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문제 정의
- 보고한 바 있다(5, 6). 본 연구는 땅콩껍질에 함유된 항미생물 활성물질을 추가로 구명하였기에 이를 보고하고자 한다.
제안 방법
- 세균의 경우, Streptococcus pyagenes는 BHI(Brain Heart Infusion) 배지 (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA), 젖산균은 Lactobacilli MRS 배지 (Dif&)Laboratories, Detroit, MI, USA), 그밖의 세균은 Nutrient 배지 (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)를 각각 사용하였고, 효모의 경우는 YM(yeast malt) 배지(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)를 사용하였다. S aureus, S. epidermidis, E. coli, P. aeruginosa, S. pyogenes, 그리고 S typhia 3TC에서 24시간 동안, B. subtilis, M. luteus, 젖산균 및 효모는 3"C에서 24시간 동안 3회 반복하여 전배양을 행한 후 접종균주로 사용하였다.
- 얻어진 활성획분은 또 다른 용매계를 이용한 silica gel adsorption column chromatography(C)를 행하였다. 즉 silica gel을 ??-hexane/EtOAc/MeOH(8 : 6 : 1, v/v/v) 용매계로 slurry를 만들어 column(2.0X40.0cm)에 충진시키고 n-hexane/EtOAc/MeOH 용매계 8:6: 1, 6:8: 1, 4: 10: l(v/v/v)의 순으로 용출분획하였다.
- 0, 3 L)으로 수용액획분과 EtOAc획분으로 분획하였다. EtOAc획분을 buffer 용액 (0.2 M N&HPCV0.2M NaH2PO4, pH 8.0, 3L)으로 재분배하여 EtOAc 중성, 페놀성획분과 수용액획분으로 분획하였다. 수용액획분은 1.
- subtilis. M. luteus, 젖산균과 효모는 30℃에서 16시간 동안 각각 배양하여 paper disc 주위에 형성된 clear zone의 크기(mm)로 활성의 정도를 측정하였다. 대조구로는 benzoic acid(Hayashi Pure Chemical Industries, Osaka, Japan)를 사용하여 항미생물 활성을 비교하였다.
- MS 분석은 Waters integrity system(Milford, MA, US A) 을 이용하여 직접도입방식의 electron impact-mass spectrometry(EI- MS) 분석을 실시하였고, 이때 ionizing voltage는 70eV ion source의 온도는 200℃에서 행하였다.
- ODS co!umn(8X250 mm, Senshu, 10 |im, Tokyo, Japan)을 장착하고 260 nm(Waters 486 tunable absorbance detector, Milford, MA, USA)에서 55% MeOH을 이동상으로 1.5 mL/min의 유속(Waters Mod이 510 solvent delivery system, Milford, MA, USA)으로 용출분획하였다.
- 그래서 이 MeOH 추출물을 용매분획하여 얻어진 EtOAc의 산성, 중성, 그리고 페놀성획분 각각의 건조중량 5g 상당량으로 항미생물 활성을 검정하였다. 그 결과, EtOAc 산성과 중성획분에 활성을 보여 산성획분에 함유된 활성물질은 보고한 바 있으며(5, 6), EtOAc 중성획분또한 gram 양성 및 음성세균과 효모 등의 다양한 미생물에 대해 항미생물 활성을 보여, EtOAc 중성획분에 함유된 항미생물 활성 본체의 구명을 시도하였다.
- 항미생물 활성을 보였다(Table 1). 그래서 이 MeOH 추출물을 용매분획하여 얻어진 EtOAc의 산성, 중성, 그리고 페놀성획분 각각의 건조중량 5g 상당량으로 항미생물 활성을 검정하였다. 그 결과, EtOAc 산성과 중성획분에 활성을 보여 산성획분에 함유된 활성물질은 보고한 바 있으며(5, 6), EtOAc 중성획분또한 gram 양성 및 음성세균과 효모 등의 다양한 미생물에 대해 항미생물 활성을 보여, EtOAc 중성획분에 함유된 항미생물 활성 본체의 구명을 시도하였다.
- luteus, 젖산균과 효모는 30℃에서 16시간 동안 각각 배양하여 paper disc 주위에 형성된 clear zone의 크기(mm)로 활성의 정도를 측정하였다. 대조구로는 benzoic acid(Hayashi Pure Chemical Industries, Osaka, Japan)를 사용하여 항미생물 활성을 비교하였다.
