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문제 정의
- 따라서 본 연구에서 탈지 참깨박과 탈지 들깨박의 강한 항산화력에 주목하여 노화에 따른 기억력 및 학습능력이 결손 된 SAMP8에게 3개월간 섭취시켜 인지기능과 지질 과산화물 축적, acetykholinesterase 및 항산화 효소의 활성에 미치는 효과를 검토하였다.
- 본 연구는 탈지 참깨 및 탈지 들깨의 메탄올추출물이 기억과 학습능력 감퇴의 특성을 가지고 있는 노화촉진마우스 SAMP8의 인지기능 및 항산화체계에 미치는 영향을 검토하기 위하여 각 추출물 0.3% 첨가 식이로 3개월간 섭취시킨 후 passive avoidance test로 인지기능변화를 측정하였고, 뇌중 acetylcho-linesterase 활성, 지질과산화물 및 항산화효소활성을 분석하였다. 그 결과, 탈지 참깨 및 탈지 들깨의 메탄올 추출물이 노화촉진으로 감소한 step through latency가 증가하였으나, 혈액과 뇌 조직의 acetylcholinesterase 활성에는 영향을 미치지 못하였다.
제안 방법
- 본 연구에서 사용한 식이 구성 성분은 Table 1에 제시하였다. 식이 섭취량은 1주일에 3회 일정한 시각에 측정하였으며, 체중은 매주 측정하였다. 실험동물은 식이 기간이 종료되는 시점에서 passive avoidance test를 통하여 인지기능의 행동 변화를 측정하였으며, 그 후에 12시간 절식시키고 diethyl ether로 마취시켜 복부대동맥에서 혈액을 채취하였다.
- 식이 섭취량은 1주일에 3회 일정한 시각에 측정하였으며, 체중은 매주 측정하였다. 실험동물은 식이 기간이 종료되는 시점에서 passive avoidance test를 통하여 인지기능의 행동 변화를 측정하였으며, 그 후에 12시간 절식시키고 diethyl ether로 마취시켜 복부대동맥에서 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 원심분리관에 담아 ice bath에 20분간 방치한 후 3,000 rpm, 10분간 원심분리(Brushless D.
- 연령이 6개월 된 SAMP8은 난괴법에 의하여 무첨가 대조군, 탈지 참깨 메탄올 추출물 첨가군(S), 탈지 들깨 메탄올 추출물 첨가군(P)으로 나누었으며 각 군 10마리씩으로 하였다. 실험식이는 AIN-76 diet 조성을 기본으로 탈지 참깨와 탈지 들깨 메탄올 추출물을 식이의 0.3% 첨가하여 12주간 공급하였으며, 실험기간 동안 물과 식이는 자유롭게 공급하였다. 본 연구에서 사용한 식이 구성 성분은 Table 1에 제시하였다.
- 김 등(9)의 연구에 의하면 SAMP8에게 김치식이를 6개월 동안 섭취 시 항산화 효소 Cu-SOD, Zn-SOD, GPx 활성이 대조군에 비해 유의적으로 증가하였다. 이를 김치 재료 안에 포함되어 있는 페놀물질, 클로로필, 카로티노이드 등의 항산화 물질 때문일 것으로 제안하였다. 또한 최 등(33)의 연구에서는 SAMP8에게 갈대뿌리를 원료로 하여 80% 에탄올 추출물을 첨가한 시료를 8개월간 투여 시에 대조군의 노화도가 평점대비하여 55%이상의 유의적인 억제효과를 보였고, hydroxyl radical과 MDA 수준이 감소되어 노화로 인한 활성산소의 공격으로부터 뇌세포 보호효과가 있음을 제시하였다.
- 3 ㎃의 전류를 초간 주어 이를 기억하게 하였다. 이를 반복하여 연습시킨 다음 다시 명실에 실험동물을 두어, 빛을 회피하여 암실로 들어가는데 까지 걸리는시간(step through latency)을 측정하였다.
- 항산화계는 비효소계와 효소계로 구분되며 효소계에는 SOD, catalase, GPx 등이 있고, 이들은 체내에 생성된 지질 과산화물을 단계별로 소거시키는 중요한 역할을 한다. 이에 본 실험에서는 뇌조직 중의 지질과산화물 함량과 항산화효소 활성 변화를 Fig. 2 및 Table 3에 제시하였다.
- 뇌조직의 acetylcholinesterase 활성은 Elman 법(15)에 근거하여 측정하였다. 조직 균질액 일정량을cuvette에 담고, 2.6 mL phosphate buffer(pH 8.0)와 3-carboxy-4-nitrophenyl dissulfide(DTNB)를 넣어 반응시켜 412㎚에서 5분간 흡광도를 측정하였다.
