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문제 정의
- 23)또한 no는 superoxide anion과 반응하여 강력한 세포독성을 갖는 peroxynitrite 라디칼을 생성하기 때문에,24) NO에 대한 소거능 등의 제어활성은 건강기능적 측면에서 매우 중요하다. 본 실험에서는 in vitroe- 배양세포계에서 버섯추출물의 NO 소거능을 조사하였다. 먼저 in 에서 시료의 NO 소거 활성을 NO 생성에 있어서 전자수용체로 작용하는 nitrite에 대한 소거 활성을 지표로 측정하였다.
- 본 연구의 목적은 시장에서 상품성을 상실한 갈변화 표고버섯을 건강기능성 가진 가공식품으로 활용할 수 있는 가능성을 탐색하는데 있다. 이와 같은 목적의 일환으로 표고버섯의 갈변화가 건강기능성 생리활성의 가장 기초적 지표인 항산화 활성에 미치는 영향을 ferricyanide의 환원도를 지표로 한 환원력을 측정하여 조사하였다.
제안 방법
- 우선 in vitrne 실험계에서 NO의 소거활성은 Kato13) 등의 방법에 기초하여 다음과 같이 측정하였다. 1 mM NaNO2 용액 1 mM] 적당량의 시료를 첨가하고, 0.1 N HCl(pH 1.2)과 0.1 M 구연산 완충용액을 사용하여 반응용액의 pH를 1.2로 조정하였다. 반응액의 용량을 10 ml로 조정한 다음, 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 반응액 중 1ml 취하여 여기에 초산용액 5* n을 첨가하였고 다시 여기에 0.
- 갈변반응에 의한 환원력 변화. Ferricyande(Fe+3)가 시료에 의한 환원으로 생성된 ferrocyanide(Fe+2)를 비색정량하는 방법으로 시료의 전자공여능인 환원력을 측정하여 항산화활성을 평가하였다. 본 실험에서는 신선한 생표고버섯, 건조표고버섯, 갈변화된 표고버섯에서 각각 열수 및 70% 에탄올로 추출한 분획물의 투여량 별 환원력을 측정하였고 그 활성을 인공항산화제인 BHT와 비교 .
- 결과, 열수추출물이 에탄올 추출물에 비하여 전반적으로 NO 소거능이 높았으며, 갈변 표고버섯의 NO 소거능은 생표고버섯에 비하여 열수추출물은 60%, 에탄올 추출물은 72% 정도 높았다(Table 2). In vitro의 NO 소거 활성이 세포수준에서도 작용하는지를 LPS로 자극된 RAW264.7 세포의 NO 생성에 대한 제어효과로 측정하였다. Fig.
- MTT assay에 의한 세포독성 검정. Mitocondrial dehydrogenase activity의 index를 나타내는 MTT colorimetric reduction assay 를 수행하여 추출물이 세포 생존율에 미치는 영향을 측정하였다.'5)RAW264.
- Nitric oxide (NO) 소거활성 측정. NO 소거활성은 in vitro 와 배양세포계를 이용한 실험계에서 모두 측정하였다. 우선 in vitrne 실험계에서 NO의 소거활성은 Kato13) 등의 방법에 기초하여 다음과 같이 측정하였다.
- 7세포를 ATCC(Manassas, VA, USA)에서 구입하여, 공급자의 지시대로 10% fetal bovine serum이 함유된 RPMI 1640 media에서 계대 배양하였다. NO 소거활성을 측정하기 위하여 지시세포를 96-well에 1x105 cells/mZ로 분주하고 100ng/mZ의 LPS(lipopolysaccharide)로 세포를 자극하면서 동시에 적당량의 시료를 반응계에 첨가하여 37℃, 48시간 동안 5% C0의 공기조건에서 배양하였다. 배양 후, 상징액 lOOμl를 회수하고 여기에 동량의 Griess solution을 첨가하여 15분간 방치한 다음 상징 액의 발색도를 microplate reader(Model 550, BioRad, USA)를 사용하여 570 nm 및 650 nme 흡광도로 측정하였다.
- 8 mZ의 Table 1. The reducing power of the oak mushroom extracts B buffer(60mM NeHPQ, lOmM KC1, 40mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 50 mM (3~mercaptoethanol, pH 7.0)를 첨가하고, 여기에 L6mg의 ONPG를 첨가하여, 37℃에서 30분간 반응시켰고, N&CQ의 첨가로 반응을 정자시킨 후, UV/VIS spectrophotometer(V-550, JASCO, Japan)로 420 nm의 흡광 도로변 이원성의 발현도인 ^-galactosidase의 활성을 측정하였다. 지시 세포 수를 측정하기 위호}여 E.
- 5 cm 두께로 잘라서 401에서 열풍 처리하여 건조표고버섯을 제조하였으며, 신선 생표고버섯에 적당히 물을 뿌리면서, 30P에서 일주일간 갈변 반응을 일으켜 외견상 상품가치를 떨어뜨린 갈변표고버섯을 제조하였다. 각각의 시료에 10배량의 탈이온수를 첨가하여 4시간 autoclave로 추출한 추출액을 여과지 (Whatman No. 1)로 여과 후, 감압 건조시켜 100mg/mZ의 농도로 만든 것을 열수 추출물분획으로 하였다. 동일한 시료에 5배량의 70% 에탄올로 80℃ 에서 3시간 reflux 처리한 다음, 같은 방법으로 건조시켜 DMSO로 100mg/mZ으로 조절한 것을 에탄올 추출분획으로 하였다.
