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문제 정의
- 그러나 이소플라본의 분석에 있어서 TLC 방법을 사용한 예는 극히 드물고 최근에 저자가 초고온성균이 Ther-motoga muritima 유래 효소인 maltosyltransferase를 이용하여 이소플라본인 daidzin에 당전이를 시켜 수용성 당전이 유도체를 합성한 보고에서 사용한 예가 있다(26). 따라서 본 연구에서는 콩과 식물에 많이 포함되어 있는 genistin과 daidzin을 표준 물질로 사용하여 TLC상에서 분리 될 수 있는 조건을 확인하였다. 용매 조건은 두 가지로 나누어서 사용하였는데 (Table 1), 모두 물과 acetic acid를 기본으로 하면서 여기에 (1) 전개 용매의 경우는 chloroformr과 methanol을 첨가하고 소수성의 chloroform의 함량에 변화를 주면서 이소플라본들의 분리정도와 전개 시간을 확인하였다.
제안 방법
- 용매의 유속은 1 ml/min으로 하였고 UV detector를 사용하여 254 nm에서 이소플라본을 검출하였다. Daidzin과 genistin의 농도는 HPLC 로 분석한 후 LC Workstation Class-VP(Shimadzu Co., Kyoto, Japan, Ver 6.1)을 이용하여 검출된 이소플라본 peak의 면적을 각각 기준물질의 peak 면적에 대한 비율로 계산하였다.
- TLC에 의한 이소플라본의 정량법에 대한 검증을 하기 위하여 콩과 식물에 포함되어 있는 이소플라본의 함량을 TLC와 HPLC로 분석하여 그 안에 포함되어 있는 genistin과 daidzin의함량을 비교하여 보았다(Table 2, Fig. 3). TLC에 의한 분석의 경우 강낭콩과 녹두에서는 이소플라본의 존재를 확인 할 수 없었으며 이는 HPLC의 경우와 동일하였고 기존의 보고와도 일치하였다(27).
- 콩류로부터의 이소플라본 추출은 Kim 둥(19)에 의한 방법을 기초로 하였다. Waring blender(51 BL 31, Torrington, CT, USA)로 마쇄한 6종류의 콩 시료(30 g)는 0.1% acetic acid가 함유된 70% methanol 100mL을 첨가하여 싱온에서 24시간 추출한 후 12, 00()Xg에서 20분간 원심분리하고 그 상등액을 syringe filter(NYLON 66, 0.45 |im, Whatman, Kent, UK)로 여과 후 분석 시료로 사용하였다. 칡에서의 이소플라본은 Kim(4) 등의 방법을 사용하여 추출하였다.
- 각 시료는 TLC 분석방법과 동일하게 준비하였고 HPLC 분석을 위한 이소플라본 기준물질인 daidzin과 genistin을 methanol 을 이용하여 여러 농도(0.0625-0.2501 ㎍/㎕)로 희석하여 사용하였다. 각 시 료는 cellulose acetate membrane filter(0.
- 각 시료는 silica gel TLC plate(Silicagel 60F 254, Merck, Darmstadt, Germany)의 하단으로부터 20mm 되는 위치에 1 |J.L 씩 점적하였고, 점적 시 각 점적의 직경이 최소가 되도록 주의하였으며 시료 간의 거리는 전개 후 옆 시료에 의해 생성된 spot에 시료가 방해 받지 않도록 1cm 이상 차이가 나도록 하였다. 시료 분석용 TLC plate는 10X2()cm 의 크기로 잘라서사용하였으며 시료의 전개는 TLC chamber^2X15X25 cm)에서수행하였고 전개 용매는 여러 실험을 거쳐 가장 효과적인 전개 용매를 결정하여 사용하였다.
- 방법을 이용하여 정성, 정량적으로 이소플라본을 분석할 수 있는 조건을 확립하고, 이 방법의 유효성을 HPLC방법과 비교하여 확인하였다.
- 따라서 본 연구에서는 콩과 식물에 많이 포함되어 있는 genistin과 daidzin을 표준 물질로 사용하여 TLC상에서 분리 될 수 있는 조건을 확인하였다. 용매 조건은 두 가지로 나누어서 사용하였는데 (Table 1), 모두 물과 acetic acid를 기본으로 하면서 여기에 (1) 전개 용매의 경우는 chloroformr과 methanol을 첨가하고 소수성의 chloroform의 함량에 변화를 주면서 이소플라본들의 분리정도와 전개 시간을 확인하였다. 이와 다르게 (II) 용매의 경우는 "-butanol의 함량에 차이를 주면서 이소플라본의 전개를 관찰하였다.
- , Kanagawa, Japan)을 사용하였고, column 온도는 30℃로 유지하면서 분석하였다. 용매조건으로는 0.1% acetic acid 를 함유한 acetonitrile과 0.1% acetic acid를 함유한 물을 각각 A, B 용매로 하여 A 용매의 농도를 초기 ()%에서 40분 동안 100%로 증가시키는 농도구배 방식으로 분석하였다. 용매의 유속은 1 ml/min으로 하였고 UV detector를 사용하여 254 nm에서 이소플라본을 검출하였다.