- 기름을 제조한 후 얻어진 참깨박과 들깨박은 40 mesh를 통과할 수 있도록 분쇄하여 -20℃ 냉동실에 보관하고 추출물 제조에 사용하였다. 참깨박과 들깨박은 분쇄 후, 5배의 80% 메탄올을 첨가하여 실온에서 150rpm으로 3시간 동안 shaking하여 추출하였으며 이를 3회 반복하여 메탄올 추출물을 얻었다. 이를 여과한 후 40℃ 이하에서 감압농축(rotary vacuum evaporator R-l 14, Swiss)하고 동결건조 한 다음 동물실험에 사용하였다.
- 항산화계 효소 중 catalase, superoxide dismutase(SOD) 및 glutathione peroxidase(GPx) 활성을 뇌에서 측정하였다. 뇌 조직 무게 10배 volume의 0.
- 혈청중의 acetylcholinesterase 활성도를 cholinesterase activity kit(Sigma, USA)를 이용하여 분석하였다. 혈청 0.
대상 데이터
- 5% 이상. (주)삼육실험동물연구소)로 사육하였다. 연령이 6개월 된 SAMP8은 난괴법에 의하여 무첨가 대조군, 탈지 참깨 메탄올 추출물 첨가군(S), 탈지 들깨 메탄올 추출물 첨가군(P)으로 나누었으며 각 군 10마리씩으로 하였다.
- 뇌조직의 지질 과산화물 함량은 조직의 일정량을 Teflon Potter-Elvehjem homogenizer로 마쇄하여 얻은 균질액을 과산화 지질 분석을 위한 시료로 사용하였다. 지질 과산화물 분석은 Ohkawa 등(16)의 방법에 따라 분석하였으며, 표준물질로서는 1,1,3,3,-tetraethoxypropane을 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 참깨 및 들깨는 경상남도 산청군으로부터 구입하여 정선, 세척, 건조시켜 200℃에서 볶음 처리한 후 착유하였다. 기름을 제조한 후 얻어진 참깨박과 들깨박은 40 mesh를 통과할 수 있도록 분쇄하여 -20℃ 냉동실에 보관하고 추출물 제조에 사용하였다.
- 본 연구에서는 senescence-accelerated prone mouse(SAMP8)와 senscence-resistant mouse(SAMRl)를 한국화학연구소에서 분양받아 6개월간 고형배합사료(삼육 SAM #31 실험용 쥐사료, 성분명: 조단백질 22.0%, 조지방 4.5% 이상, 조섬유 6% 이하, 조회분 8% 이하, 칼슘 0.7% 이상, 인 0.5% 이상. (주)삼육실험동물연구소)로 사육하였다.
데이터처리
- 3)Values with different alphabet within the row are significantly different at a = 0.05 by Duncan's multiple range test.
- 5)Values with different alphabet within the row are significantly different at a = 0.05 by Duncan's multiple range test.
- 실험결과는 SAS는 이용하여 실험군당 평균±표준오차로 나타내었으며 각 군의 유의차 검정은 분산분석을 한 후 a = 0.05 수준에서 Duncan's multiple range test를 실시하였다.
이론/모형
- 이 상층액을 다시 12,000×g에서 30분간 원심분리하여 상층액을 SOD와 GPx 활성 측정에 사용하였으며, 조제된 시료는 분석 시까지 -70℃에서 냉동 보관하였다. Catalase는 hydroperoxide가 분해 되는 정도를 측정하는 Aebi의 방법(17)에 준하였으며, SOD 활성은 Marklund의 방법(18), GPx는 Lawrence와 Burk의 방법 (19)을 사용하였다.
- 각 효소원의 단백질량은 Lowty법(20)에 의하여 정량하였고 표준검량선 작성을 위해서는 bovine seram albumin을 사용하였다.
- 2 mL을 첨가하여 25℃ water bath에서 30분간 배양시킨 후 420nm에서 흡광도를 측정하여 계산하였다. 뇌조직의 acetylcholinesterase 활성은 Elman 법(15)에 근거하여 측정하였다. 조직 균질액 일정량을cuvette에 담고, 2.
- 뇌조직의 지질 과산화물 함량은 조직의 일정량을 Teflon Potter-Elvehjem homogenizer로 마쇄하여 얻은 균질액을 과산화 지질 분석을 위한 시료로 사용하였다. 지질 과산화물 분석은 Ohkawa 등(16)의 방법에 따라 분석하였으며, 표준물질로서는 1,1,3,3,-tetraethoxypropane을 사용하였다.
