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문제 정의
- 따라서 다른 분석기기에 비해 활용도가 높은 고속액체크로마토그래피를 이용하여 다양한 시료에 적용할 수 있는 전처리방법 및 분석조건 등을 확립하여 공정시험법으로 활용할 수 있는 인공감미료 분석법 개발이 필요하다. 본 연구에서는 우리나라에서 허용되어 있는 4종의 인공감미료에 대해 재현성, 간편성, 회수율 및 분리능이 우수한 정성, 정량법을 확립하여 공정시험법으로 활용하고, 추후 우리나라의 인공감미료 식이섭취량 조사 시 기초자료로 사용하고자 한다.
제안 방법
- 인공감미료 분석은 Waters Co.(USA)의 M-510 Solvent DeHvery System, M-486 Tunable Absorbance Detector, M-746 Data Module로 구성된 HPLC를 사용하였으며 분석조건으로 칼럼 종류, 이동상의 조성, 측정파장 둥을 검토하였다.
- 고형식품, 반고형 식품 및 액체식품 등 시료의 성상, 특성에 따라 분류하고 그에 따른 시료의 전처리 방법을 검토하였다.
- 앞에서 언급한 바와 같이 수크랄로스는 나머지 감미료보다 분자량이 크기 때문에 자외선 검출기로는 분석하기 어렵다. 따라서 고분자나 당의 분석에 사용되는 굴절율 검출기(RI)를 사용하여 분석하였다. 또한 이동상의 용매조성은 물과 메탄올의 7 : 3 혼액을 사용하였다.
- 삭카린나트륨, 아스파탐 및 아세설팜칼륨: 1 mL당 각 인공감미료 1, 000Hg( 1, 000ppm)을 함유하도록 조제하고 각각 최종농도 0, 1, 5, 10, 20, 50ppm이 되도록 물로 희석하여 검량선용표준용액으로 하였다(이 액의 1 mL는 각 인공감미료 0, 1, 5, 10, 20 및 50ug을 함유).
- 삭카린나트륨, 아스파탐 및 아세설팜칼륨은 자외선 검출기(UV)를 이용하여 동시분석을 수행하였고 수크랄로스의 경우에는 나머지 3종의 인공감미료보다 분자량이 큰 특징을 가지고 있어 고분자나 당의 분석에 이용되는 굴절율 검출기 (RD를 이용하여 개별분석을 수행하였다.
- 수크랄로스: 1mL당 수크랄로스 10, 000 ng(10, 000 ppm)< 함유하도록 조제하고 각각 최종농도 0, 25, 50, 100, 250ppm이 되도록 물로 희석하여 검량선용 표준용액으로 하였다(이 액의 1mL는 수크랄로스 0, 25, 50, 100 및 250ug을 함유).
- 이상의 결과를 종합하여 최적의 인공감미료 분석법을 결정하였으며 결정된 분석조건에서 얻어진 인공감미료 표준용액의 HPLC 크로마토그램을 Fig. 1 및 2에 나타내었다. 검출한계는 S/N(signal to noise ratio) = 3으로 하여 측정한 결과, 삭카린나트륨, 아스파탐 및 아세설팜칼륨은 각각 0.
- 인공감미료가 함유되어 있지 않은 시료에 각각의 인공감미료를 최종농도 50ppm이 되게 첨가하고 검토한 전처리 방법을 이용하여 각 시료의 회수율을 시험하였다.
- 인공감미료의 동시분석을 위하여 HPLC의 최적 분석조건을 검토하였다. 삭카린나트륨, 아스파탐 및 아세설팜칼륨은 자외선 검출기(UV)를 이용하여 동시분석을 수행하였고 수크랄로스의 경우에는 나머지 3종의 인공감미료보다 분자량이 큰 특징을 가지고 있어 고분자나 당의 분석에 이용되는 굴절율 검출기 (RD를 이용하여 개별분석을 수행하였다.
- Moriyasu 등(6)에 의하면 아세설팜칼륨, 삭카린나트륨, 아스파탐 분석시 210nm로 하였다고 보고한 바 있어 본 결과와 일치함을 알 수 있었다. 인공감미료의 동시분석을 위하여 carbon loading 량 및 내경에 따라 Nova-Pak Cl8(3.9mm i.d.X 150 mm, 4 pm)과 Symmetry Cl8(3.9mm i.d.X 150 mm, 5um)의 2종 역상계 칼럼을 비교, 검토한 결과 Nova-Pak C18은 아스파탐과 아세설팜칼륨의 분리가 다소 곤란하여 모든 인공감미료의 분리가 양호한 Symmetry C*을 선택하여 본 실험에 사용하였다. 또한 인공감미료 동시분석을 위한 이동상을 결정하기 위하여 먼저 물, 메탄올 및 아세토니트릴의 단일 또는 혼합액을 비교하여 분리능, 검출 시간, 피크의 모양 등을 검토한 결과, 물과 메탄올의 혼합액을 이용한 경우 인공감미료의 분리에 장시간이 소요되므로 물과 아세토니트릴의 혼합액을 사용하였으며, 물과 아세토니트릴의 혼합비율을 90% : 10% 내지 80%: 20%의 범위로 비교하였을 때 90%: 10%에서 모든 대상 인공감미료의 분리가 양호하였다.
대상 데이터
- 45 ㎛ 필터로 여과하여 시험용액으로 하였다. 대상식품으로는 탄산음료류, 과실채소류음료, 주류, 발효음료류, 두유류가 이에 속한다.
