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문제 정의
- 본 연구에서는 BALB/c 마우스의 등과 귀의 피부에 2,4- dinitrochlorobenzene (DNCB)를 주기적으로 발라 아토피를 유발시킨 모델에서 참소리쟁이 뿌리의 물추출물(RJWE)이 어떤 기전으로 아토피를 억제하는지 알아보기 위해 RJWE를 경구투여 및 피부적용 후 관찰하였다.
제안 방법
- 24시간 후 마우스 마리당 1% DNCB 100 µl 를 4일간 연속으로 등 부분과 양쪽 귀 뒤쪽에 도포하여 아토피피부염을 유발하였다.
- 실험에 사용하기 전까지 -70℃ 냉동고에서 보관하였다. Balb/c 마우스의 혈청에서의 IgE 농도는 enzyme-linked immunosorbent assay kit (Shibayagi사)를 사용하여 측정하였다. 각 96 well plates에 마우스에서 취한 혈청 5 µl와 dilution buffer 45 µl를 혼합하여 각각의 well에 50 µl를 분주하고 실온에서 shaker에 올려 2시간 동안 방치한 후 washing buffer solution으로 5분씩 3회 세척하였다.
- DNCB 도포를 멈추고 3일 경과후, 0.5% DNCB 100 µl를 주 3회 2주동안 동일한 부위에 고르게 도포하여 아토피피부염이 지속되도록 하였다.
- DNCB 용액을 도포함과 동시에 시료를 경구투여하고 피부도포 한 마우스의 등피부에 나타난 아토피 증상을 관찰하였다. 정상군의 피부는 깨끗하였고 아토피군에서는 홍반, 부종, 인설, 가피, 태선화 등의 다양한 아토피 증상이 뚜렷하게 나타났으며 저농도(12.
- DNCB를 도포하지 않으면서 정제수 100 µl를 경구투여한 정상군 4마리, DNCB를 도포하며 정제수 100 µl를 경구투여하고 친수바셀린만 바른 아토피군 4마리, DNCB를 도포하며 저농도의 추출물을 경구투여(12.5 mg/kg)와 피부 도포(0.5 mg/mouse)를 병행 한 시료투여군 4마리, 고농도의 추출물을 경구투여(25.0 mg/kg)와 피부도포(1.0 mg/mouse) 를 병행 한 시료투여군 4마리를 사용하였다.
- DNCB에 대한 마우스의 면역반응을 검토하기 위하여 실험종료일에 마우스를 희생하여 조직과 혈액을 채취한 후 비장을 적출하여 무게를 측정하였다 (Table I). 아토피군의 비장무게는 정상군에 비해 약 2배 증가하였고, 시료투여군은 아토피군에 비해 각각 23.
- DNCB에 의한 유발된 아토피피부에서 비만세포의 침윤을 관찰하기 위해 등피부조직을 Alcian blue로 염색하여 비만세포를 관찰하였다 (Fig. 5). 정상군은 비만세포의 수가 7.
- DNCB의 감작과공격에 의해 아토피피부염이 발생한 Balb/c 마우스에서 생성된 혈청중 IgE 농도를 ELISA로 측정하였다. 정상군에서의 IgE의 농도는 286.
- 이러한 비만세포 침윤 및 탈과립을 RJWE가 유의하게 억제하였다. RJWE가 비만세포로부터 탈과립을 억제하는지 검토하기 위해 복강비만세포를 이용하여 in vitro 실험을 하였다. 복강비만세포를 RJWE로 전처리 한 후 compound 48/80으로 자극하였을 때 히스타민의 유리가 현저하게 억제되는 것으로 보아 RJWE가 피부조직중에서 탈과립을 억제하여 아토피증상을 완화했을 것으로 판단된다.
- RJWE의 in vivo 아토피 억제효과가 비만세포 탈과립의 억제효과인지를 검토하기 위해 in vitro에서 복강비만세포를이용하여 히스타민 유리 억제효과를 검토하였다. 정상 복강비만세포를 compound 48/80으로 처리하였을 때 90.
- 마우스의 귀두께는 실험 시작부터 종료하는 날까지 이틀에 한번 씩 측정하였다. 아토피군은 귀의 두께가 현저하게 증가하였으며, 시료투여군은 고농도군(25.
