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문제 정의
- 이에 저자는 치자엑스 중 주성분인 geniposide를 가수분해효소로써 genipin으로 전환하여 지용성을 증가시킴으로써 피부투과를 촉진시키고 항염효과를 높이기 위하여, 치자엑스를 β-glucosidase를 사용하여 가수분해 시키고 이를 emulsion으로 제조한 다음 이 가수분해물의 분리동정 실험, 피부투과 실험, 항염효과 등을 비교관찰 함으로써 소염치료효과를 높일 수 있는 경피흡수 제제개발을 위한 연구에 착수하였으며 그 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- Carrageenan 용액을 랫트의 뒤쪽 발바닥에 주시-한 후 대조군은 아무런 처치를 하지 아니하였고 실험군에서는 각각 제조된 GEX 및 GHP emulsion을 1 g씩 도포하였다.
- GEX 0.5 g을 증류수 70mL에 넣어 흔들어주고, 글리세린과 프로필렌글리콜을 각각 3.0 g씩 가하고 균일하게 혼합한 다음 CMC-Na 0.5 g 가하여 수상으로 하였고, 따로 linoleic acid 20.0 g에 Tween 80 2.0 g 및 Span 20 1.0 g을 가하고(HLB 14.55) 혼합하여 유상으로 하였다. 수상에 유상을 소량씩 가하면서 균등히 혼합하여 emulsion을 제조 하였으며, GHP emulsion의 제조는 같은 방법으로 GEX 대신 GHP를 가하여 제조하였다(Table Ⅰ).
- GEX 및 GHP emulsion에 함유되어 있는 geniposide 및 genipin의 피부 투과량을 측정하기 위하여 무모마우스 및 Franz 형 확산셀 (area : 1.77 cm2, effective vol. : 12 ml)을 이용하였다. 무모마우스는 등피부를 직경 2.
- 부종생성을 위하여 1% ?i-carrageenan(Iype Ⅳ.) 용액 0.1 ml를 대조군과 실험군 랫트의 발바닥에 주사하고 1.5, 3, 6, 9, 12, 24, 48 및 72시간 후에 족부종측정기를 사용하여 족용적을 측정하고 다음의 식을 이용하여 족부종률(% swelling)과 족부종억제율(% inhibition)을 산출하였다.
- 9x300 mm를 사용하였고, 이동상으로는 아세토니트릴:물 (15 : 85 v/v%)의 혼액을 사용하였다. 검출기는 UV detector로, 파장은 240 nm, 유속은 1.2ml/min이었고, 얻어진 chromatogram의 면적을 측정하여 계산하였다.
- 온도에 따른 영향을 관찰하기 위하여 β-glucosidase를 1,000 ㎍/ml로 고정하고 37 및 50℃에서 가수분해율을 측정한 결과 37℃에서는 3시간 후에 약 80%의 가수분해율을 나타내었고, 5VC의 경우에는 2시간 후에 98% 이상의 가수분해율을 보여주었다(Figure 3). 따라서 본 실험에서는 GHP를 제조할 때 50℃의 반응 조건에서 1,000 ㎍/ml 농도의 |3-이ucosidase를 이용하여 GEX를 가수분해 시킨 후 emulsion을 제조하였다. GEX 100 mg을 물 90mL에 녹이고 p-glucosidase 용액 (1,000 ㎍/ml) 10mZ를 넣고 50℃에서 120분 동안 방치하여 가수분해 한 후 geniposide와 genipin의 함량을 측정한 결과 geniposide의 함량은 1.
- 병리조직검사는 좌측 뒷 발바닥에 carrageenan 용액으로 염증을 유발 시킨 후 환부에 GEX 및 GHP emulsion을 도포시킨 다음 일정시간 후 좌측 대퇴부의 피부를 제거하고 대퇴이두근 (biceps fbmoris)과 근육주위의 결합조직 (connective tissue) 및 지방조직 (fat tissue)을 가능한 한 포함총}여 1.5 × 1.5 cm의 크기로 적출하였다. 적출 조직을 10% 중성 포르말린 용액에 고정시킨 후 4pm로 박절한 다음 hematoxylin 및 eosine solution을 사용하여 H&E stain 방법으로 염색 관찰하였다.
