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문제 정의
- 활성을 측정하였다. 그 중 용안육 추출물에서 활성이 확인되어 본 연구를 시작하였다.
- 본 연구에서는 용안육의 n-BuOH 분획으로부터 column chromatography를 수행하여 4종의 화합물을 분리 동정하였고, 각각의 화합물에 대한 혈소판 응집억제활성을 측정하였기에 보고하고자 한다.
제안 방법
- 여액을 45。(2에서 감압농축하고, 이 농축물을 물(1Z)과 ethyl acetate(EtOAc, 1 Z><2)로 분배 추출하였으며, 물층은 다시 n-butanol(n-BuOH, 1ZX2)로 분배 추출하였다. 각 층을 감압 농축하여 EtOAc분획 (9.
- PRP 400財을 취하여 먼저 37>C에서 3분간 incubation 한 후 50 ]丑 (50 卜想/m。의 시료를 가하였다. 2분후 50 W의 혈소판 응집촉진물질로 자극하여 응집을 유도하여, 응집반응을 5분간 측정한 후, 5분 후의 응집률을 계산하였다. 응집이 측정되는 동안 반응액의 교반은 LOOOrpm이 되게 하였다.
- 따라서 화합물 1은 fiiran환의 바깥쪽에 aldehyde 1개와 oxygenated methylene 1개를 가지고 있는 것으로 판명되었다. Aldehyde와 oxygenated methylene의 위치를 확인하기 위해서, 'H-'H COSY HSQC, HMBC등의 2D-NMR을 측정하였다. HSQC spectrum을 토대로 각각의 탄소와 수소의 정확한 assign을 할 수 있었고, HMBC spectrum에서 59.
- 따라서 화합물 2는 glucose 한 분자에 ethyl group이 결합되어 있는 화합물로 판명되었다. Ethyl group의 위치를 확인하기 위해 HmmC를 측정하였다. HMBC spectrum에서 84.
- LAB5(706 mg) 분획을 silica gel c.c.(CHCl3-MeOH-H, O = 12:3:1, 아래층, 045X15cm)를 이용하여 화합물 2(LAB5-6, 20 mg)를 포함하여 10개의 분획물(LAB5-l~LAB5-10)을 얻었다. 그 중에서 LAB5-3(292.
- LAB6(1.63 g) 분획 을 silica gel c.c.(CHCl3-MeOH-H2O = 9:3:1, 아래층, 0>4.5X 13 cm)를 이용하여 7개의 분획물 (LAB6- l~LAB6-7)을 얻었고, 그 중 LAB6~4(183.6mg)에 대하여 Sephadex LH-20 c.c.(100% MeOH, <52X33 cm)로 정 제 하여 화합물 4(13.4 mg)를 분리하였다.
- 따라서 화합물 3은 glucose 한분자에 exo-methylene을 포함한 이중결합 1개, oxygenated quaternary carbon에 결합된 methyl기 2개가 결합하고 있는 화합물로 판명되었다. Oxygenated quaternary carbon과 methyl기 2개, 이중결합의 위치를 확인하기 위해 HMBC를 측정하였다. HMBC spectrum에서 84.
- h-BuOH 분획을 silica gel column chromatography, ODS column chromatography 및 Sephadex LH-20 chromatography 로 정제하여 4개의 화합물 1(20 mg), 2(20 mg), 3(10 mg) 및 4(13 mg)를 분리하였다.
- n-BuOH 추출물(LAB)을 silica gel column chromatography (c.c.)(CHCl3-MeOH-H2O =10:3:1, 아래층, <©7X27cm)를 실시하여 13개의 분획물(LAB1~LAB13)을 얻었다. 그 중 LAB1 (660 mg) 분획 을 silica gel c.
- 혈소판 응집촉진물질로는 collagen (Sigma, 200ng/mZ)을 사용하였다. 각 실험은 3반복으로 수행하였다.
