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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 참소리쟁이 뿌리로부터 마디풀科 식물의 주요 약효성분으로 알려진 anthraquinone 계통의 화합물을 분리하고 이를 인체암 세포주에 대한 활성을 조사하여 새로운 천연물 유래 생리활성물질의 개발가능성을 규명하고자 하였다.
제안 방법
- Mass specttume JEOL JMS-700(Japan)을 사용하였다. 'H-, 13C- NMR 그리고 2D-NMR spectrume Bruker AM 500(500 MHz, Germany) 으로 측정하였고, 내부표준물질로는 tetramethylsilane(TMS)을 사용하여 즉정하였다.
- 4% sulforhodamine B를 100|i//wellfr 가하여 단백질을 염색시켰다. 30분 방치한 다음 0.1% acetic acid로 세척 후 다시 건조시키고 10 mM Tris base(pH 10.5)를 lOOpV/well에 가하여 염색시약을 용해 시키고 분광광도계 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 암세포들에 대한 시료의 세포독성효과를 계산하기 위하여 시료를 가하는 시점에서의 암세포수(zero time)와 시료 대신 과량의 medium만을 가하여 48시간 배양하였을 때의 세포수(control) 및 각 농도의 시료를 함께 넣고 48시간 배양하였을 때의 세포수를 각각 측정하여 암세포의 성장을 50% 억제하는 농도인 IC5O(5O% 성장저해농도)을 계산하여 각 시료의 세포독성강도를 결정하는 parameter로 사용하였다.
- 84에서 CH3의 peak를 관찰했다. 4차탄소에 의해 연결이 이루어지지 않는 부분의 정보는 HMBC로 long range coupling을 결정하였다. 이상의 결과와 문헌을I© 비교하여 화합물 2는 1, 6, 8- tryhydroxy-3-methylantmaquinone(emodine)으로 확인 동정하였고, 그 결과는 Fig.
- 추출 및 분리. 그늘에서 말린 후 잘게 썰은 참소리쟁이 뿌리 600 g을 MeOH에 침지하여 상온에서 3일 간격으로 3회 반복 추출한 후, rotary evaporator로 농축하여 MeOH 추출물 85 g을 얻었으며, 이것을 n-hexane과 chloroform, ethyl acetate, 증류수 순으로 분획을 실시하였다. 이 중 황산 발색시 노란색의 anthraguinone 화합물의 특징적인 색을 가진 CHC13 분획물 37 g을 silica gel(400g; 70-230 mesh)이 충진된 칼럼으로 분리하였다.
- 5)를 lOOpV/well에 가하여 염색시약을 용해 시키고 분광광도계 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 암세포들에 대한 시료의 세포독성효과를 계산하기 위하여 시료를 가하는 시점에서의 암세포수(zero time)와 시료 대신 과량의 medium만을 가하여 48시간 배양하였을 때의 세포수(control) 및 각 농도의 시료를 함께 넣고 48시간 배양하였을 때의 세포수를 각각 측정하여 암세포의 성장을 50% 억제하는 농도인 IC5O(5O% 성장저해농도)을 계산하여 각 시료의 세포독성강도를 결정하는 parameter로 사용하였다.
- 용출액 중 Fraction 4는 silica gel을 충진시킨 칼럼 (5X18 cm)으로 n- hexane-EtOAc 혼합용매에서 EtOAc의 비율을 순차적으로 높여가며 50mZ씩 분획 회수하여 2차 칼럼크로마토그래피를 실시하여 8개의 소분획물을 얻었다. 이들 중 소분획물 5를 다시 n- hexane-ether 용매조건으로 3차 칼럼크로마토그래피 (2.5 X18 cm) 를 실시하여 노란색의 분말형 화합물 3(47 mg, R# 0.68, n- hexane-EtOAc = 19 :1)를 순수 분리하였으며 , fraction 4의 소 분획물 7을 다시 n-hexane-ether 용매조건으로 3차 칼럼 크로마토그래피(2.5X18 cm)를 실시한 후 최종적으로 CHC'을 전개 용매로 preparative TLC를 실시하여 노란색의 분말형 화합물 4(30 mg, §=0.63, n-hexane-EtOAc = 19 : 1)를 순수 분리하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 참소리쟁이japonicus HOUTT.)는 대한식물도감 등을 참고로 하여 진주시 가좌동 경상대학교 앞 하천 주위에서 6월 초순경에 참소리쟁이 뿌리를 채취하였다. 위 식물들은 정확히 감정한 후 음건세절하여 실험에 사용하였다.
- UV spectrum 은 Beckman UV/Vis spectrophotometer DU650 (USA), IR 은 Broker IFS66 FT-IR spectrophotometer (Germany)를 이용하여 KBr disc법으로 즉정하였다. Mass specttume JEOL JMS-700(Japan)을 사용하였다. 'H-, 13C- NMR 그리고 2D-NMR spectrume Bruker AM 500(500 MHz, Germany) 으로 측정하였고, 내부표준물질로는 tetramethylsilane(TMS)을 사용하여 즉정하였다.
- 식물체의 추출 및 유효성분의 분리에 사용된 용매는 특급 또는 일급을 사용하였다. SiHca gel 칼럼 충진제는 Merck사의 Kiselgel 60(70-230, 230-400 mesh)을 사용하였고, 분리확인용 TLC는 Merck사의 No. 5715를 이용하였다. UV spectrum 은 Beckman UV/Vis spectrophotometer DU650 (USA), IR 은 Broker IFS66 FT-IR spectrophotometer (Germany)를 이용하여 KBr disc법으로 즉정하였다.
