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문제 정의
- 퀘르세틴을 경피흡수제제로 설계하기 위해서는 퀘르세틴의 높은 용해성과 피부 피부투과성을 나타내는 용제의 검색이 필요하다. 따라서 본 연구에서는 경피흡수제제 설계를 위한 기초연구로서 난용성인 퀘르세틴을 가용화시키고자 여러 종류의 비수성 용제에서의 용해 특성을 조사함과 동시에 수성 및 비수성 용제 중에서의 퀘르세틴의 안정성을 검토하고 항산화제를 이용하여 그 안정화를 도모하고자 하였다.
제안 방법
- 진탕 후 용액을 에펜도르프 튜브에 옮겨 7500rpm에서 5분간 원심분리한 후 상징액 100μl 취하여 70% 메탄올로 희석하였다. 공용제 중에서의 용해도 측정은 바이알에 공용제를 각각 1 ml씩 넣고 항산화제로 BHA를 0.1%의 농도가 되도록 넣어 녹인 후 단일용제와 같은 방법으로 24시간 동안 진탕하였다. 이 액을 에펜도르프 튜브에 옮겨 7,500 rpm에서 5분간 원심분리한 후 상징액 100 μl를 취하여 70% 메탄올(항산화제로 EDTA 0.
- 1% 함유)로 적절히 희석하였다. 각 희석액 100 μl에 내부표준액(20 μg/ml 루틴의 70% 메탄올 용액) 100 μl를 넣어 섞고 그 20μl를 HPLC에 주입하여 얻은 크로마토그램으로부터 내부표준물질에 대한 퀘르세틴의 피크면적비를 구하였다. 따로 퀘르세틴 표준액 (10μg/ml) 100 μl에 내부표준액 100μl를 넣어 섞은 액을 주입하여 얻은 피크면적비를 구하고 검액의 피크면적비와 비교하여 용해량을 산출하였다.
- 각 희석액 100 μl에 내부표준액(20 μg/ml 루틴의 70% 메탄올 용액) 100 μl를 넣어 섞고 그 20μl를 HPLC에 주입하여 얻은 크로마토그램으로부터 내부표준물질에 대한 퀘르세틴의 피크면적비를 구하였다. 따로 퀘르세틴 표준액 (10μg/ml) 100 μl에 내부표준액 100μl를 넣어 섞은 액을 주입하여 얻은 피크면적비를 구하고 검액의 피크면적비와 비교하여 용해량을 산출하였다.
- 단일 용제로서 DGME 및 PGMC 각각에 퀘르세틴을 녹여 200μg/ml로 하고 따로 이들 용제에 단일 안정화제로 BHT, ED1A를 0.2%되게 한 용액과 혼합 항산화제로 0.2%의 BHT, 구연산에 각각 ED1A를 0.1%가 되도록 추가한 혼합액을 사용하여 각 항산화제 용액 1.5 ml를 퀘르세틴 용액(200μg/ml) 1.5 ml와 섞고 밀전하였으며 항산화제를 넣지 않은 것을 대조로 하였다. 각각을 4, 30 및 45℃에서 보존하면서 6, 10, 15일째에 0.
- 5 ml와 섞고 밀전하였으며 항산화제를 넣지 않은 것을 대조로 하였다. 각각을 4, 30 및 45℃에서 보존하면서 6, 10, 15일째에 0.1 ml씩 취하여 70% 메탄올(항산화제로 EDTA 0.1%와 아스코르빈산 0.1% 함유)로 희석하고 희석액 100μl에 내부표준액 100μl를 넣어 섞고 그 20μl를 HPLC에 주입하여 얻은 크로마토그램의 피크면적비로부터 표준액의 그것과 비교하여 잔존 퀘르세틴 양을 산츨하였다.
- 1 %로 넣어 녹인 것을 사용하였다. 항산화제를 첨가한 각각의 공용제용액 1.5 ml를 PEG 400·생리식염수 혼합액(4: 6, v/v) 및 DGME·PGMC 혼합액 (2 : 8, v/v) 각각에 퀘르세틴을 녹여 각각 100 및 1000μg/ml가 되게 한 용액 1.5 ml와 섞고 밀전하였으며 항산화제를 넣지 않은 것을 대조로 하였다. 45℃에 보존하면서 경시적으로 100)11씩을 취하여 상기의 70% 메탄올로 각각 10 및 100배 희석한 후 단일 용제와 같은 방법으로 잔존 퀘르세틴의 양을 구하였다.
- 5 ml와 섞고 밀전하였으며 항산화제를 넣지 않은 것을 대조로 하였다. 45℃에 보존하면서 경시적으로 100)11씩을 취하여 상기의 70% 메탄올로 각각 10 및 100배 희석한 후 단일 용제와 같은 방법으로 잔존 퀘르세틴의 양을 구하였다.