- 1)로 여과 후, 감압 건조시켜 100mg/mZ의 농도로 만든 것을 열수 추출물분획으로 하였다. 동일한 시료에 5배량의 70% 에탄올로 80℃ 에서 3시간 reflux 처리한 다음, 같은 방법으로 건조시켜 DMSO로 100mg/mZ으로 조절한 것을 에탄올 추출분획으로 하였다. 각 추출분획은 -20℃에 냉동보관하면서 사용하였다.
- 26% 최근 동맥경회증성 병반의 진행에 대식세포의 MMP9의 과다발현이 중요한 병리학적 소인임이 알려져 있지만, MMP9의 일차적인 역할은 주로 세균인 감염체의 막 성분을 인식한 대식세포가 조직의 감염부위로 침윤하여 세균을 제거하는데 있다. 따라서 본 실험에서는 대식세포주인 RAW264.7 세포를 대상으로 각 버섯추출물의 처리가 LPS의 자극으로 유도되는 MMP9의 발현에 미치는 영향을 조사하였고 그 결과를 Fig. 3에 정리하였다. 결과에서 보듯이 LPS만을 처리한 대조구의 세포에서는 92kDa의 MMP9의 활성이 관찰되었다.
- 이와 같은 목적의 일환으로 표고버섯의 갈변화가 건강기능성 생리활성의 가장 기초적 지표인 항산화 활성에 미치는 영향을 ferricyanide의 환원도를 지표로 한 환원력을 측정하여 조사하였다. 또한 감염 및 종양면역계에서 중심적인 역할을 담당하는 세포인 대식세포의 기능을 측정하는 지표로서 NO 및 MMP9 생성 제어활성을 측정하였고, 화학적 돌연변이 원에 의하여 유발된 돌연변이에 대한 억제활성을 조사함으로써 종양 발생의 첫 단계를 억제할 수 있는지 여부를 평가하였다. 실험 결과, 갈변표고버섯의 환원력이 생표고버섯이나 건조 표고버섯보다 높은 것으로 보아, 항산화활성은 오히려 갈변반응에 의하여 증가된다는 것과 항산화활성이 보고된 phenolic compound 의 함량이 갈변반응으로 유의하게 증가된다는 사실을 알았다.
- 본 실험에서는 in vitroe- 배양세포계에서 버섯추출물의 NO 소거능을 조사하였다. 먼저 in 에서 시료의 NO 소거 활성을 NO 생성에 있어서 전자수용체로 작용하는 nitrite에 대한 소거 활성을 지표로 측정하였다. 결과, 열수추출물이 에탄올 추출물에 비하여 전반적으로 NO 소거능이 높았으며, 갈변 표고버섯의 NO 소거능은 생표고버섯에 비하여 열수추출물은 60%, 에탄올 추출물은 72% 정도 높았다(Table 2).
- 1%의 FeCl3 100μl를 넣어서 발색반응을 유도하였다. 반응 후 반응액의 발색 정도는 UV/ VIS spectrophotometer(V-550, JASCO, Japan)# 사용하여 700 nm에서의 흡광도를 측정하여 평가하였다.
- 6)로 30분간 gel를 세척하고 나서 20시간 이상 zymogram buffed] 보존하였다. 반응이 끝난 gel을 2.5% coomassie solution에서 염색한 후, destaining buffer(45% methanol, 10% acetic acid)로 탈색시켜 단백질 band를 확인하였고, band의 강도는 gel documentation system(LAS -1OOOCH, Fuji Film, Japan)을 사용하여 측정하였다.
- 배양이 끝나면 배양액에 의 MTT용액(Sigma Chemicals)을 50 B 첨가하고, 37P에서 3시간 처리였다. 배지를 제거하고 150μl의 DMSO로 10분간 진탕시켜 세포 내에 들어간 색소를 충분히 용출시킨 다음, microplate reader(Model 550, Bio-Rad, USA)를 사용하여 570 nm와 690 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
- Ferricyande(Fe+3)가 시료에 의한 환원으로 생성된 ferrocyanide(Fe+2)를 비색정량하는 방법으로 시료의 전자공여능인 환원력을 측정하여 항산화활성을 평가하였다. 본 실험에서는 신선한 생표고버섯, 건조표고버섯, 갈변화된 표고버섯에서 각각 열수 및 70% 에탄올로 추출한 분획물의 투여량 별 환원력을 측정하였고 그 활성을 인공항산화제인 BHT와 비교 . 정리하여 Table 1에 나타내었다.
- 8)를 첨가하여 단백질 시료를 제조하였다. 시료를 1% gelatin이 포함된 10% acrylamide gel에서 전기영동으로 분획한 다음, renaturation buffer(2.5% Triton X-100)로 gel을 15분씩 3회 37<, C에서 완충시키고 다시 zymogram buffer(50 mM Tris, 10 mM CaCl2, 50 mM NaCl, pH 7.6)로 30분간 gel를 세척하고 나서 20시간 이상 zymogram buffed] 보존하였다. 반응이 끝난 gel을 2.
