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문제 정의
- 이들 효소는 각각 acetaldehyde와 acetate를 생성하며 acetate는 acetyl-Co A로 전환되어 TCA 회로를 거쳐 에너지를 발생하거나 또는 콜레스테롤과 지방산을 합성하는데 이용된다. 본 연구에는 무 추출물의 알콜해독에 미치는 영향을 규명하기 위해 알콜대사 산물인 &-NADH의 양을 측정하여 효소활성을 측정하였다. 즉 기질인 ethanol이 조효소 NAD의 존재 하에서 대사되면서 생성되는 NADH양을 340nm에서 흡광도를 측정하여 ADH 활성을 측정하였다.
- Melanin 생합성 과정에는 한가지 효소만이 유일하게 관여하므로 melanin 합성을 억제하는 방법으로 화장품 업계에서는 tyrosinase 저해제를 탐색하고 응용해 왔다. 본 연구에서는 melanin 색소의 생합성 과정에서 tyrosinase가 dopa를 기질로 하여 초기 반응의 주요 과정을 촉매한다는 점에 착안하여 그 효소 활성의 저해도를 측정하는 검정법을 사용하였다.
- 본 연구에서는 무(Raphciniise SmM/s)의 기능성 식품소재 및 각종 응용제품에 대한 탐색 연구로서 무에 대한 여러가지 생리활성 중 미백, 항균, 항산화, 숙취해소 기능에 대하여 조사하였다. 이들 생리활성을 정량적으로 분석하여 무를 이용한 각종 기능성 식품 또는 화장품으로의 개발 가능성을 검토하였다.
- 이런 부작용을 최소화하기 위하여 천연물을 이용하여 미백효과가 있는 성분을 개발하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 본 연구에서는 무의 미백기능을 tyrosinase 활성법에 기반하여 정량적인 분석을 하였다.
- 본 연구팀은 무의 생리활성 중 폐암 세포주에 대한 in vitro 항암활성을 보고한 바 있으며2)본 연구에서는 다른 생리활성에 대해 분석 조사하였다.
- 이들 생리활성을 정량적으로 분석하여 무를 이용한 각종 기능성 식품 또는 화장품으로의 개발 가능성을 검토하였다.
제안 방법
- 4m/)를 첨가하여 반응시킨 후 37℃에서 예열된 항온수조에서 30분간 진탕하고 ice bath에서 냉각시 켰다. 5 mM EDTA(ethylenediamine tetraacetic acid)(0.5 ml), 1% phosphonic acid(3 ml), 7% TBA (1 ml)를첨가하고 lOCTC에서 45분간 가열한 후 n-butanol 4ml를 가하여 3000rpm으로 10분간 원심분리하여 상등액을 취해 353 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 무 추출물 대신 증류수를 첨가하여 측정하였다.
- 2 m/씩 가하여 다시 상온에서 30분 방치한 후 750nm에서 흡광도를 측정하였다. Chlorogenic acid(l mg/ml)을 표준 물질로 사용하여 표준 곡선을 구하여 계산하였다.
- 무의 피부 미백 활성을 측정하기 위해 tyrosinase inhibition assay법을 이용하였다. Dopa oxidase의 활성측정은 L-dopa를 기질로 하여 tyrosinase에 의해 생산되는 반응산물인 dopachrome이 475 nm 에서 흡광도를 나타내는 점을 이용하여 시행하였다. 일정 반응 후에 생산된 dopachrome의 양을 475nm에서 측정함으로써 tyrosinase의 활성을 측정하되, 시료 첨가에 의해 효소 활성 저해 정도를 측정하였다.
- 항균 활성분석 (paper disc assay). E. coli KI 12와 B. subtilis ATCC 6633을 시험 균주로 하여 paper disc assay를 실시하였다. 우선 NA(nutrient agar: enzymatic digest of gelatin 5 g, beef extract 3 g, agar 15 g, per liter, pH 6.
- 그 위에 시료를 농도별(1, 5, 10, 15%)로 50μl씩 넣어 준 멸균된 paper disc를 얹고 3기에서 다시 하루 정도 배양하였다. Paper disc 주변에 투명환(이ear zone) 여부에 따라 항균활성을 판단하였다.
- 무 시료의 전처리. 건조된 무를 뿌리와 줄기 부분으로 나누어 실험하였다. 시료 10 g당 물과 에탄올을 각각 250 m/씩 혼합한 후 믹서기로 분쇄하였다.
- 무의 숙취 해소 활성을 측정하기 위해서 alcohol dehydrogenase activity assay 방법')을 이용하였다. 기질인 ethan이이 조효소 NAD의 존재 하에서 대사되면서 생성되는 NADH 양을 340 nm에서 흡광도를 측정하여 ADH 활성을 측정하였다. 우선 50 mM sodium pyrophosphate 완중액 (pH 8.