- 얻어진 여액을 45。(2에서 감압농축하고, 이 농축물을 물(1Z)과 ethyl acetate(EtOAc, 1 Z><2)로 분배 추출하였으며, 물층은 다시 n-butanol(n-BuOH, 1ZX2)로 분배 추출하였다. 각 층을 감압 농축하여 EtOAc분획 (9.4 g), n-BuOH(55.8 g) 및 물분획 (3.3 kg)을얻었다.
- 용안육으로부터 얻어진 MeOH 추출물에 대하여 용매의 극성에 따라 EtOAc, n-BuOH 및 HQ로 순차 분획하고 각 분획은 감압 농축하여 3개의 분획을 얻었다.
대상 데이터
- LH-20(Sigma, USA)을 사용하였다. TLC는 Kieselgel 60「电와 RP-18 F254들 사용하였고, 실험에 이용한 모든 시약은 특급시약을 사용하였다.
- 경동시장에서 용안육(대만산)을 구입하였고, 표본 시료(KHW02174)는 경희대학교(수원) 천연물화학실 시료실에 보관되어 있다.
- 용안육 5 kg에 80% MeOH 용액(15 伙2) 을 가하여 실온에서 하룻밤 추출한 후 여과지로 여과하였다. 얻어진 여액을 45。(2에서 감압농축하고, 이 농축물을 물(1Z)과 ethyl acetate(EtOAc, 1 Z><2)로 분배 추출하였으며, 물층은 다시 n-butanol(n-BuOH, 1ZX2)로 분배 추출하였다.
- 응집이 측정되는 동안 반응액의 교반은 LOOOrpm이 되게 하였다. 혈소판 응집촉진물질로는 collagen (Sigma, 200ng/mZ)을 사용하였다. 각 실험은 3반복으로 수행하였다.
- 혈액은 최근 15일이상 약물 투여를 받지 않은 건강한 지원자의 혈액을 채취하였으며, 3.8% sodium citrate(l: 9, v/v)가 처리된 채혈튜브를 사용하여 정맥으로부터 채취하였다. 혈소판 풍부혈장(PRP; Platelet rich plasma) 은 채혈된 혈액을 lOOOrpm에서 10분간 원심분리하여 얻었다.
이론/모형
- 혈 소판 응집 억 제 능은 Platelet Aggregometer(Whole Blood Lumi-ionized Calcium Aggregometer, Chronolog Corp., USA) 를 이용한 탁도측정법으로 측정하였다. PRP 400財을 취하여 먼저 37>C에서 3분간 incubation 한 후 50 ]丑 (50 卜想/m。의 시료를 가하였다.
성능/효과
- 53( 1H, s)의 signal로부터 aldehyde가 존재함을 확인하였다. 또한, 87.38( 1H, d, J=3.4Hz), 86.58( 1H, d, J =3.4 Hz)의 2 개의 proton signal °1 가지는 chemical shift 와 coupling constant 값으로부터 furan환이 존재함을 예측할 수 있었고, 54.60(2H, "의 chemical shift 값을 가지는 singlet oxygenated methylene proton 이 관측되어 chain 형태의 oxygenated methylene이 존재함을 확인할 수 있었다. 따라서 화합물 1은 furan환에 aldehyde 1개, oxygenated methylene 1개가 결합하고 있는 화합물로 판단되었다.
- 의 peak 가 관찰되었다. 1H-NMR spectrum 에서 89.53( 1H, s)의 signal로부터 aldehyde가 존재함을 확인하였다. 또한, 87.
- Ethyl group의 위치를 확인하기 위해 HmmC를 측정하였다. HMBC spectrum에서 84.25QH, d, J = 7.8Hz, H-T)의 anomeric signal과 866.14 (C-l)의 signal 사이에서 correlation0] 확인되어 당의 anomeric 수산기에 C-1 이 결합되어 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 종합하여 화합물 2를 ethyl &D-glucopyranoside로 동정하였다 .