- 시료 및 시약. 신선한 생표고버섯을 0.5 cm 두께로 잘라서 401에서 열풍 처리하여 건조표고버섯을 제조하였으며, 신선 생표고버섯에 적당히 물을 뿌리면서, 30P에서 일주일간 갈변 반응을 일으켜 외견상 상품가치를 떨어뜨린 갈변표고버섯을 제조하였다. 각각의 시료에 10배량의 탈이온수를 첨가하여 4시간 autoclave로 추출한 추출액을 여과지 (Whatman No.
- 조절하였다. 여 기 에서 4 mZ을 취한 다음, wade reagent 1 ml 첨가하여 10분간 반응시킨 뒤 UV/VIS spectrophotometer(V-550, JASCO, Japan)를 사용하여 500nm에서 흡광도를 측정하였다. Phytic acid를 정량하기 위한 표준곡선은 Na-phytic acid를 표준물질로 사용하여 작성하였다.
- 2% HC1, 10% Na2SQ4) 용액을 첨가하여 2시간 동안 교반하였다. 여과처리로 고형물질을 제거한 용액 중 10 m/을 추]하고 여기에 12 m/의 FeCl3 용액을 첨가하여 75분간 중탕 가열하였다. 가열 후 실온에서 1시간 동안 식힌 후 3, 500 rpm에서 15분간 원심분리하여 얻어진 상징액에 탈이 온수를 사용하여 용량을 50 mlS.
- 9)따라서 갈변화에 의한 상품성의 상실이 전반적인 건강기능성의 상실과 직접적으로 연결되는지 여부를 보다 상세히 검정함으로써, 상품성의 상실로 폐기되어 왔던 갈변 표고버섯의 가공을 통하여 건강기능 식품의 소재로 전용하는 방법을 농가 소득의 안정적 확보 차원에서 탐색할 필요가 있다. 이에 본 연구에서는 갈변표고버섯 열수추출물 및 에탄올 추출물들의 환원력을 측정하여 항산화활성을 평가하고 함유된 페놀 화합물 및 피틴산의 함량을 측정하였으며, 대식세포의 NO 라디칼 및 MMP9 생성에 대한 제어효과와 더불어 화학적 돌연변이 원에 대한 항변이원성을 검정하였다.
- 있다. 이와 같은 목적의 일환으로 표고버섯의 갈변화가 건강기능성 생리활성의 가장 기초적 지표인 항산화 활성에 미치는 영향을 ferricyanide의 환원도를 지표로 한 환원력을 측정하여 조사하였다. 또한 감염 및 종양면역계에서 중심적인 역할을 담당하는 세포인 대식세포의 기능을 측정하는 지표로서 NO 및 MMP9 생성 제어활성을 측정하였고, 화학적 돌연변이 원에 의하여 유발된 돌연변이에 대한 억제활성을 조사함으로써 종양 발생의 첫 단계를 억제할 수 있는지 여부를 평가하였다.
- 총 폴리페놀 화합물의 함량은 Swaine과 Hills의 방법11)을 수정하여 다음과 같이 측정하였다. 즉 0.5 m/의 시료용액(lmg/m/)을 6.5 mZ 증류수에 희석하고, 여기에 Folin-ciocalteu's phenol reagent(Sigma사)를 0.5 mZ 첨가하여, 3분간 방치한 다음, 1 mZ의 sodium carbonate 포화용액을 첨가하여 전체 반응용량을 10 m로 조정하였다. 반응액을 실온에서 1시간 방치시킨 후, 반응액의 발색정도를 725 nm에서의 흡광도로 측정하였다.
- 0)를 첨가하고, 여기에 L6mg의 ONPG를 첨가하여, 37℃에서 30분간 반응시켰고, N&CQ의 첨가로 반응을 정자시킨 후, UV/VIS spectrophotometer(V-550, JASCO, Japan)로 420 nm의 흡광 도로변 이원성의 발현도인 ^-galactosidase의 활성을 측정하였다. 지시 세포 수를 측정하기 위호}여 E. coil의 house keeping 단백질 중 하나인 alkaline phosphatase의 활성을 측정하였고, alkaline phosphatase의 활성에 대한 p-galactosidase 활성의 비율로 유도 값(R)을 평가하였다.
- 페놀화합물 함량의 측정. 총 폴리페놀 화합물의 함량은 Swaine과 Hills의 방법11)을 수정하여 다음과 같이 측정하였다. 즉 0.
- 피틴산 (phytic acid) 함량의 측정. 추출물에 함유된 phytic acid의 양은 Haug12)의 방법을 약간 수정하여 다음과 같이 측정하였다. 시료에 50mZ의 용액(1.
- 반응액을 실온에서 1시간 방치시킨 후, 반응액의 발색정도를 725 nm에서의 흡광도로 측정하였다. 측정된 흡광도에 근거하여 시료 중 페놀 화합물의 양을 결정하기 위해서 gallic acid(Sigma사)를 표준물질로 표준곡선을 작성하였다.
- 1에 나타난 것처럼 생표고버섯과 건조표고버섯 간에는 페놀화합물의 함량에 차이가 보이지 않은 반면, 갈변 표고버섯은 생표고버섯에 비하여 페놀화합물의 함량이 약 73% 증가한 것으로 측정되었다. 한편, 천연물 성분 중 인산화 inositol 계열의 세포 내 신호전달 조절기능으로 근래에 주목을 받고 있을 뿐 아니라 항산화활성도 보고된 phytic acid 함량 변화에 미치는 갈변반응의 효과에 대하여 조사하였다.21,22) 그 결과, 갈변 반응으로 인한 phytic acid의 함량 변화는 없었지만 건조처리에 의하여 2배 이상 증가하는 현상을 발견하였다.