- 41)로 여과한 후 7500rpm으로 10분간 원심분리하여 상등액을 진공회전농축기 (Eyela, Japan)로 농축하여 사용하였다. 농축된 시료의 고형분 농도는 굴절계 (Tokyo Co., Japan)를 이용하여 측정하였다.
- 1ml를 신속하게 혼합한 다음 분광광도계로 340nm에서 5분간 흡광도를 측정하였다. 대조군에는 ADH 대신 0.1% bovine serum albumin을 첨가하여 흡광도를 측정하였다. 25℃, pH 8.
- 5 ml), 1% phosphonic acid(3 ml), 7% TBA (1 ml)를첨가하고 lOCTC에서 45분간 가열한 후 n-butanol 4ml를 가하여 3000rpm으로 10분간 원심분리하여 상등액을 취해 353 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 무 추출물 대신 증류수를 첨가하여 측정하였다.
- 무 종류에 따른 미백활성을 측정하기 위해 봄과 여름에 주로 재배되는 청운무, 백광무, 청대무, 태창무 등의 4가지 종류를 수집하여 tyrosinase 활성 저해율을 측정하였다(F0 2). 무뿌리 의 IG#값은 청운무(2.
- 있다. 본 연구에서는 양성 대조군으로 이 3가지 미백 활성 물질을 갖고 tyrosinase 활성 저해율을 측정하였다. Kogic acid 와 cysteinee 농도가 0.
- 기질인 ethan이이 조효소 NAD의 존재 하에서 대사되면서 생성되는 NADH 양을 340 nm에서 흡광도를 측정하여 ADH 활성을 측정하였다. 우선 50 mM sodium pyrophosphate 완중액 (pH 8.8) 1.3 rW에 15 mM &-NAD를 1.5 ml 혼합한 후 95% ethanol 0.1 mZ와 시료를 농도별(2, 3, 5 mg/mZ)로 0.1 mZ 첨가한 후 25<>C로 예열된 항온수조에 넣어 온도를 유지시켜 주었다. 이 반응액에 0.
- subtilis ATCC 6633을 시험 균주로 하여 paper disc assay를 실시하였다. 우선 NA(nutrient agar: enzymatic digest of gelatin 5 g, beef extract 3 g, agar 15 g, per liter, pH 6.8) 겁H 지를 한천(agar)을 제외한 액체 배지와 한천을 포함하는 고체 배지로 만들어 액체 배지 200 mZ에 두 가지 균을 각각 200 B 씩 첨가한 후 37C에서 하루 동안 배양하였다. 하루 동안 배양된 균을 미리 준비해 둔 고체배지에 200μl씩 도말하였다.
- 1 mZ 첨가한 후 25<>C로 예열된 항온수조에 넣어 온도를 유지시켜 주었다. 이 반응액에 0.1% bovine serum albumin(pH 7.5)에 녹인 alcohol dehydrogenase 용액 (ADH, 0.75 unit/ml) 0.1ml를 신속하게 혼합한 다음 분광광도계로 340nm에서 5분간 흡광도를 측정하였다. 대조군에는 ADH 대신 0.
- 8 mZ의 상기 인산 완충액을 혼합하고, 37℃로 예열된 항온수조에 넣어 온도를 유지시켜 주었다. 이 반응액에 인산완충액에 용해한 tyrosinase 용액 (57.4 unit/m/)을 0.9 ml씩 더하고 신속하게 섞은 다음 분광광도계로 475nm에서 5 분 동안 흡광도를 측정하여 단위시간당 흡광도 변화율로부터 효소의 활성을 측정하였다. 37℃, pH 6.
- 일정 반응 후에 생산된 dopachrome의 양을 475nm에서 측정함으로써 tyrosinase의 활성을 측정하되, 시료 첨가에 의해 효소 활성 저해 정도를 측정하였다. 인산완충액 (sodium phosphate buffer, 0.5 M, pH 6.0)에 녹인 L-dopa(l mg/mZ) 1 mZ와 반응액 에서의 고형분 함량 기준의 최종 농도가 각각 0.4, 2, 4mg/m/ 되도록 희석된 시료 0.1 mZ와 0.8 mZ의 상기 인산 완충액을 혼합하고, 37℃로 예열된 항온수조에 넣어 온도를 유지시켜 주었다. 이 반응액에 인산완충액에 용해한 tyrosinase 용액 (57.
- Dopa oxidase의 활성측정은 L-dopa를 기질로 하여 tyrosinase에 의해 생산되는 반응산물인 dopachrome이 475 nm 에서 흡광도를 나타내는 점을 이용하여 시행하였다. 일정 반응 후에 생산된 dopachrome의 양을 475nm에서 측정함으로써 tyrosinase의 활성을 측정하되, 시료 첨가에 의해 효소 활성 저해 정도를 측정하였다. 인산완충액 (sodium phosphate buffer, 0.
