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문제 정의
- 그러나 이미 보고된 무기성분 및 아미노산 함량에 대한 보고 이외에 퉁퉁마디에 포함되어 있는 성분에 대한 연구는 전무한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 퉁퉁마디의 식물 화학적 성분에 관한 연구의 일부로서 퉁퉁마디에 포함된 flavonoid 성분을 분리, 동정하였다. 또한 분리된 물질과 더불어 quercetin, rutin을 대상으로 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하여 flavonoid 구조와 항산화 활성사이의 관계를 규명하고자 하였다.
- 따라서 본 연구에서는 퉁퉁마디의 식물 화학적 성분에 관한 연구의 일부로서 퉁퉁마디에 포함된 flavonoid 성분을 분리, 동정하였다. 또한 분리된 물질과 더불어 quercetin, rutin을 대상으로 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하여 flavonoid 구조와 항산화 활성사이의 관계를 규명하고자 하였다.
제안 방법
- 질량 분석 결과 가장 큰 m/z 값은 487로 나타났으며, 이를 [M+Na]+로 생각하여 분자량을 464로 추정하였으며, NMR 측정에서 나타난 결과와 종합하여 화학식을 C2)H3)O12로 결정하였다. 화합물 1의 정확한 분자 구조를 확인하기 위하여 'H-NMR, "C-NMR, HMQC 실험을 수행하였다. 13C-NMR 에서는 전형적인 flavonol의 탄소 신호가 나타났으며, 1개의 6탄당 탄소 신호도 함께 나타났다.
- DPPH 라디칼을 이용하여 퉁퉁마디에서 분리된 flavonoid와 시판되는 flavonoid인 quercetin과 rutin의 라디칼 소거 활성을 측정하였다. 시험 대상인 flavonoid가 없는 상태에서 DPPH 용액의 흡광도는 실험 기간동안(60분 이상) 변하지 않았다.
- 비선광도는 Autopol ni(USA)를 사용하여 측정하였고, UV spectrum 은 Beckman DU650 spectrophotometer(Germany)를 사용하였다. Mass spectrum은 Finnigan LCQ(USA)를 사용하여 측정하였고, NMR spectrum은 Bruker Avance 400(Germany)을 이용하여 측정하였다. MPLC는 Eyela(Japan) VSP-3050 펌프와 UV-D2 검출기를 사용하였다.
- 그늘에서 건조시킨 퉁퉁마디 지상부 1.5 kg 을 분쇄한 뒤 MeOH 5/씩 3회에 걸쳐 추출하였다., MeOH 추출액을 감압 농축하여 302 g의 잔류물을 얻었으며 여기에 증류수 1.
- 5 l 첨가하여 현탁 용액을 만들었다. 물 현탁 용액에 n- hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol을 1Z씩 첨가하여 극성에 따른 용매 분획을 제조하여 각 분획별로 27.2g, 4.7g, 2.4 g, 17.0 g의 조추출물을 얻었다. Ethyl acetate 조추출물(2.
- 1 mM 용액에 ImM 농도의 측정할 시료를 넣어 3mL로 만든 뒤 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 최종농도는 5, 10, 50, 100μM이 되도록 하였으며, 30초 간격으로 흡광도를 측정하여 20분까지 측정하였다.
- 용매는 H2O : MeOH(2 :1)로 시작하여 MeOH의 함량을 100% 까지 증가시켰다. 용출된 물질을 TLC로 확인하여 5개의 분획으로 나누고 이중 2번 분획 (0.5 g)을 Sephadex LH-20 칼럼 (2X 100 cm)을 이용하여 분리하였다. 용매는 MeOH 단일 용매 계를 사용하였다.
- 화합물 1은 TLC 결과 노란색을 나타내었으며, 254 nm 자외선 하에서 형광을 나타내었다. 이 결과로 화합물 1을 flavonoid 계열 화합물로 추정하고 UV-Vis 흡수 스펙트럼을 측정하였다. 화합물 1을 MeOH 에 녹인 후 흡수 스펙트럼을 측정한 결과, 257nm(band Ⅰ)와 357nm(band Ⅱ)에서 최대 흡광도를 보이는 전형적인 flavonol의 흡수 스펙트럼을 보였다(Table 1).