- 영향. 활성산소종(ROS)와 더불어 활성질소종(RNS) 중 대표적인 nitric oxide(NO)에 대한 각 표고버섯 추출물의 소거 활성을 조사하였다. NO는 면역세포인 대식세포에서 항균활성 및 세포 신호전달에 있어서 중요한 역할을 담당하고 있고, 면역계 세포 이외에서도 세포 신호전달물질로 그 역할이 알려지고 있다.
- 7 세포를 적당량의 시료를 처리한 후, 48시간 동안 37℃의 5% CO2를 포함한 포화 습도 공기에서 배양호]였다. 회수한 상징액 중 100 g® 취하고 여기에 동량의 비환원조건의 sample buffer(50 mM Tris-Cl, 2% SDS, 0.1% bromophenol blue, 10% glycerol, pH 6.8)를 첨가하여 단백질 시료를 제조하였다. 시료를 1% gelatin이 포함된 10% acrylamide gel에서 전기영동으로 분획한 다음, renaturation buffer(2.
대상 데이터
- 각 추출분획은 -20℃에 냉동보관하면서 사용하였다. Ascorbic acid, a-tocopherol, BHT(butylated hydroxytoluene), ONPG(o-nitrophenyl p-D-galactosidase), PNPP(p-nitrophenyl phosphate), mitomycin C, 등은 Sigma Chemicals(St. Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였고, ampicilline 영진약품의 주사용 펜브락스를 멸균수로 희석하여 사용하였으며, bactotrypton, yeast extract 등과 같은 세균 배양을 위한 배지용 시약은 Difco-BRL사(Bethesda, MD, USA)의 제품을 사용하였다. SOS chromolest의 지시균주인 Escherichia coli PQ 37[plasmid pKM 101, sfi:Mud(AP lac), lacMJ 169, mar, urvA, galE, galY, #, uc srl300::Tnl0]은 서울대학교 천연물화학연구소에서 분양받았고 LB broth(bactotryptone 1%, yeast extract 0.
- Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였고, ampicilline 영진약품의 주사용 펜브락스를 멸균수로 희석하여 사용하였으며, bactotrypton, yeast extract 등과 같은 세균 배양을 위한 배지용 시약은 Difco-BRL사(Bethesda, MD, USA)의 제품을 사용하였다. SOS chromolest의 지시균주인 Escherichia coli PQ 37[plasmid pKM 101, sfi:Mud(AP lac), lacMJ 169, mar, urvA, galE, galY, #, uc srl300::Tnl0]은 서울대학교 천연물화학연구소에서 분양받았고 LB broth(bactotryptone 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 1%, ampicillin+)에서 배양하였다. 동물세포배양^ 사용된 배지, fetal bovine serum(FBS) 및 염류용액은 모두 Life Technologies (Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다.
- 5%, NaCl 1%, ampicillin+)에서 배양하였다. 동물세포배양^ 사용된 배지, fetal bovine serum(FBS) 및 염류용액은 모두 Life Technologies (Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다.
- 동물 배양세포계에서의 소거활성은 Murakami 등의 방법14) 에 의하여 측정하였다. 지시세포로서는 생쥐의 대식세포 세포주인 RAW 264.7세포를 ATCC(Manassas, VA, USA)에서 구입하여, 공급자의 지시대로 10% fetal bovine serum이 함유된 RPMI 1640 media에서 계대 배양하였다. NO 소거활성을 측정하기 위하여 지시세포를 96-well에 1x105 cells/mZ로 분주하고 100ng/mZ의 LPS(lipopolysaccharide)로 세포를 자극하면서 동시에 적당량의 시료를 반응계에 첨가하여 37℃, 48시간 동안 5% C0의 공기조건에서 배양하였다.
이론/모형
- 환원력 (reducing power)의 측정. Oyaizu 등의 방법에 의거하여 환원력을 측정하였다. 간단히 설명하면, 적당량의 추출물을 포함한 시료 20μl를 50 mM 인산 완충액 (pH 6.
- 표고버섯 추출물의 세포독성. RAW264.7 세포에서 나타난 NO 생성에 대한 제어활성의 치-이가 각 추출물에 의한 세포독성에 기인할 가능성이 있기 때문에, 추출물의 세포독성을 RAW264.7 세포를 지시세포로 사용하여 MTT법으로 측정하였다. 측정 결과(Table 3), 10 μg/m/에서는 세포가 93% 이상의 생존율을 보였지만 100μg/m/의 시료 농도에서 생표고버섯과 건조 표고버섯 열수추출물 처리 시의 세포생존율은 50% 수준까지현저히게 낮아졌다, 그러나 갈변표고버섯의 경우 열수추출물 및 에탄올 추출물의 세포생존율이 각각 92%와 83%로서, 세포독성이 오히려 낮아진 것을 볼 수 있었다.
- Zymography. zymogram을 이용한 시료의 MMP활성은 Birkedal-Hansen과 Tylor의 방법16)에 따라 시행하였다. 96-well plate에 1x105 cell씩 분주한 RAW264.