- 땅콩껍질 MeOH 추출물을 용매분획하여 얻어진 EtOAc 중성획분(9.6 g)을 EtOAc/MeOH 용매 계의 silica gel adsorption column chroniatography(A)로 분획한 후, 각 획분의 항미생물 활성을 검정하였다. 그 결과 EtOAc/MeOH 용매계 100:0(v/v)의 용출획분(6.
- 땅콩껍질(건조중량 6, 100g; 수분함량 4.8±0.13%)은 homogenizer(BM-2 Nissei bio-mixer, Nihonseiki Kaiseiki LTD, Japan)로 마쇄하면서 methanol(MeOH, 30 L)로 추출하였다. 얻어진 MeOH 추출물은 G3 glass filter로 여과한 후 cooling aspirator (CA-111, Eyela, Tokyo, Japan)가 장치된 vacuum evaporator (N-2N, Eyela, Tokyo, Japan)로 35"C에서 감압농축하였다.
- 땅콩껍질에 함유된 항미생물 활성물질의 탐색을 위해 땅콩껍질을 MeOH로 추출하고 이 MeOH 추출물을 용매분획하여 EtOAc 중성획분을 얻었다. 이 획분에 함유된 항미생물 활성물질을 silica gel adsorption column chromatography, Sephadex LH-20 column chromatography, ODS column chromatography로 정제한 다음 HPLC를 이용하여 1종의 화합물을 단리하였다.
- 분리된 활성물질의 구조해석을 위해 1H-NMR(400MHz, CD3OD) 분석을 실시하였다. 그 결과(Table 2), 8 8.
- 0, 3L)으로 재분배하여 EtOAc 중성, 페놀성획분과 수용액획분으로 분획하였다. 수용액획분은 1.0N HC1 을 이용하여 pH 3.0으로 조절한 후 EtOAc(5L×3)로 분배하여 EtOAc 산성획분을 얻었으며, EtOAc 중성 - 페놀성획분은 buffer 용액 (0.2 M KC1-0.2 M NaOH, pH 12.0, 3L)으로 분배하여 EtOAc 중성획분과 수용액획분으로 분획하였다. 이 수용액획분을 다시 LON HC1 을 이용하여 pH 6.
- 0cm)에 충진시킨 후, CHCl3/MeOH 용매계로 MeOH 농도를 0, 10, 20, 30, 40, 50%까지 단계적으로 증가시키는 step-wise 방법으로 용출분획하였다. 얻어진 활성획분은 또 다른 용매계를 이용한 silica gel adsorption column chromatography(C)를 행하였다. 즉 silica gel을 ??-hexane/EtOAc/MeOH(8 : 6 : 1, v/v/v) 용매계로 slurry를 만들어 column(2.
- 정제된 활성획분을 chloroform(CHCk)을 출발용매로 한 silica gel adsorption column chromatography(B)# 다시 행하였다. 즉 silica g이을 CHC1?으로 slurry를 만들어 column(3.0×24.0cm)에 충진시킨 후, CHCl3/MeOH 용매계로 MeOH 농도를 0, 10, 20, 30, 40, 50%까지 단계적으로 증가시키는 step-wise 방법으로 용출분획하였다. 얻어진 활성획분은 또 다른 용매계를 이용한 silica gel adsorption column chromatography(C)를 행하였다.
- 0cm인 petri dish에 넣고 응고시켰다. 응고된 배지 위에 시료를 함유한 paper disc를 적절히 배치한 후, 0.85% 식 염수를 직경 8 mm의 paper disc에는 65㎕로, 그리고 직경 6 mm paper disc에 는 17 ㎕로 시료를 diffusion시켰다. S.
- 중성획분을 얻었다. 이 획분에 함유된 항미생물 활성물질을 silica gel adsorption column chromatography, Sephadex LH-20 column chromatography, ODS column chromatography로 정제한 다음 HPLC를 이용하여 1종의 화합물을 단리하였다. 1H-NMR, MS 및 NOESY 분석에 의해 땅콩껍질로부터 분리된 항미생물 활성물질은 pratensein으로 동정되었다.
- 이상 땅콩껍질 MeOH 추출물의 EtOAc 중성획분으로부터 항미생물 활성물질 1종을 분리하여 isoflavonoid인 pratensein으로 동정하였다. Pratenseine 땅콩껍질 건조중량 1 kg당 0.
- 활성물질의 정제 및 분리 과정에서 얻어진 각 획분들의 항미생물 활성 검정은 비교적 강한 활성을 보인 S. aureus를 활성지표(bioactive guide) 미생물로 선발하여 상기방법으로 활성을 측정하였다.