- 이 값은 화합물 1보다 14가 큰 값으로 화합물 2는 화합물 1의 hydroxyl 그룹 대신에 methoxyl 그룹이 1개 도입된 것으로 추정하였다. 이상의 결과로부터 화합물 2는 3-OH와 3-OH 위치에 당 또는 methoxyl 그룹이 각각 결합된 것으로 생각되었으며, 정확한 구조를 결정하기 위해 NMR 스펙트럼을 측정하였다. 1H-NMR과 "C-NMR 결과는 화합물 1과 유사한 패턴을 보였으나, 추가적으로 methoxyl 그룹의 존재 ('H-NW: 53.
- 화합물 1, 2의 구조는 UV-Vis 스펙트럼, 질량 분석, NMR 스펙트럼을 이용하여 분석하였다. 화합물 1은 TLC 결과 노란색을 나타내었으며, 254 nm 자외선 하에서 형광을 나타내었다.
- Band Ⅱ가 quercetin의 373 nm보다 16 nm 감소한 357 nm에서 나타났는데 이는 3-OH 위치에 치환기가 부착되어있음을 의미한다. 화합물 1의 다른 수산기에 치환기가 부착되어 있는지를 알아보기 위해 NaOH, A1CL, NaOAc, NaOAc와 H3BO3 혼합물을 각각 첨가하여 UV- Vis 흡수 스펙트럼을 측정하였다. 이 결과 band I과 band II가 각각 고유의 파장만큼 이동되는 것으로 나타나 다른 수산기에는 치환기가 없는 것으로 결론 지었다.
- 이 결과 band I과 band II가 각각 고유의 파장만큼 이동되는 것으로 나타나 다른 수산기에는 치환기가 없는 것으로 결론 지었다. 화합물 1의 분자량은 LC-MS를 이용하여 측정하였다. 질량 분석 결과 가장 큰 m/z 값은 487로 나타났으며, 이를 [M+Na]+로 생각하여 분자량을 464로 추정하였으며, NMR 측정에서 나타난 결과와 종합하여 화학식을 C2)H3)O12로 결정하였다.
대상 데이터
- Mass spectrum은 Finnigan LCQ(USA)를 사용하여 측정하였고, NMR spectrum은 Bruker Avance 400(Germany)을 이용하여 측정하였다. MPLC는 Eyela(Japan) VSP-3050 펌프와 UV-D2 검출기를 사용하였다. 사용된 용매는 1 급 및 특급 시약을 사용하였고, DPPH(1, 1- diphenyl-2-picrylhydrazyl), quercetin, rutin은 Sigma 사에서 구입하여 사용하였다.
- 용매의 유속을 5 mZ/min 으로 하였을 때, 화합물 1은 75분에 용출되었고 화합물 2는 60 분에 용출되었다. MPLC에 사용된 칼럼은 1.0×30 cm 였으며, 용매 는 H2O:MeOH(3: 2)였고, 충진제는 YMC-gel ODS- A(75 p.m, pore size 12 nm, Japan)이었다.
- 본 실험에서 사용한 퉁퉁마디는 전라남도 무안군 해안가에서 2001년 9월에 채취하여 음건한 후 분쇄하여 사용하였다. 증거 표본은 목포대학교 생약자원전공 식물 표본실에 보관되어있다.
- MPLC는 Eyela(Japan) VSP-3050 펌프와 UV-D2 검출기를 사용하였다. 사용된 용매는 1 급 및 특급 시약을 사용하였고, DPPH(1, 1- diphenyl-2-picrylhydrazyl), quercetin, rutin은 Sigma 사에서 구입하여 사용하였다.
- 5 g)을 Sephadex LH-20 칼럼 (2X 100 cm)을 이용하여 분리하였다. 용매는 MeOH 단일 용매 계를 사용하였다. 용출된 분획을 TLC하여 UV 254nm에서 형광을 나타내는 분획 중 일부(50 mg)를 모아서 MPLCS- 분리하여 화합물 1(25 mg)과 2(20 mg) 얻었다.