- 5,13) 본 연구에서도 DNCB에 의해 혈청 총 IgE 농도가 현저하게 증가하였으며, RJWE가 이러한 혈청 총 IgE 농도의 증가를 유의성 있게 억제하였음을 확인하였다. 본 연구에서는 Th2의 사이토카인인 IL-4의 생성을 확인하는 대신 실험종료 후 비장의 무게를 측정하였다. 아토피군의 비장무게가 정상군의 것보다 2배 증가한 것으로 보아 DNCB에 의한 T림프구가 현저하게 증가하였음을 알 수 있었다.
- 5% DNCB 100 µl를 주 3회 2주동안 동일한 부위에 고르게 도포하여 아토피피부염이 지속되도록 하였다. 시료는 실험시작부터 매일 투여하였다 (Fig. 1).
- 실험 시작일부터 종료일까지 마우스의 체중을 측정하였다. 실험 시작일에 확인한 실험동물의 체중은 평균 23~25 g으로 각 군 사이에 차이가 없었다.
- 귀 두께(ear swelling)는 vernier calipers(Mitutoyo, Japan)를 사용하였다. 실험 종료일에 마우스를 희생시킨 다음 비장을 꺼내어 무게를 측정하였다.
- 실험의 시작과 함께 마우스 등 피부 조직의 외형적 변화를 3주동안 관찰하였다. 실험의 시작과 함께 마우스 등 피부 조직의 외형적 변화(홍반, 가려움, 건조피부, 부종, 짓무름 및 태선화)를 관찰하면서 체중 및 귀 두께 변화를 측정하였다. 귀 두께(ear swelling)는 vernier calipers(Mitutoyo, Japan)를 사용하였다.
- 실험의 시작과 함께 마우스 등 피부 조직의 외형적 변화를 3주동안 관찰하였다. 실험의 시작과 함께 마우스 등 피부 조직의 외형적 변화(홍반, 가려움, 건조피부, 부종, 짓무름 및 태선화)를 관찰하면서 체중 및 귀 두께 변화를 측정하였다.
- 2 %이었다. 이 건조엑스를 이용하여 경구투여용 액제를 조제하였고, 피부 도포용 친수바셀린 연고제를 제조하였다.
- 정제된 비만세포에 0.1% FBS를 포함하는 Tyrode 완충용액 A (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 1.1 mM MgCl2, 11.9 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO, 5.6 mM glucose, PH 7.2)를 가하고 조심스럽게 피펫팅하여 2×105세포씩 분주한 다음 37℃에서 20분 동안 배양하고 시료를 37℃에서 20분 동안 처리한 다음 compound 48/80 (5 µg/ ml)을 30분 동안 처리하였다.
- 그 조직을 파라핀으로 포매하고 5 µm 두께로 절단하여 사용하였다. 조직중의 비만세포(mast cell)는 alcian blue로 염색하여 관찰하였다. Alcian blue에 양성인 비만세포는 100배율에서 1개의 graticule안에 있는 세포를 count하여 세포수/mm2로 표현하였다.
- 흰쥐 복강에 30 ml 정도의 Tyrode 완충 용액 B (137 mM NaCl, 5.3 mM 글루코스, 12 mM NaHCO3, 2.7 mM KCl, 0.3 mM NaH2PO4, PH.7.4)를 주입하고 복부를 90초 정도 마사지 한 후 복막을 조심스럽게 열어서 파스퇴르 피펫으로 복강 내 세포가 함유된 Tyrode 완충용액 B를 수거하였다. 150 × g, 10분 동안 원심 분리하여 세포를 침전 시키고 침전된 세포에 Tyrode 완충용액 B를 가하여 피펫팅한 후 percoll density gradient법으로 비만세포만을 얻었다.
대상 데이터
- 0 mg/mouse) 를 병행 한 시료투여군 4마리를 사용하였다. 8주령 수컷 Balb/c 마우스의 등 부위를 깨끗하게 제모한 후 제모 과정에서 발생할 수 있는 피부의 미세 상처가 치유되도록 24시간 방치하였다. 24시간 후 마우스 마리당 1% DNCB 100 µl 를 4일간 연속으로 등 부분과 양쪽 귀 뒤쪽에 도포하여 아토피피부염을 유발하였다.