- 본 연구에는 무 추출물의 알콜해독에 미치는 영향을 규명하기 위해 알콜대사 산물인 &-NADH의 양을 측정하여 효소활성을 측정하였다. 즉 기질인 ethanol이 조효소 NAD의 존재 하에서 대사되면서 생성되는 NADH양을 340nm에서 흡광도를 측정하여 ADH 활성을 측정하였다. Table 1에서 보는 것과 같이 무줄기 추출물 5mg/mZ에서 대략 5배의 활성화 효과를 보였고, 무줄기 추출물이 무뿌리 추출물보다 높은 활성을 보였다.
- 02iW의 1N NaOH를 첨가한 뒤 30초간 voltexing한 후 37℃으로 예열된 항온 수조에서 1시간 동안 진탕한 다음 420nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 flavonoid의 양은 naringin(l 표준 물질로 사용하여 표준 곡선을 통하여 계산하였다.
대상 데이터
- (Korea)에서 구입하여 실험에 사용하였다. β- nicotinamide adenine dinucleotide(β"NAD)는 Janssen Chimica (Japan)에서 구입하였다. E.
- (USA) 에서 구입하여 사용하였고, L-3, 4-dihydroxy-phenylalanine(L- dopa) 과 β- D-arbutin 은 각각 Across Organics(Japan) 와 Enzychem Co.(Korea)에서 구입하여 실험에 사용하였다. β- nicotinamide adenine dinucleotide(β"NAD)는 Janssen Chimica (Japan)에서 구입하였다.
- β- nicotinamide adenine dinucleotide(β"NAD)는 Janssen Chimica (Japan)에서 구입하였다. E. coli KI 12와 B. subtilus ATCC 6633은 한국미생물보존센타(KCCM)에서 분양받아 사용하였다. 기타 시약은 일급시악을 사용하였다.
- 시료 및 재료. 무의 종류로는 우리나라 봄 철에 가장 많이 생산되는 청운무를 재래시장에서 건조된 것으로 구입하여 사용하였다. 일부 실험에서는 청대무, 태창무, 백광무를 구입하여 사용하였다.
- 무의 종류로는 우리나라 봄 철에 가장 많이 생산되는 청운무를 재래시장에서 건조된 것으로 구입하여 사용하였다. 일부 실험에서는 청대무, 태창무, 백광무를 구입하여 사용하였다. Mushroom tyrosinase(25,000 unit/mg solid), kojic acid, L-cysteine, alcohol dehydrogenase(ADH, 347 unit/mg solid)와 bovine serum albumine Sigma Chemical Co.
데이터처리
- 미백활성 분석을 포함한 모든 활성 분석 실험에서는 각 시료별로 3회 반복 실험하였고 이를 평균土표준오차로 그래프에 표시했다.
이론/모형
- 측정. Bueg 등(3)의 방법에 따라 TBA가를 측정하였다. 계란 lecithin 0.
- assay). 무의 숙취 해소 활성을 측정하기 위해서 alcohol dehydrogenase activity assay 방법')을 이용하였다. 기질인 ethan이이 조효소 NAD의 존재 하에서 대사되면서 생성되는 NADH 양을 340 nm에서 흡광도를 측정하여 ADH 활성을 측정하였다.
- 미백 활성분석 (tyrosinase inhibition assay). 무의 피부 미백 활성을 측정하기 위해 tyrosinase inhibition assay법을 이용하였다. Dopa oxidase의 활성측정은 L-dopa를 기질로 하여 tyrosinase에 의해 생산되는 반응산물인 dopachrome이 475 nm 에서 흡광도를 나타내는 점을 이용하여 시행하였다.
- 총 페놀성 믈질 함량 측정. 추출된 각 phenol성 물질의 함량 측정은 Rhee 등(2)의 방법에 준하여 측정하였다. 2% N&CQ 용액 20ml를 무 추출물 0.
성능/효과
- 연구가 활발히 진행중에 있다.3) 그러나 미백제로 사용되는 화학약품이 피부염이나 피부의 완전탈색을 일으키는 많은 부작용을 유발하고 있다. 이런 부작용을 최소화하기 위하여 천연물을 이용하여 미백효과가 있는 성분을 개발하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다.
- 즉 기질인 ethanol이 조효소 NAD의 존재 하에서 대사되면서 생성되는 NADH양을 340nm에서 흡광도를 측정하여 ADH 활성을 측정하였다. Table 1에서 보는 것과 같이 무줄기 추출물 5mg/mZ에서 대략 5배의 활성화 효과를 보였고, 무줄기 추출물이 무뿌리 추출물보다 높은 활성을 보였다. 무줄기 추출물과 무뿌리 추출물은 각각 2.
