CM3050)을 이용하여 8~ 12의 두께로 절편을 만들었으며, 만들어진 절편은 50~ 100% alcohol로 탈수 과정을 거쳐 1% safranin으로 염색하고 Canada balsam으로 봉입하여 영구 프레파라트를 제작하였다. 조직은 광학현미경을 이용하여 관찰, 측정 및 사진촬영을 하였다. 본 실험에 사용된 기원식물과 건재약재는 표본으로 제작되어 작물시험장 약용식물 표본실에 보존 하였다.
대상 데이터
기원식물의 뿌리와 건재약재는 직경 0.6~1.2 cm의 것을 선택하여 사용하였고, 건재약재는 상온에서 3시간 물에 불려서 각각 5 mm 길이로 잘라 사용하였다. 각 시료는 Freezing Microtom (Leica CM3050)을 이용하여 8~ 12의 두께로 절편을 만들었으며, 만들어진 절편은 50~ 100% alcohol로 탈수 과정을 거쳐 1% safranin으로 염색하고 Canada balsam으로 봉입하여 영구 프레파라트를 제작하였다.
조직은 광학현미경을 이용하여 관찰, 측정 및 사진촬영을 하였다. 본 실험에 사용된 기원식물과 건재약재는 표본으로 제작되어 작물시험장 약용식물 표본실에 보존 하였다.
시험 재료로는 충남 금산과 경북 대구의 한약재 유통시 장 6곳을 임의로 선정하여 한국백출과 중국 백출로 명명되어 유통되고 있는 건 재약재를 사용하였다 (표 1).
이론/모형
A japonica와 A. macrocephala의 기원식물과 시중 유통 건재약재 DNA는 QIAGEN DNeasy Plant Kit의 실험방법에 준하여 추출하였다 (Dellaporta, 1983； Doyle & Doyle, 1987). DNA 함량을 측정하기 위하여 ziDNA를 Hind로 처리한 DNA 단편을 기준으로 1.
성능/효과
A. japonica 특이적인 SCAR 마커SA/R2의 적정 PCR 조건을 탐색한 결과, 5 ng DNA, 5 pM primer, 0.5 unit Taq DNA Polymerase가 혼합된 총 20의 반응 혼합물로, DNA thermal cycler에서 최초 annealing 온도를 68℃를 시작으로 1℃씩 낮춰 10 cycle 동안 touch-down PCR을 수행하고, 최종적으로 94에서 30초 동안 denaturation, 58℃에서 1분 동안 annealing, 72℃에서 1분간 extension의 과정을 25 cycle 수행하였을 때 가장 양호한 밴드의 형성을 나타내었다. 한편 A.
600 bp 크기의 . japonica 특이적인 SAjR2를 이용하여 PCR한 결과 모든 샘플에서 밴드가 형성되었으며, 1200 bp 크기 의 A. macrocephala 특이적인 SAmRl을 이용한 결과에서는 작물 시험장에서 재배 중인 A. macrocepha/a에서만 밴드가 형성되 었다.
japonica에서는 피층부분과 잘 발달된 방사조직 내에서 목섬유 다발이 관찰되었고 유세포 내의 침상 결정물도 . macrocephala보다 많이 함유하고 있었다. 도관절의 길이와 직경은 A.
japonica에서 뿌리횡단 면에 전체적으로 다수 분포하여 잘 발달하고 있었으며 피층 부분과 잘 발달된 방사조직 내에서도 목섬유 다발이 다수 관찰됐다. 또한 유세포 내의 침상 결정물도 A. macrocephala보다 많이 함유하고 있었다. 이러한 특징들을 종합한 결과, 국내 유통국산 및 수입 백출은 모두 A.
japonica에서는 주피에 코르크층이 매우 발달하여 있었고, 코르크층 내부 또는 아래에 석세포대가 연속적으로 발달하고 있었다. 유실은 A. japonica에서 뿌리횡단 면에 전체적으로 다수 분포하여 잘 발달하고 있었으며 피층 부분과 잘 발달된 방사조직 내에서도 목섬유 다발이 다수 관찰됐다. 또한 유세포 내의 침상 결정물도 A.
이러한 특징들을 기호 （ⓐ~ⓝ）를 주어 유통되는 국산과 수입 （중국） 백출에 적용하여 관찰한 결과（표 3, 표 4）, 국내 유통국산 및 수입 백출은 모두 A japonica의 해부형 태적 특징을 따르고 있어. japonica로 동정되 었다.
macrocephala보다 많이 함유하고 있었다. 이러한 특징들을 종합한 결과, 국내 유통국산 및 수입 백출은 모두 A. japonica의 해부 형 태적 특징을 따르고 있어 A. japonica로 동정되 었다.
이상의 해부 형 태적 특징과 SCAR 마커를 이용한 약재판 별 결과를 종합하여 볼 때, 시중에서 유통되고 있는 한국백출과 중국 백출은 모두 A. japonica로 동정되었다. 이는 현행 국내에서 두 식물을 모두 백출로 사용한다는 규정에는 무리가 없겠다고 하겠으나 수입되는 중국산 백출의 기원식물이 중국인민공화국 약전 (國家藥典委員會, 2000)에 서 규정하는 A.
한편 RAPD clone으로부터 개발된 A. japonica 특이적 인 SAjR2를 이용하여 PCR 한 결과 모든 샘플에서 600 bp 크기의 한국백출특이적인 밴드가 형성되었으며, 4 macrocephala 특이적인 SAmRl을 이용한 결과에서는 작물시험장에서 재배 중인 A. macrocepha/a에서만 1200 bp 크기의 특이적인 밴드가 형성되어, 시중에서 유통되고 있는 한국백출과 중국 백출은 모두 A. japonica로 동정되었다. 결론적으로 해부 형태적 특성과 SCAR 마커는 .
한편 본 실험에서 해부 형태적 특성을 이용하여 백출두 기원식물을 비교 관찰한 결과, A. japonica에서는 주피에 코르크층이 매우 발달하여 있고, 코르크층 내부 또는 아래에 석세포대가 연속적으로 발달하고 있었다. 이에 반해 A macrocephala는 코르크층이 빈약하며 석세포가 코르크층 아래에서 거의 관찰되지 않았으며, 간혹 관찰되는 석세포는 연속적이지 않았다.
후속연구
결론적으로 해부 특성과 SCAR 마커는 A. japonica와 A. macrocephala 기원식물과 유통건재 약재를 판별하기에 유용한 방법으로 사료되지만, 동종의 약용작물을 재배지역을 달리하였을 때 이것의 원산지를 판별할 수 있는 방법은 아직 없는 실정이므로 이것을 해결하기 위한 새로운 방법이 개발되어져야 할 것으로 생각된다.
참고문헌 (16)
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