- 150 × g, 10분 동안 원심 분리하여 세포를 침전 시키고 침전된 세포에 Tyrode 완충용액 B를 가하여 피펫팅한 후 percoll density gradient법으로 비만세포만을 얻었다. 분리된 비만세포는 alcian blue염색에서 95% 이상, trypan blue염색에서 97% 이상의 경우 실험에 사용하였다. 정제된 비만세포에 0.
- 모든 동물군에는 자유로운 식이와 식수를 제공하였다. 실험동물은 총 16마리를사용하였으며 4군으로 나누어 각 실험군을 4마리씩 배정하였다. DNCB를 도포하지 않으면서 정제수 100 µl를 경구투여한 정상군 4마리, DNCB를 도포하며 정제수 100 µl를 경구투여하고 친수바셀린만 바른 아토피군 4마리, DNCB를 도포하며 저농도의 추출물을 경구투여(12.
- 실험에서 사용한 아토피 유발 시약인 DNCB(Junsei Chemical Co., Ltd)를 1%와 0.5%의 농도가 되도록 용매(acetone : olive oil = 4 : 1 혼합)에 용해하여 제조하였다. 이 실험에 사용한 참소리쟁이(Rumecis Radix) 는 건재상에서 구입하여 원광대학교 권동렬 교수님의 감정후 사용하였으며, 원광대학교 한약연구소에 보관되어 있다(No.
- 5%의 농도가 되도록 용매(acetone : olive oil = 4 : 1 혼합)에 용해하여 제조하였다. 이 실험에 사용한 참소리쟁이(Rumecis Radix) 는 건재상에서 구입하여 원광대학교 권동렬 교수님의 감정후 사용하였으며, 원광대학교 한약연구소에 보관되어 있다(No. 09-01-02). 건조한 참소리쟁이 200 g에 정제수 2L를 넣고 전기 약탕기에 2시간 달여 약액을 추출하였고, 추출한 용액을 감압농축기로 농축한 후 동결건조기로 건조하였다.
- 이 실험에서 사용한 실험동물은 8주령된 수컷 BALB/c mice(23±3 g)로, 중앙실험동물(주)에서 공급 받아 실험동물 사육장에서 1주일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험결과는 평균±표준편차로 표시하였고, 통계적 유의성 검정은 Student's t-test로 처리하였다.
이론/모형
- 150 × g, 10분 동안 원심 분리하여 세포를 침전 시키고 침전된 세포에 Tyrode 완충용액 B를 가하여 피펫팅한 후 percoll density gradient법으로 비만세포만을 얻었다.
- 반응 종료 후 400×g에서 원심분리하여 상등액과 세포를 분리하였다. 히스타민 정량은 ophthaldialdehyde(OPA) spectrofluorometry 방법으로 438 nm에서 측정하였다. 히스타민 유리 억제율(%)은 다음과 같이 계산하였다.
성능/효과
- 결론적으로 RJWE가 비만세포의 침윤과 IgE에 의한 탈과립을 억제하여 DNCB로 유발한 BALB/c 마우스의 아토피증상을 억제한 것으로 보아 비만세포의 역할이 중요함을 알 수 있었다.
- RJWE가 비만세포로부터 탈과립을 억제하는지 검토하기 위해 복강비만세포를 이용하여 in vitro 실험을 하였다. 복강비만세포를 RJWE로 전처리 한 후 compound 48/80으로 자극하였을 때 히스타민의 유리가 현저하게 억제되는 것으로 보아 RJWE가 피부조직중에서 탈과립을 억제하여 아토피증상을 완화했을 것으로 판단된다.
- 아토피피부염은 T 림프구, 비만세포 및 호산구와 같은 면역세포의 침윤과 활성이 매우 중요하다고 제안되어 왔다. 본 연구에서도 아토피 피부조직에서 비만세포를 다수 확인하였으나 alcian blue 염색의 크기가 시료투여군보다 작은 것으로 보아 탈과립이 있음을 알 수 있었다. 이러한 비만세포 침윤 및 탈과립을 RJWE가 유의하게 억제하였다.
- 시료를 저농도로 경구투여하고 연고를 도포한 시료투여군은 40±5.35개였고 고농도군은 42.75±2.75개로 정상군에 비해서는 높았으나 아토피군에 비해서는 유의성 있게 낮았다(Table III).