- 본 실험에 사용한 인체암 세포주는 UACC62 (melanoma), HCT15(colon adenocarcinoma), UO-31 (renal carcinoma), PC-3(prostate adenocarcinoma), 및 A549(lung carcinoma) 5종과 대조구로는 adriamycin을 사용하였으며, RPMI 1640배지(10% fetal calf serum, 1% penisillin/ streptomycin, 300mg#)를 사용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 부착된 세포를 배양병의 표면에서 떼어내고 무균 상태 하에서 각 well에 희석된 세포를 50#씩 가하여 동일 조건의 배양기에서 24시간 배양시켜 세포를 well 표면에 부착시키기 위해 48시간 배양시키고, 1% acetic acid로 세척하고 건조시켰다.
이론/모형
- 5715를 이용하였다. UV spectrum 은 Beckman UV/Vis spectrophotometer DU650 (USA), IR 은 Broker IFS66 FT-IR spectrophotometer (Germany)를 이용하여 KBr disc법으로 즉정하였다. Mass specttume JEOL JMS-700(Japan)을 사용하였다.
성능/효과
- Mass spectrum에서는 분자이온 peak가 m/ z 284(#)임을 확인하였으며, IR spectrum에서는 3417cm-1에서 OH, 1627cmT에서 free C=O를 각각 확인할 수 있었다. *H- NMR spectrum 에서 87.52(1H, s, H-4) 의 peak 와 meta coupHng을 하는 57.06(lH, s, H-2)의 peak가 관찰되었으며, 57.34(1H, d, J = 2.5 Hz, H-5)와 meta coupling을 하는 56.66(1H, d, J =2.5 Hz, H-7)의 peak도 관찰되었다. 그리고 83.
- 44(3H, s, CH)에서 aromatic methyl proton을 각각 확인할 수 있었다. 13C-NMR spectrum에서 5181.95 및 6190.87에서 carbonyl carbon인 9번, 10번 peak를 8162.61, 165.28에서 oxygenated carbon인 1번, 8번의 peak를 656.07에서 OCH, 의 peak와 622.13에서 CR의 peak를관찰했다. 4차탄소에 의해 연결이 이루어지지 않는 부분의 정보는 HMBCC로 long range couplings- 결정하였으며, 그 결괴는 Fig.
- eC-NMR과 DEPT 자료에서는 모두 30개의 carbon signal이 관찰되었는데 각 peak들은 거의 일치하는 chemical shifn로 쌍을 이루며 존재한다. 6191.65에서 carbonyl carbon인 9번, 9'번 peak 를 8162.12, 162.28, 161.84, 161.95 에서 oxygenated carbon인 1번, 8번, #번, 8번의 peak를 관찰하였고 14개의 quaternary carbon과 2개의 CH, 2개의 CH3가 있음을 확인했다. 'H-'H COSY spectrum에서 86.
- 쌍을 이루며 존재한다. 619L36에서 carbonyl carbon인 9번, 9'번 peak 를 5164.75, 164.68, 162.10, 162.00에서 oxygenated carbon인 8번, 8번, 1번, #번의 peak를 관찰하였고 16개의 quaternary carbon과 2개의 CH, 2개의 O* CH 그리고 2개의 CH3가 있음을 확인했다. #H COSY spectrum에서 66.
- 발색된다. Mass spectrum에서는 분자이온 peak가 m/ z 270(M+)임을 확인하였으며, IR spectrum에서는 3479cmT에서 OH, 1621 cnM에서 fee C=O를 각각 확인할 수 있었다. >H- NMR spectrum에서 57.
- 분리된 화합물 1, 2, 3, 4를 대상으로 인체암 세포주인 UACC62, HCT15, UO-31, PC-3 및 A549 5종에 대하여 in vivo에서의 세포독성을 SRB 방법으로 측정한 결과, Table 2에 나타난 바와 같이 화합물 4는 모든 cell line에서 #값이 1.33 이하로 강한 암세포 성장 억제활성을 가지는 것으로 확인되었다. Kim 등#)의 화합물 2(emodin)에 대한 세포독성 보고가 있지만, 본 연구에서 사용한 세포주에서는 세포독성을 보이지 않았다.
- 2에 나타내었다. 이상의 결과로 화합물 D 는 아wsophanol-lOJO'-bianthrone으로 확인 동정하였다.
- 2에 나타내었다. 이상의 결과와 문헌을16) 비교하여 화합물 1은 l, 8-dihydroxy-6-methoxy-3-methylanthraquinone (physcion)으로 확인 동정하였다.
- 4차탄소에 의해 연결이 이루어지지 않는 부분의 정보는 HMBC로 long range coupling을 결정하였다. 이상의 결과와 문헌을I© 비교하여 화합물 2는 1, 6, 8- tryhydroxy-3-methylantmaquinone(emodine)으로 확인 동정하였고, 그 결과는 Fig. 1에 나타내었다.
후속연구
- Kim 등#)의 화합물 2(emodin)에 대한 세포독성 보고가 있지만, 본 연구에서 사용한 세포주에서는 세포독성을 보이지 않았다. 그러나 이러한 anthraquinone 유도체의 항암활성에 대한 보고와 본 연구 결과로서 anthraquinone 유도체와 암세포 성장억제 활성과 밀접한 관계가 있는 것으로 사료되며, 계속적인 참소리쟁이의 성분연구와 그 생리활성 연구가 진행되어야 할 것이다.
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