- 병리조직학적 소견은 모세혈관의 출혈 및 충혈과 염증세포의 침윤이 없는 경우를 음성반응으로 판정하였고(-), 모세혈관의 출혈 빛 충혈, 염증세포의 침윤 정도에 따라서 양성반응을 slight to mild(+), moderate(++), severe(+++)로 등급화 하여 판정하였다.15)
- 55) 혼합하여 유상으로 하였다. 수상에 유상을 소량씩 가하면서 균등히 혼합하여 emulsion을 제조 하였으며, GHP emulsion의 제조는 같은 방법으로 GEX 대신 GHP를 가하여 제조하였다(Table Ⅰ).
- 5 cm의 크기로 적출하였다. 적출 조직을 10% 중성 포르말린 용액에 고정시킨 후 4pm로 박절한 다음 hematoxylin 및 eosine solution을 사용하여 H&E stain 방법으로 염색 관찰하였다.
- 치자 100 g< 조절로 하여 정제수 1000 mL를 넣고 100℃에서 1시간 가열한 후 여과하고 추출액을 감압농축 후 동결 건조하여 치자엑스분말 (이하 GEX)로 하였다. 치자가수분해물 (이하 GHP)의 제조는 치자엑스분말 일정량을 취해물에 현탁시키고 p-glucosidase* 농도별 (100, 250, 500, 1,000㎍/ml)로 첨가하여, 각각의 온도별 (2℃, 37℃, 50℃)로 GHP를 제조하였다.
- 치자 중에 함유되어 있는 geniposide 및 genipin의 확인, 정량을 위하여 HPLC 법 19)을 응용하였다. 고정상으로는 μ-Bondapak Ci8 3.
- 치자가수분해물 (이하 GHP)의 제조는 치자엑스분말 일정량을 취해물에 현탁시키고 p-glucosidase* 농도별 (100, 250, 500, 1,000㎍/ml)로 첨가하여, 각각의 온도별 (2℃, 37℃, 50℃)로 GHP를 제조하였다.
- 치자엑스 중 주성분을 ^-glucosidase로 가수분해하여 피부투과를 촉진하고 항염효과를 높이고자 치자엑스 및 그 가수분해물로써 emulsion제제를 제조한 후 피부투과도 측정, carrageenan 유발 부종억제실험 및 병리조직검사를 시행한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 피부의 단위 면적당 통과한 주성분의 양을 시간에 대한 함수로 나타낸 후 다음의 식을 이용하여 피부투과 파라메터들을 구하였다.14)
대상 데이터
- Hairless mouse (웅성, 25±5g, Charles River Lab., USA)와 S.D계 랫트(웅성, 200±20 g, 대한실험동물센터, Korea)를 분양 받아 사용하였다.
- 치자 중에 함유되어 있는 geniposide 및 genipin의 확인, 정량을 위하여 HPLC 법 19)을 응용하였다. 고정상으로는 μ-Bondapak Ci8 3.9x300 mm를 사용하였고, 이동상으로는 아세토니트릴:물 (15 : 85 v/v%)의 혼액을 사용하였다. 검출기는 UV detector로, 파장은 240 nm, 유속은 1.
- : 12 ml)을 이용하였다. 무모마우스는 등피부를 직경 2.0 cm로 절개하고 피하지방 및 모세 혈관을 조심스럽게 제거한 후 사용하였다. 시험액은 pH 7.
- 방법에 의하여 실험하였다. 수상용매로써는 0.1 M 인산염완충액 (pH 6.8)을 사용하였고 유상용매로는 n-octanol, n-hexane, benzene, chloroform, carbontetrachloride 등 5종을 사용하였다. Geniposide 및 genipin 표준품 10.
- 0 cm로 절개하고 피하지방 및 모세 혈관을 조심스럽게 제거한 후 사용하였다. 시험액은 pH 7.4 완충용액 (10% propylene glycol 함유)을 사용하였다. Franz 형 확산셀에 무모마우스 피부를 장착하고 emulsion시료를 도포한 후 각 시간마다 시험액에서 100㎕ 씩을 채취하고 새로운 시험액을 동량 보충하였다.