- 8 nm으로 나타났다. 이를 기준으로 하여 190-220nm^ 범위에서 검출한계, 방해물질의 검출여부 등을 고려하여 최적 검출파장을 검토한 결과 모든 성분의 분리 및 검출한계가 양호한 210 nm로 선정하였다. Moriyasu 등(6)에 의하면 아세설팜칼륨, 삭카린나트륨, 아스파탐 분석시 210nm로 하였다고 보고한 바 있어 본 결과와 일치함을 알 수 있었다.
- 껌류, 쨈류, 꿀, 김치 . 절임식품, 특수영양식품, 어육가공품, 사탕류, 혼합제제식품첨가물, 초콜릿류 및 코코아 둥 총 17종 151품목을 수집하여 시료로 하였다.
- 침전용 Carrez 시액은 potassium ferrocyanide 3 , hydrate 150 g에 물을 가해 1,000 mL로 한 것을 Carrez I, zinc sulfate 7-hydrate 300 g에 물을 가해 1,000 mL로 한 것을 Carrez II 용액으로 하여 사용하였다.
이론/모형
- 또한 Carrez 침전법보다 Sep-Pak C18< 이용하여 시료를 정제할 경우 회수율이 20%정도 낮은 것으로 예비실험결과 나타났다. 따라서 간편한 조작으로 실험시간을 단축하면서 회수율도 양호한 Carrez 침전법을 활용하였다(9). 즉, 단백질이 함유된 액상 식품 약 5 g을 취한 후 50mL 용량 플라스크에 옮기고 물 10 mL를 가하고 강하게 흔든 후 Carrez I 시약 2mL, Carrez II 시약 2이를 각각 넣고 2분간 흔들어 섞는다.
성능/효과
- 5로 설정하였다. Ion pair 시약으로는 Kobayashi 등(10)의 연구보고를 참조하여 tetrapropylammonium hydroxide(이하 TPA-OH)로 결정하였으며 농도에 의한 Rt값과 상호분리를 비교하였을 때는 농도가 높을수록 Rt값이 높아져 0.01 M이 가장 적합한 것으로 판단되었다.
- 005 M 농도로 결 정하였다. pH에 따른 인공감미료의 분리를 pH 3.545에서 검토한 결과, 아세설팜칼륨, 삭카린나트륨은 pH에 따른 변화가 없으나 아스파탐은 pH가 증가할수록 용출시간이 증가하였으며 pH 4.0-4.5에서는 아스파탐과 아세설팜칼륨의 분리가 곤란하였으므로 pH는 모든 성분의 분리가 양호한 3.5로 설정하였다. Ion pair 시약으로는 Kobayashi 등(10)의 연구보고를 참조하여 tetrapropylammonium hydroxide(이하 TPA-OH)로 결정하였으며 농도에 의한 Rt값과 상호분리를 비교하였을 때는 농도가 높을수록 Rt값이 높아져 0.
- 1 및 2에 나타내었다. 검출한계는 S/N(signal to noise ratio) = 3으로 하여 측정한 결과, 삭카린나트륨, 아스파탐 및 아세설팜칼륨은 각각 0.1 ppm, 수크랄로스는 25 ppm이었다.
- 그러나 이러한 시료 전처리 방법은 투석 시 24-48시간 정도 소요되는 등의 실험시간이 장시간 소요될 뿐 아니라 Sep-Pak C18을 이용하여 정제하여야 하는 등의 실험조작이 복잡하다. 또한 Carrez 침전법보다 Sep-Pak C18< 이용하여 시료를 정제할 경우 회수율이 20%정도 낮은 것으로 예비실험결과 나타났다. 따라서 간편한 조작으로 실험시간을 단축하면서 회수율도 양호한 Carrez 침전법을 활용하였다(9).
- X 150 mm, 5um)의 2종 역상계 칼럼을 비교, 검토한 결과 Nova-Pak C18은 아스파탐과 아세설팜칼륨의 분리가 다소 곤란하여 모든 인공감미료의 분리가 양호한 Symmetry C*을 선택하여 본 실험에 사용하였다. 또한 인공감미료 동시분석을 위한 이동상을 결정하기 위하여 먼저 물, 메탄올 및 아세토니트릴의 단일 또는 혼합액을 비교하여 분리능, 검출 시간, 피크의 모양 등을 검토한 결과, 물과 메탄올의 혼합액을 이용한 경우 인공감미료의 분리에 장시간이 소요되므로 물과 아세토니트릴의 혼합액을 사용하였으며, 물과 아세토니트릴의 혼합비율을 90% : 10% 내지 80%: 20%의 범위로 비교하였을 때 90%: 10%에서 모든 대상 인공감미료의 분리가 양호하였다. Buffer인 potassium phosphate의 농도는 Prodolliet 등⑺의 아세 설팜칼륨 분석에 대한 연구보고를 인용하여 0.
- 꿀, 김치 . 절임식품, 특수영양^품, 어육가공품, 사탕류, 혼합제제식품첨가물, 초콜릿류 및 코코아 등 총 17종 151품목을 대상으로 확립된 분석방법을 적용하여 인공감미료 4종에 대한 함량을 구한 결과는 Table 4와 같으며 인공감미료가 검출된 대상식품은 청량음료, 발효유, 츄잉껌, 캔디, 식품첨가물 혼합제제 등으로 나타났고 이들은 표시사항과는 모두 일치하였다.
- 검토한 결과는 Table 1에서 보는 바와 같다. 최적의 인공감미료 측정파장을 결정하기 위하여 인공감미료 각각의 최대흡수파장을 측정한 결과 아스파탐 192.6nm, 아세설팜 칼륨 226.5 nm 및 삭카린나트륨 200.8 nm으로 나타났다. 이를 기준으로 하여 190-220nm^ 범위에서 검출한계, 방해물질의 검출여부 등을 고려하여 최적 검출파장을 검토한 결과 모든 성분의 분리 및 검출한계가 양호한 210 nm로 선정하였다.
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