성능/효과
- 3)Acetylcholinestese activities are expressed as amount of 5-thio-2-nitro-benzoic acid produced by hydrolysis of substrate.
- 1에는 각각의 실험식이를 공급하여 12주간 사육한 후 passive avoidance chamber로 훈련시킨 후 step through latency 변화를 나타내었다. SAMR1 군의 step through latency는 300초 였으나, 노화가 촉진된 대조군은 138초로 유의적으로 감소하여 (p<0.05) 인지기능이 유의적으로 손상되었음을 알 수 있었다. 그러나 탈지 참깨 메탄올 추출물과 탈지 들깨 메탄올 추출물을 공급한 군에서는 step through latency가 각각 252초와 256초로 SAMP8 대조군에 비하여 유의적으로 증가하였고 SAMR1 군과 거의 유사한 수준을 나타내었다.
- 3% 첨가 식이로 3개월간 섭취시킨 후 passive avoidance test로 인지기능변화를 측정하였고, 뇌중 acetylcho-linesterase 활성, 지질과산화물 및 항산화효소활성을 분석하였다. 그 결과, 탈지 참깨 및 탈지 들깨의 메탄올 추출물이 노화촉진으로 감소한 step through latency가 증가하였으나, 혈액과 뇌 조직의 acetylcholinesterase 활성에는 영향을 미치지 못하였다. 체내 지질 과산화물은 SAMP8 대조군에서 유의하게 증가하였으나, 탈지 참깨와 탈지 들깨의 메탄올 추출물을 첨가함으로써 유의하게 감소하였으며, SOD와 GPx의 활성은 증가하였다.
- 05) 인지기능이 유의적으로 손상되었음을 알 수 있었다. 그러나 탈지 참깨 메탄올 추출물과 탈지 들깨 메탄올 추출물을 공급한 군에서는 step through latency가 각각 252초와 256초로 SAMP8 대조군에 비하여 유의적으로 증가하였고 SAMR1 군과 거의 유사한 수준을 나타내었다. Umezawa 등(21)은 a-linolenate/linoleate 조성이 다른 해바라기씨 기름과 들기름을 노화촉진마우스에게 공급한 결과, a-linolenate가 풍부한 들기름공급군의 학습능력이 개선되었음을 보고하였으며, 이는 식이가 뇌 인지질의 n-3/n-6 불포화 지방산 비율에 영향을 미치는 것으로 제시하였다.
- 001), SAMR1 군보다 낮은 수준을 나타내었으며 S와 P 의식이 공급은 노화에 따른 지질과산화물의 상승을 효과적으로 억제시키는 것으로 사료된다. 또한 탈지 참깨 및 탈지 들깨의 메탄올 추출물 첨가는 뇌조직 중 SOD 활성을 SAMR1 수준인 정상수준까지 회복시켰고, GPx 활성은 증가시키는 반면 catalase 활성에는 변화가 없었다. 이는 free radical 제거 시 SOD의 활성이 증가하여 0-를 효과적으로 제거함으로써 HQ?가 상대적으로 덜 생산되어 catalase의 활성에 영향을 미치처 못한 것으로 생각된다.
- 2). 또한 항산화 효소활성을 보면 catalase는 각군에 따른 유의차가 없었고, SOD와 GPx는 SAMR1 군에 비하여 SAMP8 대조군에서 감소하였으나 참깨와 들깨 추출물을 첨가함에 따라 대조군에 비하여 증가하여 SAMR1 군과 유사한 경향을 보였다 (Table 3). Kurokawa 등의 연구(31)에 의하면, SAMP8과 동일 연대기 선상에 있는 SAMR1의 cerebral cortex에서 Mn-SOD, catalase, GPx 효소활성 비교 시 SAMP8에서 Mn-SOD와 catalase의 효소활성이 유의적으로 감소하였으며 뇌 조직에서 추출한 단백질을 전기 영동하였을 시 SAMP8에서 Mn-SOD의 발현 수준이 높았음을 보고하였다.
- 우선 지질과산화물 함량을 보면, SAMP8 대조군은 143.4 nmol/g로 SAMR1 군 114.5 nmol/g 보다 유의하게 증가하였고. 탈지 참깨 메탄올 추출물과 탈지 들깨 메탄올 추출물 첨가시 각각 63.
- 이러한 노화에 따른 지질 과산화물의 축적은 탈지 참깨 및 탈지 들깨의 메탄올 추출물 첨가로 유의적으로 감소하였으며 (p< 0.001), SAMR1 군보다 낮은 수준을 나타내었으며 S와 P 의식이 공급은 노화에 따른 지질과산화물의 상승을 효과적으로 억제시키는 것으로 사료된다. 또한 탈지 참깨 및 탈지 들깨의 메탄올 추출물 첨가는 뇌조직 중 SOD 활성을 SAMR1 수준인 정상수준까지 회복시켰고, GPx 활성은 증가시키는 반면 catalase 활성에는 변화가 없었다.