- 만들어 사용하였다. 전개가 끝난 TLC plate는 건조시킨 후, UV로 확인된 이소플라본 spot의 intensity를 ID main Image Program(Bioneer, Daejon, Korea)을 이용하여 구하고 기준 시료의 농도와 intensity의 기준곡선과 비교하여 농도를 계산하였다.
- 이소플라본의 경우, TLC를 이용하여 분석할 때 별도의 발색시약을 사용하지 않고 UV에서 흡광도를 측정함으로써 일관성 있는 spot의 밀도와 크기를 확인할 수 있었다. 정량적인 측정이 가능함을 확인하기 위하여 표준물질인 genistin과 daidzin을 사용하여 이소플라본과 spot의 intensity 간의 상관관계를 확인하였다(Fig. 2). 각 표준물질의 농도를 0.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용한 genistin과 daidzin은 Sigma사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 TLC 및 HPLC의 표준 물질로 사용하였다. 이소플라본 함량의 측정에 사용한 콩류는 국내산 콩 6 종으로 서목태, 흑태, 강낭콩, 콩나물콩, 대두, 녹두를 경동시장으로부터 구입하였고, 칡은 국내 여러 장소에서 수집한 칡을식품의약품안전청에서 제공 받아 사용하였다(2()).
- Louis, MO, USA)에서 구입하여 TLC 및 HPLC의 표준 물질로 사용하였다. 이소플라본 함량의 측정에 사용한 콩류는 국내산 콩 6 종으로 서목태, 흑태, 강낭콩, 콩나물콩, 대두, 녹두를 경동시장으로부터 구입하였고, 칡은 국내 여러 장소에서 수집한 칡을식품의약품안전청에서 제공 받아 사용하였다(2()). 이외에 실험에 사용한 시약들은 Sigma사나 Baker사(Phillipsburg, NJ, USA)로부터 구입한 특급시약을 사용하였다.
- 이소플라본 함량의 측정에 사용한 콩류는 국내산 콩 6 종으로 서목태, 흑태, 강낭콩, 콩나물콩, 대두, 녹두를 경동시장으로부터 구입하였고, 칡은 국내 여러 장소에서 수집한 칡을식품의약품안전청에서 제공 받아 사용하였다(2()). 이외에 실험에 사용한 시약들은 Sigma사나 Baker사(Phillipsburg, NJ, USA)로부터 구입한 특급시약을 사용하였다.
이론/모형
- 45 |im, Whatman, Kent, UK)로 여과 후 분석 시료로 사용하였다. 칡에서의 이소플라본은 Kim(4) 등의 방법을 사용하여 추출하였다. 건조되어 있는 칡을 Waring blender 로 분쇄 후 분말의 5배 부피의 80% Methanol을 첨가하여 상온에서 48시간 추출한 후 12, 000Xg에서 20분간 원심분리하고 얻은 상등액을 syringe filter(NYLON 66, 0.
- 콩류로부터의 이소플라본 추출은 Kim 둥(19)에 의한 방법을 기초로 하였다. Waring blender(51 BL 31, Torrington, CT, USA)로 마쇄한 6종류의 콩 시료(30 g)는 0.
성능/효과
- 전개 시간의 경우 소수성의 chloroform이 용매에 포함된 경우 (1)가 "-butanol을 함유한 용매 (II) 보다 빨랐다. (1) 용매가 (II) 용매보다 전개시간이 짧다는 장점과 더불어 genistin과 daidzin의 분리에 있어서도 (II)용매의 경우보다 좀 더 확실하다는 장점이 있었다. (I) 용매 조건에서 genistin과 daidzin의 분리에 있어서 명확한 분리 조건을 찾기는 쉽지 않았으나 chloroform : methanol : water : acetic acid를 각각 60 : 30 : 10 : 0.
- (1) 용매가 (II) 용매보다 전개시간이 짧다는 장점과 더불어 genistin과 daidzin의 분리에 있어서도 (II)용매의 경우보다 좀 더 확실하다는 장점이 있었다. (I) 용매 조건에서 genistin과 daidzin의 분리에 있어서 명확한 분리 조건을 찾기는 쉽지 않았으나 chloroform : methanol : water : acetic acid를 각각 60 : 30 : 10 : 0.5의 비율로 하였을 때 최적의 분리를 보였다. 이때 genistin과 daidzin의 R값은 각각 0.
- 2). 각 표준물질의 농도를 0.15-1.80㎍/㎕로 조절하고 TLC분석 후에 생긴 spot의 intensity를 densitometer로 측정하여 표준 곡선을 그린 결과, R1값이 모두 0.995를 넘어 이상의 농도 범위에서 정량분석이 가능함을 알 수 있었다(Fig. 2). 하지만 두이소플라본을 동시에 측정할 경우 농도가 i.