- 갈변반응이 돌연변이 억제효과에 미치는 영향. 각 표고버섯추출물 분획에 대하여 직접변이원인 mitomycin C가 유발하는 DNA의 돌연변이를 억제하는지 여부를 E. coli PQ37을 지시 세포로 SOS chromotest 기법으로 조사하였다. 실험 결과, 표고버섯 추출물의 돌연변이 억제활성은 시료의 첨가량에 의존하여 변화하였으며, 추출에 사용된 용매에 따른 항돌연변이원성의 차이는 관찰되지 않았다.
- 실온에서 반응이 끝나면 UV/VIS spectrophotometer(V-550, JASCO, Japan)를 사용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하여 잔존 아질산염을 백분율(%)로 나타내었다. 동물 배양세포계에서의 소거활성은 Murakami 등의 방법14) 에 의하여 측정하였다. 지시세포로서는 생쥐의 대식세포 세포주인 RAW 264.
- NO 소거활성은 in vitro 와 배양세포계를 이용한 실험계에서 모두 측정하였다. 우선 in vitrne 실험계에서 NO의 소거활성은 Kato13) 등의 방법에 기초하여 다음과 같이 측정하였다. 1 mM NaNO2 용액 1 mM] 적당량의 시료를 첨가하고, 0.
- 항변이원성 측정. 항변이원성은 E. coli PQ 37을 지시 균주로 사용한 SOS chromotest 기법을 이용하여 조사하였다.17,18) 37℃ 에서 LB배지에 하룻밤 진탕배양한 배양액을 동일한 액체배지로 10배수 희석하여, 37℃서 2시간 진탕배양하였다.
성능/효과
- 열수추출물이 LPS 에 의한 NO 생성을 증진시키는 것은 잉ucan이나 galatan 등 균사체 유래의 내재면역계 세포의 활성화물질이 열수에 의하여 효과적으로 추출되었기 때문으로 생각된다.25) 고농도(100|ig/in/) 의 추출물을 처리한 경우 갈변표고버섯의 NO 생성에 대한 제어 활성은 생표고버섯에 비하여 유의한 변화가 있었지만, 갈변 반응은 이와 같은 면역조절 polysaccharide이 보유한 생리활성의 급격한 변화를 일으키지는 않는 것으로 판단된다. 이상의 실험에서 갈변표고버섯 추출물은 NO 생성에 대한 제어작용에 있어서 고상품성의 표고버섯들과 동일한 경향을 나타낸다는 사실을 알 수 있었다.
- 대조구의 단백질 band intensity를 기준으로 시료와 LPS 를 동시에 처리한 실험구의 상대적인 band intensity를 측정한 결과, 표고버섯추출물 처리에 의하여 MMP9의 활성이 5-44% 정도 증가되는 것을 알 수 있었고, 특히 열수추출물에서 평균적으로 MMP9의 활성이 높게 나타났는데(lane 5, 6, 7 참조), 이 현상도 버섯추출물에 함유된 poly saccharide의 작용에 의한 것으로 보여진다.28)시료처리에 의한 MMP9의 활성증가도와 표고버섯의 갈변화 정도가 일치하지는 않았지만, 갈변 표고버섯도 고상 품성 의 표고버섯들과 마찬가지로 활성화 대식세포의 MMP9 생성을 증진시킨다는 것을 알았다.
- 천연물에서 항산화 활성의 발현에 페놀 화합물이 광범위하게 관여되어 있다고 알려져 있으며, 특히 버섯류에서 갈변반응에 의하여 melanoidine류의 폴리페놀 화합물이 생성된다고 보고됨에 따라19,20) 페놀 화합물의 함량변화를 조사하였다. Fig. 1에 나타난 것처럼 생표고버섯과 건조표고버섯 간에는 페놀화합물의 함량에 차이가 보이지 않은 반면, 갈변 표고버섯은 생표고버섯에 비하여 페놀화합물의 함량이 약 73% 증가한 것으로 측정되었다. 한편, 천연물 성분 중 인산화 inositol 계열의 세포 내 신호전달 조절기능으로 근래에 주목을 받고 있을 뿐 아니라 항산화활성도 보고된 phytic acid 함량 변화에 미치는 갈변반응의 효과에 대하여 조사하였다.
- 7 세포의 NO 생성에 대한 제어효과로 측정하였다. Fig. 2에 나타난 것처럼, 실험에 사용한 모든 시료처리농도에서 열수 추출물과 LPS의 동시 처리는 LPS의 단독 처리보다 NO 생성을 더욱 증진시키는 반면, 에탄올 추출물은 LPS와의 동시처리가 오히려 NO 생성을 억제하는 경향을 보였다. 특히 100 의 시료 농도에서 생표고버섯과 건조표고버섯의 열수 추출물은 LPS 단독처리에 비하여 NO의 생성을 약 81% 이상 증진시켰으며 , 생표고버섯, 건조표고버섯 >갈변표고버섯의 순서로 NO 생성을 증진시키는 효과를 보였다.
- 실험 결과, 갈변표고버섯의 환원력이 생표고버섯이나 건조 표고버섯보다 높은 것으로 보아, 항산화활성은 오히려 갈변반응에 의하여 증가된다는 것과 항산화활성이 보고된 phenolic compound 의 함량이 갈변반응으로 유의하게 증가된다는 사실을 알았다. In vitro에서의 NO 소거능도 갈변반응으로 증가되었으며 배양세포를 이용한 NO 생성 제어능도 상품성을 가진 생표고버섯과 동일한 경향을 보였을 뿐 아니라, 고농도의 추출물 처리조건에서 갈변표고버섯의 세포독성은 오히려 낮았다. 또한 mitomycin C에 의하여 유발된 돌연변이에 대한 억제활성도 갈변 반응으로 크게 변화하지 않았다.