대상 데이터
- 'H nuclear magnetic resonanccfH-NMR)와 nuclear overhauser enhancement spectroscopy(NOESY)의 분석은 JEOL JNM-AL 400 sp8Ctemeter(400 MHz, JEOL, Tokyo, Japan)를 사용하였고, 용매는 deuterium methanol(CD3OD), 그리고 내부 표준물질로는 tetramethylsilane(TMS, 6 = 0)을 사용하였다.
- 땅콩껍질의 항미생물 활성 검정을 위해 사용된 미생물은 gram 양성세 균으로는 Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis, Streptococcus pyogenes, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus brevis, 그리고 Lactobacillus plantarnum을 gram 음성세균으로는 Escherichia coli,Pseudomonas aeruginosa 및 Salmonella typhi를 효모로는 Candida albicans와 Saccharomyces cerevisiea 등을 사용하였다. 세균의 경우, Streptococcus pyagenes는 BHI(Brain Heart Infusion) 배지 (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA), 젖산균은 Lactobacilli MRS 배지 (Dif&)Laboratories, Detroit, MI, USA), 그밖의 세균은 Nutrient 배지 (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)를 각각 사용하였고, 효모의 경우는 YM(yeast malt) 배지(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)를 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 땅콩(Arachis hypogaea)껍질은 전라북도 고창군 성송면에서 재배된 땅콩에서 종실을 제거하고 실온에서 음건한 후 시료로 사용하였다.
- 사용하였다. 세균의 경우, Streptococcus pyagenes는 BHI(Brain Heart Infusion) 배지 (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA), 젖산균은 Lactobacilli MRS 배지 (Dif&)Laboratories, Detroit, MI, USA), 그밖의 세균은 Nutrient 배지 (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)를 각각 사용하였고, 효모의 경우는 YM(yeast malt) 배지(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)를 사용하였다. S aureus, S.
- 5 g)에서 활성이 나타났다. 이 활성획분을 Sephadex LH-20 column chromatography에 의해 분획하고 활성을 검정한 결과, total volume에 대한 elution volume의 비(Ve/Vt)가 1.34-1.37의 용출획분(127.5 mg)에 활성이 나타나 이 획분을 대상으로 활성물질의 정제를 행하였다. ODS column chromatography를 실시한 결과, 70-80% MeOH 용출획분(60 mg)에서 활성이 나타났다.
이론/모형
- 얻어진 MeOH 추출물은 G3 glass filter로 여과한 후 cooling aspirator (CA-111, Eyela, Tokyo, Japan)가 장치된 vacuum evaporator (N-2N, Eyela, Tokyo, Japan)로 35"C에서 감압농축하였다. MeOH이 제거된 추출물을 Park 등(7)의 방법에 의해 EtOAc(5L× 3)와 buffer 용액(0.2 M glycine-0.2 M HC1, pH 3.0, 3 L)으로 수용액획분과 EtOAc획분으로 분획하였다. EtOAc획분을 buffer 용액 (0.
- 항미 생물 활성은 paper disc((p 6 mm 또는 8 mm, Whatman)방법 (11)으로 측정하였다. Pour-plate method에 의해 4SC로 조절된 멸균배지 20mL에 전배양액 Q2mL를 무균적으로 옮겨 잘 혼합한 후, 지름이 9.
성능/효과
- 이 획분에 함유된 항미생물 활성물질을 silica gel adsorption column chromatography, Sephadex LH-20 column chromatography, ODS column chromatography로 정제한 다음 HPLC를 이용하여 1종의 화합물을 단리하였다. 1H-NMR, MS 및 NOESY 분석에 의해 땅콩껍질로부터 분리된 항미생물 활성물질은 pratensein으로 동정되었다.
- 5 mg)에 활성이 나타나 이 획분을 대상으로 활성물질의 정제를 행하였다. ODS column chromatography를 실시한 결과, 70-80% MeOH 용출획분(60 mg)에서 활성이 나타났다. 이 획분을 HPLC(Senshu pak ODS column, 60% MeOH)로 분획하여 얻어진 각 peak를 대상으로 항미생물 활성을 검정한 결과, retention time(4)204 min에서 용출된 단일 peak의 화합물이 활성을 보여, 이를 반복적으로 분취하여 활성물질을 단리(2.