-
Carrageenan 유발 족부종 억제실험
실험동물로서 체중 200 ± 20 g의 Sig] 랫트를 사용하여 실험하였다. 부종생성을 위하여 1% ?i-carrageenan(Iype Ⅳ.
- 치자(Gardeniae Fructus)는 시중에서 구입하여 사용하였고 geniposide(Sigma Chem. Co., U.S.A), genipin (Wako Chem. Co., Japan) 및 P-glucosidase (Sigma Chem. Co., U.S.A)는 표준품을 사용하였으며 기타 시약은 특급 시약을 사용하였다.
이론/모형
- Geniposide 및 genipin의 유수 분배계수 실험은 Higuchi 등20)의 방법에 의하여 실험하였다. 수상용매로써는 0.
성능/효과
- 1) 치자의 전제 및 에탄올 엑스는 다양한 실험동물에 경구 및 복강투여 할 때 혈압강하 작용을 나타내며 위액분비 억제 효과도 보고되어 왔다.2)주성분으로는 iridoid glycoside인 geniposide와 gardenosidei 비롯하여 crocin, genipiodisic acid, shanzhiside, genipin 등을 함유하고 있다.3) Han Carrageenan 유발 족부종억제 실험에서 엑스제제 및 가수분해물제제 모두 대조군에 비하여 우수한 부종억제 효과를 보였으나, 가수분해물 제제가 엑스제제에 비하여 더 좋은 성적을 보여주었고, 염증의 조직학적 소견에서도 족부종억제율과 유사한 효과를 나타내었다. 이상의 실험결과 치자엑스를 β-glucosidase로 가수분해하여 투여할 경우 배당체인 geniposide가 지용성이 높은 genipin으로 전환되어 피부투과도를 촉진시키고 항염효과를 증가시킬 수 있을 것으로 사료된다.
- Carrageenan을 랫트의 뒤쪽 발바닥에 주입하여 랫트를 마취시키고 대퇴부를 절개한 후 저직의 변화를 관찰한 결과 대조군에서는 24시간 후에 모세혈관의 출혈과 충혈 및 염증세포의 침윤이 심한 경우가 83%로 나타났고, 염증세포로는 주로 호중성 백혈구의 침윤이 관찰되었으며, 48시간 후에는 심한 경우가 67%로 나타났고 염증세포로는 호중구가 감소하면서 림프구 및 단핵구 침윤이 관찰되었으며, 72시간 후에는 심한 경우가 33%로 나타났고 근섬유들 사이에 약간의 부종과 근외막(epimysium)의 결합조직 (connective tissue) 이증식(proliferation)되면서, 염증세포로는 호중구가 많이 감소하고 림프구 및 단핵구 침윤이 관찰되었다(Table VI, Figure 8, 9, 10). GEX emulsion 투여군 에서는 carrageenan 주입 후 24시간에서 모세혈관의 출혈과 충혈 및 염증세포의 침윤이 심한 경우가 67%로 나타났고, 염증세포로는 호중성 백혈구가 관찰되었으며, 48시간 후에는 심한 경우가 33%로 나타났고, 염증세포로는 호중성 백혈구가 감소하였고 림프구 및 단핵구 침윤이 관찰되었으며, 72시간 후에는 심한 경우가 나타나지 않았고, 염증세포로는 호중성 백혈구는 많이 감소하고 림프구 및 단핵구의 침윤이 관찰되었다(Table Ⅵ).
- 따라서 본 실험에서는 GHP를 제조할 때 50℃의 반응 조건에서 1,000 ㎍/ml 농도의 |3-이ucosidase를 이용하여 GEX를 가수분해 시킨 후 emulsion을 제조하였다. GEX 100 mg을 물 90mL에 녹이고 p-glucosidase 용액 (1,000 ㎍/ml) 10mZ를 넣고 50℃에서 120분 동안 방치하여 가수분해 한 후 geniposide와 genipin의 함량을 측정한 결과 geniposide의 함량은 1.2%에 불과하였고, genipin의 양은 18.7%로 증가함으로써 β-glucosidase 처리에 의해서 대부분의 geniposide가 genipin으로 전화되는것으로 확인되었다(Table II). Kim12) 등의 연구에서도 황금 중 주성분인 baicalin을 [3-glucosidase를 이용하여 baicalein으로 가수분해 시킨 결과 우수한 전환율을 나타내었다고 보고한 바 있다.