- 먼저 in 에서 시료의 NO 소거 활성을 NO 생성에 있어서 전자수용체로 작용하는 nitrite에 대한 소거 활성을 지표로 측정하였다. 결과, 열수추출물이 에탄올 추출물에 비하여 전반적으로 NO 소거능이 높았으며, 갈변 표고버섯의 NO 소거능은 생표고버섯에 비하여 열수추출물은 60%, 에탄올 추출물은 72% 정도 높았다(Table 2). In vitro의 NO 소거 활성이 세포수준에서도 작용하는지를 LPS로 자극된 RAW264.
- 3에 정리하였다. 결과에서 보듯이 LPS만을 처리한 대조구의 세포에서는 92kDa의 MMP9의 활성이 관찰되었다. 대조구의 단백질 band intensity를 기준으로 시료와 LPS 를 동시에 처리한 실험구의 상대적인 band intensity를 측정한 결과, 표고버섯추출물 처리에 의하여 MMP9의 활성이 5-44% 정도 증가되는 것을 알 수 있었고, 특히 열수추출물에서 평균적으로 MMP9의 활성이 높게 나타났는데(lane 5, 6, 7 참조), 이 현상도 버섯추출물에 함유된 poly saccharide의 작용에 의한 것으로 보여진다.
- 32mg/mZ의 처리.농도에서 갈변표고버섯의 열수추출물이나 에탄올추출물은 생 표고버섯에 비하여 27~28% 정도 환원력이 증가하였고, 건조 표고버섯에 비해서도호환원력이 증가하는 것으로 나타났다. 이상의 실험 결과, 환원력을 지표로 한 시료의 항산화 활성은 갈변 표고버섯이 오히려 상품성을 가진 표고버섯들보다 우수함을 알 수 있었다.
- 결과에서 보듯이 LPS만을 처리한 대조구의 세포에서는 92kDa의 MMP9의 활성이 관찰되었다. 대조구의 단백질 band intensity를 기준으로 시료와 LPS 를 동시에 처리한 실험구의 상대적인 band intensity를 측정한 결과, 표고버섯추출물 처리에 의하여 MMP9의 활성이 5-44% 정도 증가되는 것을 알 수 있었고, 특히 열수추출물에서 평균적으로 MMP9의 활성이 높게 나타났는데(lane 5, 6, 7 참조), 이 현상도 버섯추출물에 함유된 poly saccharide의 작용에 의한 것으로 보여진다.28)시료처리에 의한 MMP9의 활성증가도와 표고버섯의 갈변화 정도가 일치하지는 않았지만, 갈변 표고버섯도 고상 품성 의 표고버섯들과 마찬가지로 활성화 대식세포의 MMP9 생성을 증진시킨다는 것을 알았다.
- 21,22) 그 결과, 갈변 반응으로 인한 phytic acid의 함량 변화는 없었지만 건조처리에 의하여 2배 이상 증가하는 현상을 발견하였다. 본 실험 결과는 표고버섯에 있어서 갈변반응에 따른 페놀화합물 함량의 증가를 통하여 갈변표고버섯의 항산화활성이 증가되었을 가능성을 시사한다.
- 경제적 측면에서도 전통적으로 기호성이 높고 소비시장 규모가 큰 고소득 작목이지만, 재배과정에서의 관리 부주의나 채취 후의 저장상태 및 기상악화로 인한 갈변화가 상품가치를 폭락시킨다는 점에서 관리 및 유통상의 어려움이 있다. 본 연구자들은 갈변 표고버섯 열수추출물과 70% 에탄올추출물의 superoxide anion과 hydroxyl radical에 대한 소거활성을 조사하여 갈변 표고버섯이 신선표고버섯보다 활성산소종 소거능이 우수하다는 결과를 얻은 바 있다.9)따라서 갈변화에 의한 상품성의 상실이 전반적인 건강기능성의 상실과 직접적으로 연결되는지 여부를 보다 상세히 검정함으로써, 상품성의 상실로 폐기되어 왔던 갈변 표고버섯의 가공을 통하여 건강기능 식품의 소재로 전용하는 방법을 농가 소득의 안정적 확보 차원에서 탐색할 필요가 있다.
- 66mg/m/2] 시료 처리조건에서 63%의 환원력 증가가 관찰되었다. 상품성 상실의 원인인 갈변화가 표고버섯의 환원력에 미치는 영향을 조사한 결과, 갈변표고버섯의 환원력은 추출 방법에 관계없이 상품성을 가진 생표고버섯이나 건조 표고버섯보다 유의하게 높았다. Table 1에서 보듯이 3.