- 따라서 aglycone 형태의 이소플라본의 분석 시에는 전개용매의 소수 도를 줄임으로써 시료의 존재를 관찰 할 수 있었다. 결론적으로 대표적인 glycone 형태의 이소플라본인 genistin과 daidzin은 특별한 발색과정 없이 간편하게 UV에서 TLC전개 후 흡광도만 측정함으로써 관찰이 가능하였다(Fig. 1).
- 결론적으로 이소플라본의 함량이 이상이고 시료의 양이 많은 경우 한 chamber 내에서 동시에 여러 시료를 분석할 수 있고 시료의 전처리 과정이 따로 필요 없으며 빠른 시간 내에 분석이 가능하다는 점을 고려할 때 TLC를 이용한 정량방법이 유용하게 사용될 수 있다는 점을 확인하였다. 또한이소플라본의 정량적 측정이 발색과정 없이 단순한 UV에서의 흡광도 측정으로 가능하다는 것 또한 큰 장점이다.
- 일반적인 이소플라본 형태인 glycone을 확인하기 위한 전개용매 조건에서는 aglycone 형태의 이소플라본들이 전개용매와 갇이 움직임으로 *값이 상당히 높고 분리가 쉽지 않았다. 따라서 aglycone 형태의 이소플라본의 분석 시에는 전개용매의 소수 도를 줄임으로써 시료의 존재를 관찰 할 수 있었다. 결론적으로 대표적인 glycone 형태의 이소플라본인 genistin과 daidzin은 특별한 발색과정 없이 간편하게 UV에서 TLC전개 후 흡광도만 측정함으로써 관찰이 가능하였다(Fig.
- 80|ig/nL 이상을 넘을 경우 daidzin과 genistin의 spot이 명확하게 분리되지 않는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 일반적으로 1.80㎍/μL 이하의 농도에서 정량적으로 이소플라본인 genistin과 daidzin을 분석할 수 있다는 결론을 도출하였다. 그러나, 미량의 이소플라본(0.
- TLC를 이용하여 국내에서 채취한 칡에 포함된이소플라본의 함량을 측정한 결과도 HPLC의 결과와 상당히 유사한 값을 보여 주었다(Table 3). 이상의 결과를 바탕으로 콩과 식물에 많이 포함되어 있는 이소플라본인 genistin과 daidzin 은 TLC방법으로 간편하게 정량적인 측정이 가능함을 확인하였다. 물론 낮은 농도에서는 정량적인 측정이 HPLC에 비하 여부 정확하였으며 미량으로 포함되어 있는 다른 이소플라본의 경우 정량적인 측정이 불가능하다는 단점이 있는 것도 간과 할 수는 없다.
- TLC에 의한 분석의 경우 강낭콩과 녹두에서는 이소플라본의 존재를 확인 할 수 없었으며 이는 HPLC의 경우와 동일하였고 기존의 보고와도 일치하였다(27). 이소플라본의 함량은 흑태의 경우 genistin과 daidzin 모두 가장 높았으며, 대두, 서목태, 콩나물콩의 순으로 그 함량이 적었다. 정량 분석을 실시한 후 얻어진 이소플라본의 함량도 TLC와 HPLC의 경우 상당히 유사한 값을 보여 주었으며, 이는 TLC에 의한 정량 방법이 유효하다는 사실을 증명하는 것이다.
- 이소플라본의 함량은 흑태의 경우 genistin과 daidzin 모두 가장 높았으며, 대두, 서목태, 콩나물콩의 순으로 그 함량이 적었다. 정량 분석을 실시한 후 얻어진 이소플라본의 함량도 TLC와 HPLC의 경우 상당히 유사한 값을 보여 주었으며, 이는 TLC에 의한 정량 방법이 유효하다는 사실을 증명하는 것이다. TLC를 이용하여 국내에서 채취한 칡에 포함된이소플라본의 함량을 측정한 결과도 HPLC의 결과와 상당히 유사한 값을 보여 주었다(Table 3).
- 존재를 확인 할 수 있다는 장점이 있다. 하지만 전개 용매의 친수도와 소수도 정도에 따라 glycone과 aglycone 형태의 이소플라본의 전개도가 다르게 나타남을 확인하였다. 일반적인 이소플라본 형태인 glycone을 확인하기 위한 전개용매 조건에서는 aglycone 형태의 이소플라본들이 전개용매와 갇이 움직임으로 *값이 상당히 높고 분리가 쉽지 않았다.
후속연구
- 물론 낮은 농도에서는 정량적인 측정이 HPLC에 비하 여부 정확하였으며 미량으로 포함되어 있는 다른 이소플라본의 경우 정량적인 측정이 불가능하다는 단점이 있는 것도 간과 할 수는 없다. 따라서 그 환경과 목적에 따라 HPLC방법과 TLC 방법을 서로 보완적으로 활용하면 보다 효율적으로 생리활성물질로 각광을 받고 있는 이소플라본의 연구를 수행할 수 있을 것이다.
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