이론/모형
- 각 화합물들의 free radical 소거 활성은 DPPH 방법으로 측정하였다3 DPPH를 MeOH에녹여 만든 0.1 mM 용액에 ImM 농도의 측정할 시료를 넣어 3mL로 만든 뒤 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 최종농도는 5, 10, 50, 100μM이 되도록 하였으며, 30초 간격으로 흡광도를 측정하여 20분까지 측정하였다.
성능/효과
- 잎은 없으며 퉁퉁한 가지에 마디가 많이 있어서 퉁퉁마디라고 불린다.1)퉁퉁마디는 염류 농도가 높은 갯벌에서 자라기 때문에 삼투압을 견디기 위해 식물체내에 육상식물보다 높은 염류를 저장한다. 최근 보고에 의하면 Na 성분뿐만 아니라 Ca, K, Mg, Fe, Zn 성분들이 퉁퉁마디에 고농도로 존재하는 것으로 알려졌다.
- Quercetin의 최종 농도가 100, 50μM인 경우에는 1분 이내에 흡광도는 최저점에 도달하였다. Quercetin의 3-OH 위치에 glucose 1분자가 치환된 화합물 1과 glucose와 rhamnose가 치환된 rutin의 경우 100gM 농도에서는 quemetin과 비슷한 경향을 보였으나, 50 μM 이하에서는 quercetin 보다 라디칼 소거 기능이 약한 것으로 나타났다. 화합물 2의 경우에는 다른 3종의 flavonoid와는 확연히 다른 흡광도 변화 패턴을 보였다.
- 2). 당이 결합하지 않은 flavonol 구조를 가진 quercetin을 첨가하였을 때 흡광도가 가장 급격히 감소하였으며, 이러한 경향은 농도 의존적으로 나타났다. Quercetin의 최종 농도가 100, 50μM인 경우에는 1분 이내에 흡광도는 최저점에 도달하였다.
- 8 Hz인 doublet인 것으로 보아 β 형태로 결합하고 있음을 알 수 있었다. 또한 'H-NMR에서는 특징적인 singlet 1 개 (67.57), 인접한 수소의 coupling에 의한 doublet 2개 (67.58, 56.83, J= 8.8Hz), long range coupling에 의한 doublet 2개 (56.39, 56.19, J = 2.0Hz)가 나타났다. 이 결과는 aglycone 부분이 quercetin임을 의미한다.
- 화합물 1의 다른 수산기에 치환기가 부착되어 있는지를 알아보기 위해 NaOH, A1CL, NaOAc, NaOAc와 H3BO3 혼합물을 각각 첨가하여 UV- Vis 흡수 스펙트럼을 측정하였다. 이 결과 band I과 band II가 각각 고유의 파장만큼 이동되는 것으로 나타나 다른 수산기에는 치환기가 없는 것으로 결론 지었다. 화합물 1의 분자량은 LC-MS를 이용하여 측정하였다.
- 그러나 NaOAc와 H3BO3를 동시에 첨가하고 흡수 스펙트럼을 측정한 결과에서는 최대 흡광도가 254 nm (band I)와 356 nm(band II)에서 나타나 흡수 band의 이동이 나타나지 않았다(Table 1). 이 결과는 3', 4'-OH 중 한곳에 치환기가 결합되어 있다는 것을 의미하며, NaOH 첨가시 band U 가 이동한 결과(356nmf 411 nm)를 함께 고려할 때 3'-OH 위치에 치환기가 존재함을 의미한다. 화합물 2를 LC-MS로 분석한 결과 m/z 5이에서 [M+Na]+ 신호가 나타났으며, 이 결과로 분자량을 478로 결정하였다.
- 이 결과에서는 B-ring의 3' 또는 4-OH 위치에 glucuronic acid가 존재할 때 quercetin과 비슷한 효소 저해 활성이 나타났으며, 3 또는 7-OH 위치에 치환기가 존재할 때는 효소 저해 활성이 낮게 나타났다. 이 결과는 본연구에서 수행한 DPPH 라디칼 소거 활성과는 반대의 상관 관계를 보여준다.