- Oxygenated quaternary carbon과 methyl기 2개, 이중결합의 위치를 확인하기 위해 HMBC를 측정하였다. HMBC spectrum에서 84.31(1H, d, J =8.0Hz, H*) -l 의 anomeric signal 과 879.02(C-l) 의 signal 사이에서 conEafiori이 확인되어 당의 anomeric 수산기에 C-1 이 결합되어있음을 확인할 수 있었다. 또한 679.
- Aldehyde와 oxygenated methylene의 위치를 확인하기 위해서, 'H-'H COSY HSQC, HMBC등의 2D-NMR을 측정하였다. HSQC spectrum을 토대로 각각의 탄소와 수소의 정확한 assign을 할 수 있었고, HMBC spectrum에서 59.53(1H, s, H-6)의 signal과 6153.9(C-2)의 signal과의 사이에서 correlation이 확인되어, aldehyde의 위치가 C-2임을 확인할 수 있었다. 또한, 54.
- 관측되었다. 〔H-NMR spectrum에 있어서 anomeric의 특징적인 signal인 85.9O(1H, d, J = 4.6 Hz)의 proton signal이 관측되었고, 54.17, 84.14, 54.00에서 3개의 oxygenated methine과 83.83, 83.72에서 1개의 oxygenated methylene signal이 관측되어 한 분자의 5탄당이 존재함을 알 수 있었다. 당의 signal 이외에 38.
- 각 화합물에 대하여 혈소판 응집억제활성을 측정하여 본 결과(Fig. 2) 음성대조군으로 혈소판에 증류수만을 처리했을 때는 5분동안 18%의 혈소판 응집률을 보였고, 양성대조군으로 혈소판, 물 외에 혈소판 응집제인 collagen을 첨가하였을 때는 94% 의 응집률을 보였다. 화합물 1, 2 및 3을 최종농도 5仕g/mZ로처리했을 때, 각각 89%, 91%, 93%의 혈소판 응집률을 보여 주목할만한 혈소판 응집 억제 활성을 보이지 않았지만 화합물 4(uridine)를 처리하였을 때는 혈소판 응집률이 21%밖에 일어나지 않았기 때문에 78%의 응집 억제 효과를 나타내었다.
- 13에서 다수의 oxygenated methine 또는 oxygenated methylene signal 이 관측되어 한 분자의 당이 존재함을 알 수 있었다. 당 signal 이외에 53.95(1H, dd, J =9.6, 7.2Hz)와 83.6O(1H, dd, J = 9.6, 7.2Hz)의 signal이 관측되었으며, 6L22(3H, t, J=7.2Hz) 에서 triplete methyl signal이 관측되어 oxygenated ethyl기가 존재함을 알 수 있었다. 13C-NMR spectrum에서 탄소 8개의 signal0] 관즉되었으며, 8103.
- 72에서 1개의 oxygenated methylene signal이 관측되어 한 분자의 5탄당이 존재함을 알 수 있었다. 당의 signal 이외에 38.01(lH, d, 8.1 Hz)의 signale 85.69(1H, d, 8.1 Hz)의 signal이 서로 couplin앙을 보이는 olefinic methine signal을 확인할 수 있었다. 따라서 화합물 4는 5탄당 한 분자가 이중결합 1개를 가지고 있는 화합물과 결합한 배당체로 추정되었다.
- 66에서 methyl signal이 관즉되었다. 따라서 화합물 3은 glucose 한분자에 exo-methylene을 포함한 이중결합 1개, oxygenated quaternary carbon에 결합된 methyl기 2개가 결합하고 있는 화합물로 판명되었다. Oxygenated quaternary carbon과 methyl기 2개, 이중결합의 위치를 확인하기 위해 HMBC를 측정하였다.
- 32(3H, s)의 chemical 아號 값을 가지는 singlet m说hyl기가관측되었다. 따라서 화합물 3은 당 한 분자에 exo-methylene 1 개, olefinic methine 1개 및 methyl기 2개의 비당부를 포함하는 화합물로 판단되었다. 13C-NMR spectrum에서 11개의 탄소 si잉ial이 관측되었으며, 899.