- 시료투여군의 경우, 저농도군 (12.5 mg/kg)에서는 1180±250.59 ng/ml이었고, 고농도군(25.0 mg/kg)에서는 1169.33±120.55 ng/ml로 아토피군에 비해 유의하게 억제하였다 (Table II).
- 실험 시작일에 확인한 실험동물의 체중은 평균 23~25 g으로 각 군 사이에 차이가 없었다. 실험을 진행하는 동안 아토피군은 정상군에 비해 현저하게 체중이 감소하였고, 저농도와 고농도의 시료투여군은 아토피군에 비해 체중감소가 크지 않았고, 저농도군이 고농도군보다 체중감소를 더 억제하는 것처럼 나타났으나 유의성은 없었다(Fig. 3).
- 마우스의 귀두께는 실험 시작부터 종료하는 날까지 이틀에 한번 씩 측정하였다. 아토피군은 귀의 두께가 현저하게 증가하였으며, 시료투여군은 고농도군(25.0 mg/kg)과 저농도군(12.5 mg/kg) 모두 귀의 부종이 정상군 수준으로 현저하게 억제되었다 (Fig. 4).
- 본 연구에서는 Th2의 사이토카인인 IL-4의 생성을 확인하는 대신 실험종료 후 비장의 무게를 측정하였다. 아토피군의 비장무게가 정상군의 것보다 2배 증가한 것으로 보아 DNCB에 의한 T림프구가 현저하게 증가하였음을 알 수 있었다. 이러한 T 림프구의 증가도 RJWE를 처리하였을 때 억제되었다.
- DNCB에 대한 마우스의 면역반응을 검토하기 위하여 실험종료일에 마우스를 희생하여 조직과 혈액을 채취한 후 비장을 적출하여 무게를 측정하였다 (Table I). 아토피군의 비장무게는 정상군에 비해 약 2배 증가하였고, 시료투여군은 아토피군에 비해 각각 23.4%, 29.5%를 억제하였다.
- 아토피환자와 같이 본 연구에서 사용한 DNCB로 유발한 BALB/c 아토피 모델에서도 피부에 홍반, 건조피부, 부종 등이 나타났고, 이러한 아토피 증상을 RJWE가 유의성 있게 억제하였다. 체중변화에는 유의성은 없었으나 귀부종도 유의하게 억제하였다.
- 이러한 T 림프구의 증가도 RJWE를 처리하였을 때 억제되었다. 이러한 결과들로부터 RJWE처리가 T 림프구의 활성을 억제함으로써 혈청총 IgE농도를 감소시켰을 것으로 생각된다.
- 정상 복강비만세포를 compound 48/80으로 처리하였을 때 90.20±20.29 ng/ml로 약 4.5배 히스타민 유리가 증가하였으며, RJWE (0.1 µg/ml과 1 µg/ml)를 처리하였을 때 유리된 히스타민은 49.91±4.79 ng/ml과 47.56±8.88 ng/ml로 각각 44.67%와 47.27%의 억제율을 나타내었다 (Fig.6).
- DNCB 용액을 도포함과 동시에 시료를 경구투여하고 피부도포 한 마우스의 등피부에 나타난 아토피 증상을 관찰하였다. 정상군의 피부는 깨끗하였고 아토피군에서는 홍반, 부종, 인설, 가피, 태선화 등의 다양한 아토피 증상이 뚜렷하게 나타났으며 저농도(12.5 mg/kg)와 고농도(25.0 mg/kg)의 시료투여군에서는 아토피군에 비해 아토피 증상이 현저하게 억제되었다(Fig. 2).
- 아토피환자와 같이 본 연구에서 사용한 DNCB로 유발한 BALB/c 아토피 모델에서도 피부에 홍반, 건조피부, 부종 등이 나타났고, 이러한 아토피 증상을 RJWE가 유의성 있게 억제하였다. 체중변화에는 유의성은 없었으나 귀부종도 유의하게 억제하였다. Lee 등12)은 Rumecis Radix가 picryl chloride로 유발한 Nc/Nga 아토피 마우스에서 염증세포의침윤과 혈청 총 IgE 및 IL-4의 생성을 억제하여 아토피증상을 억제한 것으로 보고하였다.
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