- 9, 10). GEX emulsion 투여군 에서는 carrageenan 주입 후 24시간에서 모세혈관의 출혈과 충혈 및 염증세포의 침윤이 심한 경우가 67%로 나타났고, 염증세포로는 호중성 백혈구가 관찰되었으며, 48시간 후에는 심한 경우가 33%로 나타났고, 염증세포로는 호중성 백혈구가 감소하였고 림프구 및 단핵구 침윤이 관찰되었으며, 72시간 후에는 심한 경우가 나타나지 않았고, 염증세포로는 호중성 백혈구는 많이 감소하고 림프구 및 단핵구의 침윤이 관찰되었다(Table Ⅵ). GHP emulsion 투여군에서는 carrageenan 주입 후 24시간에서 모세혈관의 출혈과 충혈 및 염증세포의 침윤이 심한 경우가 33%로 나타났고, 염증세포로는 근외막에서 중등도의 림프구 및 염증세포의 침윤이 관찰되었으며, 48시간 후에는 심한 경우가 나타나지 않았고, 염증세포로는 호중구가 감소되고 림프구 및 단핵구의 침윤이 증가되기 시작하였으며, 72시간 후에는 근외막예서 중등도의 염증세포의 침윤이 관찰푀었으나 호중성 백혈구는 많이 감소되고 림파구 및 단핵구의 증가가 뚜렷이 나타났다QWble VI, Figure 11, 12, 13).
- 35시간으로 나타났다 (Table Ⅴ). GEX 및 GHP를 emulsion으로 제제화 함으로써 단위시간당 피부투과율은 각각 236 및 302%로 크게 향상됨을 알 수 있었다.
- 7 분에 피크가 확인되었고, 가수분해물에서는 genipin의 피크가 나타남으로써, 두 성분의 동시 정량이 가능하였다. GEX 중 geniposide의 함량은 19.3%로써 비교적 높은 수치를 나타내었으나, 가수분해물은 genipine 0.8%로써 아주 낮은 수치를 보여주었다(Table Ⅱ).
- GEX 중에 함유되어 있는 geniposide를 β-glucosidase로써 가수분해 시키기 위하여 각 농도별로 5UC에서 180분 동안 반응시킨 결과, 10㎍/ml 농도에서 약 30%의 가수분해율을 나타내었고 250㎍/ml에서는 90%로 높아졌으며, 1000 ㎍/ml에서는 120분에서 99% 이상의 전환율을 보여주었다 (Figure 2). 온도에 따른 영향을 관찰하기 위하여 β-glucosidase를 1,000 ㎍/ml로 고정하고 37 및 50℃에서 가수분해율을 측정한 결과 37℃에서는 3시간 후에 약 80%의 가수분해율을 나타내었고, 5VC의 경우에는 2시간 후에 98% 이상의 가수분해율을 보여주었다(Figure 3).
- GEX와 GHP의 피부투과계수를 비교해보면 단위시간당 피부투과율이 GEX에서 11.13 ±1.67 [ig/cm2/hi인데 비하여 GHP에서는 13.32 ± 1.92 gg/cm2/hr£ 나타나 약 12% 증가되었고, lag timee 각각 1.03 및 0.기시간으로 나타났다 (Table Ⅳ). 한편 GEX 및 GHP emulsion 에서는 GEX의 단위 시간당 피부투과율이 26.