- 따로 PGMC17,18)에 DGME를 첨가하여 공용제를 제조하였다. 이들 두 계열의 공용제 중에서의 퀘르세틴 용해도는 Table Ⅱ에서 보는 바와 같이 PGL 또는 PGMC중 DGME의 첨가비율이 증가할수록 퀘르세틴의 용해성이 현저히 증가되었다.
- 수성 용제인 물에는 퀘르세틴이 거의 녹지 않으므로 이의 용해성을 확보하고자 난용성 약물의 피부투과시험시 receptor액의 하나로 쓰이는 PEG 400의 생리식염수액 (4: 6, V/v)15,17,18)을 사용하고, 이 용제 중 퀘르세틴(100μg/ml)의 분해에 미치는 항산화제류의 영향을 검토하였다. 그 결과를 Table Ⅲ에 나타내었다.
- 따라서 항산화제 단독으로 그 효과가 높게 나타난 아스코르빈산, 구연산 및 아황산수소나트륨을 함유한 용액에 EDTA를 각각 0.1%씩 추가하여 퀘르세틴의 경시적인 잔존률을 측정하여 그 결과를 Table Ⅲ에 나타내었다. 항산화제를 함유하지 않은 경우에는 14일 후 7.
- 비수성 용제로 PGMC와 DGME를 선택하여 이들 용제에 퀘르세틴을 녹여 100μg/ml의 농도로 하고 4, 30 및 45℃에 보존하면서 경시적인 잔존률을 측정하였다. 그 결과를 Table Ⅳ에 나타내었다.
- 이는 공용제의 제조시 공기(산소)의 혼입이 증가하였기 때문으로 생각된다. 이 공용제 중 퀘르세틴의 분해를 억제시키기 위하여 항산화제로 BHT, BHA, α-토코페롤, 아스코르빈산, 구연산, 아황산수소나트륨 등을 첨가하여 경시적인 잔존률을 측정하였다. 그 결과 아황산수소나트륨은 오히려 분해를 촉진시켰으나 다른 항산화제들은 다소의 안정화 효과가 있었다.
대상 데이터
- (USA)에서 구입하였다. 용제로는 미리스틴산이소프로필(IPM, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), 프로필렌글리 콜모노라우레이트(PGML, Lauroglycol® 90), 프로필렌글리콜라우레이트(PGL, Lauroglycol® FCC), 프로필렌글리콜모노카프릴레이트(PGMC, Capryol® 90), 디에칠렌글리콜모노에칠에텔(DGME, Transcutol® P), 올레오일마크로골-6 글리세리드(LBF 1944, Labrafil® M 1944 CS), 리놀레오일마크로골-6 글리세리드(LBF 2125, Labrafil® M 2125 CS), 폴리에칠렌글리콜-8 글리세릴리놀리에이트(LBF 2609, Labrafil® WL 2609 BS), 카프릴로카프로일마크로골-6 글리세리드(LBS, Labrasol®) (Gattefosse Korea, Seoul, Korea), 시약 1급인 올레일알코올과 폴리에칠렌글리콜 400 (PEG 400) 등을 사용하였다. 메탄올은 HPLC급을 사용하였다.
- Louis, MO, USA), 프로필렌글리 콜모노라우레이트(PGML, Lauroglycol® 90), 프로필렌글리콜라우레이트(PGL, Lauroglycol® FCC), 프로필렌글리콜모노카프릴레이트(PGMC, Capryol® 90), 디에칠렌글리콜모노에칠에텔(DGME, Transcutol® P), 올레오일마크로골-6 글리세리드(LBF 1944, Labrafil® M 1944 CS), 리놀레오일마크로골-6 글리세리드(LBF 2125, Labrafil® M 2125 CS), 폴리에칠렌글리콜-8 글리세릴리놀리에이트(LBF 2609, Labrafil® WL 2609 BS), 카프릴로카프로일마크로골-6 글리세리드(LBS, Labrasol®) (Gattefosse Korea, Seoul, Korea), 시약 1급인 올레일알코올과 폴리에칠렌글리콜 400 (PEG 400) 등을 사용하였다. 메탄올은 HPLC급을 사용하였다.
- 액체크로마토그래프(HPLC, SLC-100 Intelligent pump, 검출기로 Perkin-Elmer LC 90 UV detector 및 기록장치로 Varian model 4290 integrator 장착), 항온진탕수욕장치(Karl Kolb model 171 - 100, Germany, 정밀도 0.2℃) 등을 사용하였다.
- 공용제의 경우에는 단일 항산화제로 EDTA, BHT, BHA, α-토코페롤, 구연산, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨을 넣어 녹여 0.1%로 하고, 혼합 항산화제로는 0.1% 구연산, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨 용액 각각에 ED1A를 0.1 %로 넣어 녹인 것을 사용하였다. 항산화제를 첨가한 각각의 공용제용액 1.