- 또한 감염 및 종양면역계에서 중심적인 역할을 담당하는 세포인 대식세포의 기능을 측정하는 지표로서 NO 및 MMP9 생성 제어활성을 측정하였고, 화학적 돌연변이 원에 의하여 유발된 돌연변이에 대한 억제활성을 조사함으로써 종양 발생의 첫 단계를 억제할 수 있는지 여부를 평가하였다. 실험 결과, 갈변표고버섯의 환원력이 생표고버섯이나 건조 표고버섯보다 높은 것으로 보아, 항산화활성은 오히려 갈변반응에 의하여 증가된다는 것과 항산화활성이 보고된 phenolic compound 의 함량이 갈변반응으로 유의하게 증가된다는 사실을 알았다. In vitro에서의 NO 소거능도 갈변반응으로 증가되었으며 배양세포를 이용한 NO 생성 제어능도 상품성을 가진 생표고버섯과 동일한 경향을 보였을 뿐 아니라, 고농도의 추출물 처리조건에서 갈변표고버섯의 세포독성은 오히려 낮았다.
- coli PQ37을 지시 세포로 SOS chromotest 기법으로 조사하였다. 실험 결과, 표고버섯 추출물의 돌연변이 억제활성은 시료의 첨가량에 의존하여 변화하였으며, 추출에 사용된 용매에 따른 항돌연변이원성의 차이는 관찰되지 않았다. 특히 갈변표고버섯의 열수추출물 및 에탄올 추출물의 항돌연변이원성은 80 μg 및 160 pig의 투여량에서 각각 약 35 및 72%의 억제수준으로서, 동일한 조건에서 측정된 생표고버섯의 항변이원성인 39% 및 61% 억제와 유사한 수준이었다(Table 4).
- 특히 100 의 시료 농도에서 생표고버섯과 건조표고버섯의 열수 추출물은 LPS 단독처리에 비하여 NO의 생성을 약 81% 이상 증진시켰으며 , 생표고버섯, 건조표고버섯 >갈변표고버섯의 순서로 NO 생성을 증진시키는 효과를 보였다. 열수추출물의 경우는 100|ig/mZ의 시료처리 조건에서 생표고버섯의 NO 생성 억제 능이 약 44%로 가장 높았고 그 다음이 건조표고버섯 > 갈변 표고버섯의 순서였다(각각 34% 및 20% 억제). 열수추출물이 LPS 에 의한 NO 생성을 증진시키는 것은 잉ucan이나 galatan 등 균사체 유래의 내재면역계 세포의 활성화물질이 열수에 의하여 효과적으로 추출되었기 때문으로 생각된다.
- 특히 갈변표고버섯의 열수추출물 및 에탄올 추출물의 항돌연변이원성은 80 μg 및 160 pig의 투여량에서 각각 약 35 및 72%의 억제수준으로서, 동일한 조건에서 측정된 생표고버섯의 항변이원성인 39% 및 61% 억제와 유사한 수준이었다(Table 4). 이 결과는 표고버섯의 갈변화가 표고버섯에 내재된 돌연변이 억제활성물질의 활성의 변화를 일으키지 않는다는 사실을 가리킨다.
- 측정 결과(Table 3), 10 μg/m/에서는 세포가 93% 이상의 생존율을 보였지만 100μg/m/의 시료 농도에서 생표고버섯과 건조 표고버섯 열수추출물 처리 시의 세포생존율은 50% 수준까지현저히게 낮아졌다, 그러나 갈변표고버섯의 경우 열수추출물 및 에탄올 추출물의 세포생존율이 각각 92%와 83%로서, 세포독성이 오히려 낮아진 것을 볼 수 있었다. 이 사실은 Fig. 2에 나타난 각 표고버섯 추출물의 NO 생성에 대한 제어활성의 차이가 지시세포의 생존율과는 무관하며 오히려 갈변반응으로 표고버섯의 세포독성이 저하된다는 사실을 알았다.
- 농도에서 갈변표고버섯의 열수추출물이나 에탄올추출물은 생 표고버섯에 비하여 27~28% 정도 환원력이 증가하였고, 건조 표고버섯에 비해서도호환원력이 증가하는 것으로 나타났다. 이상의 실험 결과, 환원력을 지표로 한 시료의 항산화 활성은 갈변 표고버섯이 오히려 상품성을 가진 표고버섯들보다 우수함을 알 수 있었다.
- 또한 mitomycin C에 의하여 유발된 돌연변이에 대한 억제활성도 갈변 반응으로 크게 변화하지 않았다. 이상의 실험 결과로 볼 때, 갈변표고버섯은 미관상의 결함이외에는 생표고버섯 등 상품성이 있는 표고버섯과 건강기능성 측면에서 차이를 발견할 수 없었다. 이 사실은 현재 재배 및 저장과정에서 폐기되고 있는 갈변 표고버섯을 표고버섯분말이나 추출액 등 건강기능성 가공식품의 형태로 소비될 수 있는 하나의 가능성을 제시하며, 재배농가의 소득을 안정적으로 보장시켜줄 수 있다는 점에서 상당히 의미를 가지기 때문에 향후 안정성 확보를 위한 보다 세밀한 검정작업이 필요하다고 생각된다.
- 25) 고농도(100|ig/in/) 의 추출물을 처리한 경우 갈변표고버섯의 NO 생성에 대한 제어 활성은 생표고버섯에 비하여 유의한 변화가 있었지만, 갈변 반응은 이와 같은 면역조절 polysaccharide이 보유한 생리활성의 급격한 변화를 일으키지는 않는 것으로 판단된다. 이상의 실험에서 갈변표고버섯 추출물은 NO 생성에 대한 제어작용에 있어서 고상품성의 표고버섯들과 동일한 경향을 나타낸다는 사실을 알 수 있었다.