- 6 g)을 EtOAc/MeOH 용매 계의 silica gel adsorption column chroniatography(A)로 분획한 후, 각 획분의 항미생물 활성을 검정하였다. 그 결과 EtOAc/MeOH 용매계 100:0(v/v)의 용출획분(6.8 g)에서 강한 활성을 보여 이 획분을 대상으로 CHCl/MeOH 용매계의 silica gel adsorption column chromatography(B)를 실시한 결과, CHCl/MeOH 용매계 90: 10(v/v)의 용출획분(4.9 g)에서 활성을 나타냈다. 이 활성획분을 다시 silica gel adsorption column chromatography(C)로 n-hexane/EtOAc/MeOH을 8:6: l(v/v/v)에서 4: 10: l(v/v/v)까지 용출분획하여 정제한 결과, n-hexane/EtOAc/MeOH 용매계 8 : 6 : l(v/v/v)의 용출획분 (3.
- 분석을 실시하였다. 그 결과(Table 2), 8 8.05-6.21에 60분의 sp1 탄소 proton이 검출되었으며, 그 중 6 6.21과 6 6.32의 doublet signal이 등가(J = 2.2 Hz, 각각 1H, s)를 보였고, 또 3 6.97에 중첩되어 검출된 2H분(d, J= 1.2 Hz)의 signal 및 δ8.05의 singlet(lH) signal의 존재로부터 활성물질은 flavonoid일 가능성이 시사되었다. 일반적으로 flavone류의 3위의 proton signal(lH)은 5 7.
- 05에 관찰되어 활성물질은 isoflavone임을 알 수 있었다. 또한, 8 3.88에서 관찰된 강한 intensity의 3H분의 signal로부터 -OCHJmethoxyl)기의 존재가 확인되어, isoflavone에 1종의 methoxyl기가 결합된 화합물임을 알 수 있었다.
- 마쇄한 땅콩껍질을 MeOH로 추출하여, 건조중량 5g 상당량의 MeOH 추출물을 다양한 미생물에 대하여 항미생물 활성을 검정한 결과, gram 양성 및 음성세균과 효모 등의 미생물에 대해 항미생물 활성을 보였다(Table 1). 그래서 이 MeOH 추출물을 용매분획하여 얻어진 EtOAc의 산성, 중성, 그리고 페놀성획분 각각의 건조중량 5g 상당량으로 항미생물 활성을 검정하였다.
- 이 methoxyl기의 정확한 결합위치를 확인하기 위하여 NOESY 분석을 실시한 결과(Fig. 3), methoxyl기의 proton signal과 5'위치의 proton signal들 상호간에 cross peak가 관찰되어 methoxyl기가 4' 위치에 결합되어 있음을 명확히 확인할 수 있었다. 이상의 1H-NMR, EI-MS, NOESY 분석결과로부터 활성 물질은 3, , 5, 7-trihydroxy4-methoxyisoflavone(pratensein)으로 동정 되었으며, Fraishtat 등(12)의 1H-NMR data와 비교해 본 결과(Table 2), 본 화합물의 data와 일치하여 활성물질은 pratensein임이 재확인되었다.
- ODS column chromatography를 실시한 결과, 70-80% MeOH 용출획분(60 mg)에서 활성이 나타났다. 이 획분을 HPLC(Senshu pak ODS column, 60% MeOH)로 분획하여 얻어진 각 peak를 대상으로 항미생물 활성을 검정한 결과, retention time(4)204 min에서 용출된 단일 peak의 화합물이 활성을 보여, 이를 반복적으로 분취하여 활성물질을 단리(2.8 mg, 황색분말)하였다. 이상의 항미생물 활성물질의 분리 및 정제과정을 Fig.
- 3), methoxyl기의 proton signal과 5'위치의 proton signal들 상호간에 cross peak가 관찰되어 methoxyl기가 4' 위치에 결합되어 있음을 명확히 확인할 수 있었다. 이상의 1H-NMR, EI-MS, NOESY 분석결과로부터 활성 물질은 3, , 5, 7-trihydroxy4-methoxyisoflavone(pratensein)으로 동정 되었으며, Fraishtat 등(12)의 1H-NMR data와 비교해 본 결과(Table 2), 본 화합물의 data와 일치하여 활성물질은 pratensein임이 재확인되었다.
- 이어서, EI-MS 분석을 실시한 결과(Fig. 2), m/z 300에서 molecular ion peak가 관찰되어 활성물질의 분자량이 300으로 확인되었으며, 그 외에 m/z 285[M-CHJ, I53[M-C9H8O, ]+, 149[M-C7H4O]+ 등에 fragment ion이 검출되었고, 특히 Fig. 2에 제시한 구조식에 그 분열패턴을 나타낸 바와 같이 m/z 153 및 149의 fragment ion이 검출되어짐으로써 methoxyl기가 B링에 결합되어 있음을 알 수 있었다.
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