- 02(C-l) 의 signal 사이에서 conEafiori이 확인되어 당의 anomeric 수산기에 C-1 이 결합되어있음을 확인할 수 있었다. 또한 679.02(01)의 signal이 81.37(3H, s, H-5), 61.32(3H, s, H-4)의 signal과 correlation하고 있음이 확인되어 이에 C-4와 C-5의 methyl기가 결합되어있다는 것을 알 수 있었으며, 6145.22(02)의 signal이 51.37 (3H, s, H-5), 81.32(3H, s, H-4)의 sign이과 correlation0] 확인되어 C-1에 이중결합이 결합되어 있다는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 종합하여 화합물 3을 l, l-dimethyl-2- propenyl 1-O-0-D-glucopyianosid館로 동정하였다.
- 13에서 다수의 oxygenated methine 또는 oxygenated methylene signal이 관측되어 한 분자의 당이 존재함을 알 수 있었다. 또한, 당의 signal 이외에 86.03(lH, dd, J = 17.7, 10.9 Hz)의 sig曲이 55.20(lH, dd, J= 17.7, 1.2 Hz)의 signal과 85.10(lH, dd, J= 10.9, L2Hz)의 signal과 각각 coupling을 보이고, 65.20와 65.10 사이에도 cgpling이 보여 1개의 exo- methylene이 존재함을 알 수 있었다. 그리고 51.
- 14 (C-l)의 signal 사이에서 correlation0] 확인되어 당의 anomeric 수산기에 C-1 이 결합되어 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 종합하여 화합물 2를 ethyl &D-glucopyranoside로 동정하였다 .力
- 32(3H, s, H-4)의 sign이과 correlation0] 확인되어 C-1에 이중결합이 결합되어 있다는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 종합하여 화합물 3을 l, l-dimethyl-2- propenyl 1-O-0-D-glucopyianosid館로 동정하였다.幻
- 화합물 1, 2 및 3을 최종농도 5仕g/mZ로처리했을 때, 각각 89%, 91%, 93%의 혈소판 응집률을 보여 주목할만한 혈소판 응집 억제 활성을 보이지 않았지만 화합물 4(uridine)를 처리하였을 때는 혈소판 응집률이 21%밖에 일어나지 않았기 때문에 78%의 응집 억제 효과를 나타내었다. 잘 알려진 혈소판 응집 억제 물질인 eugenol">을 처리했을 때 혈소판 응집률이 25%로 73% 응집억제 효과를 보여, uridine이 eugenol보다 다소 높은 억제 효과를 보이는 것으로 나타났다. 이러한 혈소판 응집 억제 활성은 항고혈압 뿐만 아니라 항암효과에도 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.
- 2) 음성대조군으로 혈소판에 증류수만을 처리했을 때는 5분동안 18%의 혈소판 응집률을 보였고, 양성대조군으로 혈소판, 물 외에 혈소판 응집제인 collagen을 첨가하였을 때는 94% 의 응집률을 보였다. 화합물 1, 2 및 3을 최종농도 5仕g/mZ로처리했을 때, 각각 89%, 91%, 93%의 혈소판 응집률을 보여 주목할만한 혈소판 응집 억제 활성을 보이지 않았지만 화합물 4(uridine)를 처리하였을 때는 혈소판 응집률이 21%밖에 일어나지 않았기 때문에 78%의 응집 억제 효과를 나타내었다. 잘 알려진 혈소판 응집 억제 물질인 eugenol">을 처리했을 때 혈소판 응집률이 25%로 73% 응집억제 효과를 보여, uridine이 eugenol보다 다소 높은 억제 효과를 보이는 것으로 나타났다.
- 화합물 3& 무색의 oil상 물질로서, 1H-NMR spectrum을 보면, 84.31(1H, d, J=8Hz)에서 1개의 anomeric signal과 63.79~83.13에서 다수의 oxygenated methine 또는 oxygenated methylene signal이 관측되어 한 분자의 당이 존재함을 알 수 있었다. 또한, 당의 signal 이외에 86.
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