- GEX emulsion 투여군 에서는 carrageenan 주입 후 24시간에서 모세혈관의 출혈과 충혈 및 염증세포의 침윤이 심한 경우가 67%로 나타났고, 염증세포로는 호중성 백혈구가 관찰되었으며, 48시간 후에는 심한 경우가 33%로 나타났고, 염증세포로는 호중성 백혈구가 감소하였고 림프구 및 단핵구 침윤이 관찰되었으며, 72시간 후에는 심한 경우가 나타나지 않았고, 염증세포로는 호중성 백혈구는 많이 감소하고 림프구 및 단핵구의 침윤이 관찰되었다(Table Ⅵ). GHP emulsion 투여군에서는 carrageenan 주입 후 24시간에서 모세혈관의 출혈과 충혈 및 염증세포의 침윤이 심한 경우가 33%로 나타났고, 염증세포로는 근외막에서 중등도의 림프구 및 염증세포의 침윤이 관찰되었으며, 48시간 후에는 심한 경우가 나타나지 않았고, 염증세포로는 호중구가 감소되고 림프구 및 단핵구의 침윤이 증가되기 시작하였으며, 72시간 후에는 근외막예서 중등도의 염증세포의 침윤이 관찰푀었으나 호중성 백혈구는 많이 감소되고 림파구 및 단핵구의 증가가 뚜렷이 나타났다QWble VI, Figure 11, 12, 13). Carrageenan 유발 염증억제 실험에서 GEX 및 GHP emulsion 모두 부종을 억제하는 효과와 함께 빠른 조직 수복 양상을 나타냄으로써 우수한 항염효과를 기대할 수 있을 것으로 생각된다.
- Geniposide와 그 가수분해물인 genipin의 유수분배계수를 비교한 결과 n-octanol에서 geniposide는 0.13 ±0.01이었으나 genipine 4.59±0.45로 무려 35배로 증가하였으며, chloroform에서는 geniposide 0.07 ± 0.05 이었으나, genipine 0.64 ±0.10로서 9배 정도 증가하였다. n-octanole 생체막과 가장 유사한 용매로써 다른 용매에 비하여 n-octano과 친화력이 큰 것은 피부투과에 크게 작용할 것으로 기대된다(Table Ⅲ).
- 가수분해물인 genipine 배당체인 geniposide에 비하여 높은 피부투과율을 나타내었으며, 가수분해물을 함유한 emulsion 제제도 엑스제제에 비하여 피부 투과도가 증가하였다.
- 랫트 발바닥에 카라기난을 주사한 후 부종의 생성은 투여 3시간까지 급격히 증가하였으며, 24시간부터 72시간까지는 일정한 범위 내에서 유지되었는데 투여 24시간 후 대조군 에서는 2.98 mZ가 증가한 반면, GEX emulsion 에서는 2.14 ml, GHP emulsion 에서는 1.93 mZ로 현저하게 감소되었고, 투여 72시간 후에도 대조군에서는 2.82ml 증가를 유지하였는데, GEX emulsion에서는 1.89 m, , GHP emulsion에서는 1.66ml로 계속 감소되었다(Figure 6), 24시간 후의 족부종율과 부종억제율을 비교해보면, 대조군에서는 약 83%의 부종율을 나타낸 반면 GEX emulsion에서는 약 40%, GHP emulsion에서는 약 27%로 낮아졌으며, 이 수치를 근거로 하여 부종억제율을 비교해보면 GEX emulsion이 49.8%인 반면 GHP emulsion에서는 62.8%로 나타나 13% 정도 높은 성적을 보여주었다(Figure 7). 이 결과는 GEX 중 geniposide가 genipin으로 전환됨으로써 흡수가 증가된 경피 흡수실험 결과와 일치되며, Kim12) 등의 생약성분 중 가수분해로 인한 생체이용율 증가에 관한 논문내용과도 일치된다.
- 2). 온도에 따른 영향을 관찰하기 위하여 β-glucosidase를 1,000 ㎍/ml로 고정하고 37 및 50℃에서 가수분해율을 측정한 결과 37℃에서는 3시간 후에 약 80%의 가수분해율을 나타내었고, 5VC의 경우에는 2시간 후에 98% 이상의 가수분해율을 보여주었다(Figure 3). 따라서 본 실험에서는 GHP를 제조할 때 50℃의 반응 조건에서 1,000 ㎍/ml 농도의 |3-이ucosidase를 이용하여 GEX를 가수분해 시킨 후 emulsion을 제조하였다.