- 또 다른 항산화력의 지표 인종 flavonoid성 물질 함량은 naringin으로 표준 곡선을 구하여 계산하였다. 그 결과 무줄기 추출물(0.01 %)은 0.417 mg/ml 함유하고 있었고, 무뿌리 추출물(0.01%)은 0.009 mg/ml를 함유하고 있었다. 총 flavonoide 물질은 무뿌리보다 무줄기 부분에 다량 함유되어 있었다.
- 식물이 함유하고 있는 총 페놀성 물질 (phenolic compound)의 양은 항산화력의 간접적인 지표가 된다. 무 추출물의 총 페놀함량은 chlorogenic acid를 이용한 표준 곡선에 따라 계산한 결과 무줄기 추출물(0.01%)은 0.272 mg/ ml 함유하고 있었고, 무뿌리 추출물(0.01%)에서는 0.206 mg/ mZ를 함유하고 있었다. 무줄기의 총 페놀 함량이 무뿌리에 비해 약 1.
- 5 mg/mZ) 순으로 나타났다. 무뿌리는 종류에 따라 tyrosinase 활성 저해율이 거의 차이가 없지만 무 줄기는 큰 차이를 보이고있음을 알 수 있었다.
- 9 mg/mZS- 나타났다. 무뿌리에 비해 무줄기가 높은 tyrosinase 활성 저해율을 보이고 있음을 알 수 있었다. Kim 등#의 연구에서 녹차 추출물의 IG(값은 2000μg/ml 비교하면 무줄기 추출물은 좋은 활성을 보이지만, Lee 등#)의 연구에서 박태기나무잎의 추출물의 IC50값인 20-50 #/mZ에 비하면 낮은 활성을 보이고 있다.
- Table 1에서 보는 것과 같이 무줄기 추출물 5mg/mZ에서 대략 5배의 활성화 효과를 보였고, 무줄기 추출물이 무뿌리 추출물보다 높은 활성을 보였다. 무줄기 추출물과 무뿌리 추출물은 각각 2.5 mg/mZ와 8 mg/ml 농도에서 150% 의 효소 활성화를 보였다. 무뿌리보다 무줄기가 숙취해소를 위한 기능성 식품소재로서의 가능성을 보여주고 있다.
- 5%를 나타냈다. 위의 3가지 항목을 살펴볼 때 무는 항산화제로서 이용 가능성이 충분한 것으로 판단되어 진다.
후속연구
- Kim 등#의 연구에서 녹차 추출물의 IG(값은 2000μg/ml 비교하면 무줄기 추출물은 좋은 활성을 보이지만, Lee 등#)의 연구에서 박태기나무잎의 추출물의 IC50값인 20-50 #/mZ에 비하면 낮은 활성을 보이고 있다. 분리되지 않은 물질인 것을 감안한다면 향후 추가 분리 정제 공정을 통하여 우수한 미백 기능성 소재의 발굴이 가능할 것으로 판단된다.
- 이상의 생리활성 분석을 통하여 무 줄기 < 이용한 숙취해소 및 항암기능 식품의 개발, 즈 무뿌리를 이용한 미백 기능 소재로의 개발 가능성을 확인할 수 있었으며 향후 기능 성분의 순수 분리 정제를 통한 고기능성 소재에 대한 연구개발의 필요성이 대두되었다. 이상으로 무줄기를 이용한 가공식품으로서 무음료(숙취해소, 항암), 무식초(항암), 무스넥(숙취 해소, 항암), 미백 화장품 등의 응용제품과 무뿌리를 이용한 항산화 식품과 기능성 화장품 등의 개발 가능성이 시사되었다. 무의 에탄올 추출물의 항암 활성에 대한 보고즈에서도 무의 사용 부위에 따라 상이한 결과를 보였다는 점에서 유사한 결과를 얻을 수 있었다.
- 결과를 보였다. 이상의 생리활성 분석을 통하여 무 줄기 < 이용한 숙취해소 및 항암기능 식품의 개발, 즈 무뿌리를 이용한 미백 기능 소재로의 개발 가능성을 확인할 수 있었으며 향후 기능 성분의 순수 분리 정제를 통한 고기능성 소재에 대한 연구개발의 필요성이 대두되었다. 이상으로 무줄기를 이용한 가공식품으로서 무음료(숙취해소, 항암), 무식초(항암), 무스넥(숙취 해소, 항암), 미백 화장품 등의 응용제품과 무뿌리를 이용한 항산화 식품과 기능성 화장품 등의 개발 가능성이 시사되었다.
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