- 정리하여 Table 1에 나타내었다. 전반적으로 시료의 환원력은 추출방법에 관계없이 시료의 양이 증가함에 비례하여 증가하였고 3.32mg/mZ의 시료처리 농도에서 BHH와 비슷한 수준의 활성을 보였다. 추출방법에 따른 환원력의 차이를 조사한 결과, 열수추출물의 환원력이 에탄올추출물보다 높은 경향을 보였으며, 특히 건조표고버섯에 이런 경향은 뚜렷하여, 1.
- 32mg/mZ의 시료처리 농도에서 BHH와 비슷한 수준의 활성을 보였다. 추출방법에 따른 환원력의 차이를 조사한 결과, 열수추출물의 환원력이 에탄올추출물보다 높은 경향을 보였으며, 특히 건조표고버섯에 이런 경향은 뚜렷하여, 1.66mg/m/2] 시료 처리조건에서 63%의 환원력 증가가 관찰되었다. 상품성 상실의 원인인 갈변화가 표고버섯의 환원력에 미치는 영향을 조사한 결과, 갈변표고버섯의 환원력은 추출 방법에 관계없이 상품성을 가진 생표고버섯이나 건조 표고버섯보다 유의하게 높았다.
- 7 세포를 지시세포로 사용하여 MTT법으로 측정하였다. 측정 결과(Table 3), 10 μg/m/에서는 세포가 93% 이상의 생존율을 보였지만 100μg/m/의 시료 농도에서 생표고버섯과 건조 표고버섯 열수추출물 처리 시의 세포생존율은 50% 수준까지현저히게 낮아졌다, 그러나 갈변표고버섯의 경우 열수추출물 및 에탄올 추출물의 세포생존율이 각각 92%와 83%로서, 세포독성이 오히려 낮아진 것을 볼 수 있었다. 이 사실은 Fig.
- 2에 나타난 것처럼, 실험에 사용한 모든 시료처리농도에서 열수 추출물과 LPS의 동시 처리는 LPS의 단독 처리보다 NO 생성을 더욱 증진시키는 반면, 에탄올 추출물은 LPS와의 동시처리가 오히려 NO 생성을 억제하는 경향을 보였다. 특히 100 의 시료 농도에서 생표고버섯과 건조표고버섯의 열수 추출물은 LPS 단독처리에 비하여 NO의 생성을 약 81% 이상 증진시켰으며 , 생표고버섯, 건조표고버섯 >갈변표고버섯의 순서로 NO 생성을 증진시키는 효과를 보였다. 열수추출물의 경우는 100|ig/mZ의 시료처리 조건에서 생표고버섯의 NO 생성 억제 능이 약 44%로 가장 높았고 그 다음이 건조표고버섯 > 갈변 표고버섯의 순서였다(각각 34% 및 20% 억제).
- 실험 결과, 표고버섯 추출물의 돌연변이 억제활성은 시료의 첨가량에 의존하여 변화하였으며, 추출에 사용된 용매에 따른 항돌연변이원성의 차이는 관찰되지 않았다. 특히 갈변표고버섯의 열수추출물 및 에탄올 추출물의 항돌연변이원성은 80 μg 및 160 pig의 투여량에서 각각 약 35 및 72%의 억제수준으로서, 동일한 조건에서 측정된 생표고버섯의 항변이원성인 39% 및 61% 억제와 유사한 수준이었다(Table 4). 이 결과는 표고버섯의 갈변화가 표고버섯에 내재된 돌연변이 억제활성물질의 활성의 변화를 일으키지 않는다는 사실을 가리킨다.
후속연구
- 본 연구자들은 갈변 표고버섯 열수추출물과 70% 에탄올추출물의 superoxide anion과 hydroxyl radical에 대한 소거활성을 조사하여 갈변 표고버섯이 신선표고버섯보다 활성산소종 소거능이 우수하다는 결과를 얻은 바 있다.9)따라서 갈변화에 의한 상품성의 상실이 전반적인 건강기능성의 상실과 직접적으로 연결되는지 여부를 보다 상세히 검정함으로써, 상품성의 상실로 폐기되어 왔던 갈변 표고버섯의 가공을 통하여 건강기능 식품의 소재로 전용하는 방법을 농가 소득의 안정적 확보 차원에서 탐색할 필요가 있다. 이에 본 연구에서는 갈변표고버섯 열수추출물 및 에탄올 추출물들의 환원력을 측정하여 항산화활성을 평가하고 함유된 페놀 화합물 및 피틴산의 함량을 측정하였으며, 대식세포의 NO 라디칼 및 MMP9 생성에 대한 제어효과와 더불어 화학적 돌연변이 원에 대한 항변이원성을 검정하였다.
- 이상의 실험 결과로 볼 때, 갈변표고버섯은 미관상의 결함이외에는 생표고버섯 등 상품성이 있는 표고버섯과 건강기능성 측면에서 차이를 발견할 수 없었다. 이 사실은 현재 재배 및 저장과정에서 폐기되고 있는 갈변 표고버섯을 표고버섯분말이나 추출액 등 건강기능성 가공식품의 형태로 소비될 수 있는 하나의 가능성을 제시하며, 재배농가의 소득을 안정적으로 보장시켜줄 수 있다는 점에서 상당히 의미를 가지기 때문에 향후 안정성 확보를 위한 보다 세밀한 검정작업이 필요하다고 생각된다.
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