- 유사한 효과를 나타내었다. 이상의 실험결과 치자엑스를 β-glucosidase로 가수분해하여 투여할 경우 배당체인 geniposide가 지용성이 높은 genipin으로 전환되어 피부투과도를 촉진시키고 항염효과를 증가시킬 수 있을 것으로 사료된다.
- 치자의 주성분인 geniposide의 가수분해율은 β-glucosidase의 농도와 온도에 비례하여 증가하였으며, 5VC에서 양호한 가수분해율을 나타내었다.
- 피부투과실험은 GEX의 투과량을 geniposide의 양으로 측정하고, GHP는 genipin의 양으로 측정하였는데, 9시간 후 GEX 중 geniposide의 투과량은 89 ± 4.75 ㎍/cm2이었으나, GHP 중 genipin의 투과량은 109 ±4.63 (ig/cn?로 나타나 피부투과율이 약 20% 증가 되었으며, 이는 가수분해로 인하여 당이 제거되면서 지용성이 증가되었을 뿐 아니라 분자량 감소에 의한 확산계수의 증가에도 영향을 받았을 것으로 사료된다(Figure 4).
- 기시간으로 나타났다 (Table Ⅳ). 한편 GEX 및 GHP emulsion 에서는 GEX의 단위 시간당 피부투과율이 26.27±4.inLig/cm2/hr인 반면, GHP에서는 40.35 ± 5.04 gg/cm2/hre 나타나 약 53% 증가되었고, lag timee 각각 0.52 및 0.35시간으로 나타났다 (Table Ⅴ). GEX 및 GHP를 emulsion으로 제제화 함으로써 단위시간당 피부투과율은 각각 236 및 302%로 크게 향상됨을 알 수 있었다.
후속연구
- 또한 hesperidine과 narigine 진피에 다량 함유된 flavonone rhamnoglucoside로써 경구투여 시 대장균에 의하여 비당체로 전환됨으로써 유의한 항염증 작용을 나타내는 것으로 알려져 있다.12)치자 중에 함유되어 있는 배당체 성분인 geniposide도 비당체인 genipin&로 전환될 경우 지용성을 증가시켜 항염효과를 증가시킬 수 있을 것으로 기대된다.
- GHP emulsion 투여군에서는 carrageenan 주입 후 24시간에서 모세혈관의 출혈과 충혈 및 염증세포의 침윤이 심한 경우가 33%로 나타났고, 염증세포로는 근외막에서 중등도의 림프구 및 염증세포의 침윤이 관찰되었으며, 48시간 후에는 심한 경우가 나타나지 않았고, 염증세포로는 호중구가 감소되고 림프구 및 단핵구의 침윤이 증가되기 시작하였으며, 72시간 후에는 근외막예서 중등도의 염증세포의 침윤이 관찰푀었으나 호중성 백혈구는 많이 감소되고 림파구 및 단핵구의 증가가 뚜렷이 나타났다QWble VI, Figure 11, 12, 13). Carrageenan 유발 염증억제 실험에서 GEX 및 GHP emulsion 모두 부종을 억제하는 효과와 함께 빠른 조직 수복 양상을 나타냄으로써 우수한 항염효과를 기대할 수 있을 것으로 생각된다. 그중에서 GHP emulsion이 GEX emulsion에 비하여 염증 발현 후 회복 시간을 24시간 정도 단축시킴으로써 더 우수한 효과를 발휘할 수 있을 것으로 기대되며 이는 가수분해물인 genipin의 빠른 흡수로 인한 신속한 약효발현으로 사료된다
- Carrageenan 유발 염증억제 실험에서 GEX 및 GHP emulsion 모두 부종을 억제하는 효과와 함께 빠른 조직 수복 양상을 나타냄으로써 우수한 항염효과를 기대할 수 있을 것으로 생각된다. 그중에서 GHP emulsion이 GEX emulsion에 비하여 염증 발현 후 회복 시간을 24시간 정도 단축시킴으로써 더 우수한 효과를 발휘할 수 있을 것으로 기대되며 이는 가수분해물인 genipin의 빠른 흡수로 인한 신속한 약효발현으로 사료된다
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