성능/효과
- Chun 등13)은 물에 매우 난용성인 퀘르세틴의 수용액에서의 가용화에 β-시클로덱스트린 설포부틸에텔, 히드록시프로필 -β-시클로덱스트린과 같은 수식화된 시클로덱스트린이 효과적이었고 크로스포비돈이나 비이온성 계면활성제 등의 첨가로 용해성을 향상시킬 수 있었다고 보고하였다. 또한 PEG 및 DGME와 물과의 공용제에서는 용제의 비율을 증가시킬수록 퀘르세틴을 고농도로 녹일 수 있었지만, 2% 이상 용액을 만드는 데에는 이들 비수성 용제의 비율이 60% 이상이 되어야 하는 것으로 나타났다. 퀘르세틴을 경피흡수제제로 설계하기 위해서는 퀘르세틴의 높은 용해성과 피부 피부투과성을 나타내는 용제의 검색이 필요하다.
- 따로 PGMC17,18)에 DGME를 첨가하여 공용제를 제조하였다. 이들 두 계열의 공용제 중에서의 퀘르세틴 용해도는 Table Ⅱ에서 보는 바와 같이 PGL 또는 PGMC중 DGME의 첨가비율이 증가할수록 퀘르세틴의 용해성이 현저히 증가되었다. 두 공용제 간의 비교에서는 PGL-DGME 공용제가 PGMC-DGME 공용제보다 퀘르세틴에 대한 용해력이 우수하였다.
- 이들 두 계열의 공용제 중에서의 퀘르세틴 용해도는 Table Ⅱ에서 보는 바와 같이 PGL 또는 PGMC중 DGME의 첨가비율이 증가할수록 퀘르세틴의 용해성이 현저히 증가되었다. 두 공용제 간의 비교에서는 PGL-DGME 공용제가 PGMC-DGME 공용제보다 퀘르세틴에 대한 용해력이 우수하였다. 한편, PGL-DGME 공용제에서 루틴의 용해성은 퀘르세틴보다 낮았다(Figure 1).
- 이는 용액 및 대기 중 산소에 의해 산화되는 것으로 생각된다. 그러나 수종의 항산화제를 각각 0.1 %의 농도로 첨가하였을 때 상당한 산화억제효과가 얻어졌으며 그 안정화효과는 EDTA> 아스코르빈산 > 아황산수소나트륨 > 구연산 > BHA의 순서로 나타났고, α-토코페롤, BHA 및 BHT는 별다른 안정화 효과가 관찰되지 않았다.
- 이는 EDTA가 산화반응을 촉매하는 미량의 금속 이온을 고정함므로써 산화분해를 억제하는 효과가 있는 것으로 생각되었다. 더욱 아스코르빈산과 EDTA를 병용함으로써 퀘르세틴을 95.8%로 잔존시킬 수 있었는데 이러한 안정화의 상승효과는 직접적으로 산소에 의한 산화를 차단하는 작용과 금속이온의 촉매작용을 차단함으로써 얻어진다고 해석되었다. 그러나 구연산 또는 아황산수소나트륨에서는 EDTA의 병용에 의한 상승적인 안정화 효과는 없었다.
- 1. 비수성 용제 중 퀘르세틴의 용해성은 DGME(291 mg/ml) > Labrasol > LBF 2609 > PGMC > PGL > LBF 2515 > LBF 1944 > PGML > oleyl alcohol >IPM의 순이었다. 용해력이 낮은 PGL이나 PGMC의 경우 DGME를 첨가한 공용제를 사용함으로써 퀘르세틴의 용해성을 현저히 향상시킬 수 있었다.
- 2. 퀘르세틴은 PEG 400의 생리식염액(4:6, v/v)에서 매우 빠르게 산화분해되었으나 항산화제를 첨가함으로써 안정성을 현저히 향상시킬 수 있었다. 항산화제에 따른 분해억제 효과의 크기는 EDTA > 아스코르빈산 > 아황산수소나트륨 > 구연산 >BHA의 순이었으며 아스코르빈산-EDTA의 혼합 항산화제는 퀘르세틴의 분해를 현저히 억제시켰다.
- 퀘르세틴은 PEG 400의 생리식염액(4:6, v/v)에서 매우 빠르게 산화분해되었으나 항산화제를 첨가함으로써 안정성을 현저히 향상시킬 수 있었다. 항산화제에 따른 분해억제 효과의 크기는 EDTA > 아스코르빈산 > 아황산수소나트륨 > 구연산 >BHA의 순이었으며 아스코르빈산-EDTA의 혼합 항산화제는 퀘르세틴의 분해를 현저히 억제시켰다.
- 3. PGMC 및 DGME와 같은 비수성 용제에서도 퀘르세틴의 산화분해가 빠르게 일어났으며 DGME에서의 분해속도는 PGMC에서보다 약간 느렸고 PGMC-DGME 공용제에서는 보다 빠르게 분해되었다. EDTA, BHT 단독 또는 구연산-EDTA의 혼합 항산화제는 비수성 용제에서 퀘르세틴의 분해를 지연시켰다.
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