- 6) Day 등의 보고에서는 quercetin의 3, 7, 3', 4'-OH에 각각 glucuronic acid가 치환된 flavonoid로 xanthine oxidase와 lipoxygenase 활성 저해 효과를 시험하였다. 이 결과에서는 B-ring의 3' 또는 4-OH 위치에 glucuronic acid가 존재할 때 quercetin과 비슷한 효소 저해 활성이 나타났으며, 3 또는 7-OH 위치에 치환기가 존재할 때는 효소 저해 활성이 낮게 나타났다. 이 결과는 본연구에서 수행한 DPPH 라디칼 소거 활성과는 반대의 상관 관계를 보여준다.
- 84)와 상관 관계를 나타내어 methoxyl 그룹이 3-OH에 치환되어 있음을 증명하였다. 이상의 결과 화합물 2는 quercetin의 3-OH에 glucose가결합되어 있고 3, -OH 이 methoxyl 그룹으로 치환된 isorhamnetin 3-O-/3-D-glucopyranosideS- 결정되었다(Fig. 1).
- 이 결과는 aglycone 부분이 quercetin임을 의미한다. 이상의 결과로부터 화합물 1의 구조는 quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside로 결정되었다(Fig. 1).
- 이상의 결과를 종합하면 flavonoid가 DPPH 라디칼을 소거시키는 활성은 치환기의 위치에 의해 영향을 받는 것으로 나타났다. Flavonol 구조를 가진 quercetin이 가장 강력한 라디칼 소거 활성을 나타내며, flavon이의 3번 위치에 당이 결합한 이ycoside 는 이 보다 조금 약한 활성을 보인다.
- 화합물 1의 분자량은 LC-MS를 이용하여 측정하였다. 질량 분석 결과 가장 큰 m/z 값은 487로 나타났으며, 이를 [M+Na]+로 생각하여 분자량을 464로 추정하였으며, NMR 측정에서 나타난 결과와 종합하여 화학식을 C2)H3)O12로 결정하였다. 화합물 1의 정확한 분자 구조를 확인하기 위하여 'H-NMR, "C-NMR, HMQC 실험을 수행하였다.
- 이 결과로 화합물 1을 flavonoid 계열 화합물로 추정하고 UV-Vis 흡수 스펙트럼을 측정하였다. 화합물 1을 MeOH 에 녹인 후 흡수 스펙트럼을 측정한 결과, 257nm(band Ⅰ)와 357nm(band Ⅱ)에서 최대 흡광도를 보이는 전형적인 flavonol의 흡수 스펙트럼을 보였다(Table 1). Band Ⅱ가 quercetin의 373 nm보다 16 nm 감소한 357 nm에서 나타났는데 이는 3-OH 위치에 치환기가 부착되어있음을 의미한다.
- 화합물 2의 경우에는 다른 3종의 flavonoid와는 확연히 다른 흡광도 변화 패턴을 보였다. 화합물 2는 시험대상인 다른 flavonoid와 달리 flavonoid B-ring의 3'- OH 위치가 methoxyl 그룹으로 치환된 구조를 가지는데, 100 μM 농도에서도 quercetin 10 pM 농도보다 라디칼 소거 기능이 약하게 나타났다. 이러한 경향은 반응시간을 길게 하여도 동일하게 나타나서 2시간 이상 반응시킨 후에도 흡광도가 0.
- 이 결과는 3', 4'-OH 중 한곳에 치환기가 결합되어 있다는 것을 의미하며, NaOH 첨가시 band U 가 이동한 결과(356nmf 411 nm)를 함께 고려할 때 3'-OH 위치에 치환기가 존재함을 의미한다. 화합물 2를 LC-MS로 분석한 결과 m/z 5이에서 [M+Na]+ 신호가 나타났으며, 이 결과로 분자량을 478로 결정하였다. 이 값은 화합물 1보다 14가 큰 값으로 화합물 2는 화합물 1의 hydroxyl 그룹 대신에 methoxyl 그룹이 1개 도입된 것으로 추정하였다.
- flavonol glycoside로 주정되었다. 화합물 2의 UV-\is 흡수 band II는 356nm로서 화합물 1과 동일하게 3-OH에 치환기가결합되어 있음을 알 수 있었다. NaOH, A1C13, NaOAc를 각각 첨가하여 흡수 스펙트럼을 측정하였을 때도 band II의 이동이 나타나 5, 7, 4' 위치의 수산기에 치환기가 결합하고 있지 않음을 알 수 있었다.
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