- 그 결과, 탈지 참깨 및 탈지 들깨의 메탄올 추출물이 노화촉진으로 감소한 step through latency가 증가하였으나, 혈액과 뇌 조직의 acetylcholinesterase 활성에는 영향을 미치지 못하였다. 체내 지질 과산화물은 SAMP8 대조군에서 유의하게 증가하였으나, 탈지 참깨와 탈지 들깨의 메탄올 추출물을 첨가함으로써 유의하게 감소하였으며, SOD와 GPx의 활성은 증가하였다. 따라서 탈지 참깨와 탈지 들깨의 메탄올 추출물은 노화촉진마우스의 인지 기능을 개선시키며, 이는 cholinergic 신경전달체계의 변화보다는 체내 지질 과산화물 억제 및 항산화효소 활성을 통한 메카니즘으로 생각된다.
- 5 nmol/g 보다 유의하게 증가하였고. 탈지 참깨 메탄올 추출물과 탈지 들깨 메탄올 추출물 첨가시 각각 63.3 nmol/g, 59.2 nmol/g으로 유의하게 감소하였으며, 이는 SAMR1 군보다도 더 낮은 값을 나타내었다(Fig. 2). 또한 항산화 효소활성을 보면 catalase는 각군에 따른 유의차가 없었고, SOD와 GPx는 SAMR1 군에 비하여 SAMP8 대조군에서 감소하였으나 참깨와 들깨 추출물을 첨가함에 따라 대조군에 비하여 증가하여 SAMR1 군과 유사한 경향을 보였다 (Table 3).
- Table 2에는 혈청과 뇌 조직에서 인지기능과 긴밀한 연관성을 가지고 있는 acetylcholinesterase 활성을 나타내었다. 혈청에서의 효소활성을 살펴보면 각 군 간에 통계적 유의차는 나타나지 않았으나 SAMP8이 SAMRI에 비하여 다소 증가하는 경향을 보였으며, 탈지 참깨 메탄올추출물군은 SAMP8 대조군에 비하여 감소하는 경향을 보였다. 뇌조직에서는 SAMP8군의 효소활성이 SAMR1에 비하여 효소활성이 유의하게 증가하였으나 참깨 및 들깨 추출물 첨가에 따른 효소활성의 변화는 나타나지 않았다.
후속연구
- 이러한 점으로 미루어 볼 때 탈지 참깨 및 탈지 들깨의 메탄올 추출물 섭취는 노화에 따른 항산화능의 저하를 억제하고 노화에 따른 free radical에 의한 뇌의 산화적 손상을 억제시킴으로써 기억력 개선에 기여하는 것으로 사료되며, 이는 이들 추출물에 함유되어 있는 페놀화합물과 a-tocopheonol 및 다양한 lignan 등의 항산화물질들이 직·간접적으로 작용하는 것으로 추측되나 향후 이에 대한 자세한 연구가 요구된다.
- 연령이 다른 SD rat에서 뇌 조직의 부위에 따라 acetylcholinesterase의 활성을 측정한 결과, old male rat(18-22 month)이 young male rat(3-4 month)보다 낮은 효소활성을 나타내었으며 특히 hippocampus에서 더 감소되었다고 한 Das 등(26)의 보고와 SAMP8에서 시료공급에 의하여 acetylcholinesterase 활성이 증가한다고 한 최 등(27, 28)의 보고와는 상반되는 경향이다. 이러한 차이는 동물의 주령, 식이 등에 의한 영향도 배제할 수 없으나 지금까지 치매 치료 또한 개선제 개발의 주 접근방식이 acetycholinesterase inhibitor 탐색이었다는 점과 뇌중 acetylcho-linesterase 활성은 acetylcholine 함량과도 관련성이 높다는 점을 감안할 때, 이에 대한 자세한 연구가 요구된다.
- Suganuma 등(23)의 보고에서는 토마토에서 추출한 lycopen을 식이에 섞어 SAMP8에게 장기간 섭취 시 pas-sive avoidance test에서 step through latency가 유의적으로 증가됨을 보고하여 본 연구와도 유사한 경향을 나타내었다. 이상의 실험결과로 살펴볼 때 탈지 참깨와 들깨메탄올 추출물은 노화로 인한 인지기능 저하에 영향을 미쳐 기억과 학습장애를 개선시킬 수 있는 것으로 기대된다.
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