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문제 정의
- 땅콩껍질에는 다양한 기능성 물질이 함유되어 있을 것으로 생각되나 땅콩껍질의 methanol 추출물이 항돌연변이 효과(16)가 있다는 보고가 있을 뿐 이에 관한 연구가 빈약한 실정이다. 이에, 땅콩껍질에 함유된 항균 및 항산화 활성이 있는 물질을 탐색하여 활성 본체를 규명하여 땅콩껍질의 이용 및 기능성 해명에 도움되고자 하였다.
제안 방법
- 0)으로 수상 획분과 EtOAc 가용 산성 , 중성 획분 (EtOAc-sohible acidic - neutral fraction) 으로 분획하였다. EtOAc 가용 산성 , 증성 획분을 buffer 용액 (0.2 M Na2HPO4-0.2 M NaH2PO4, pH &0)으로 분배하여 EtOAc 가용 중성 획분 (EtOAc-soluble neutral fraction)과 수상 획분으로 분획하였고, 얻어진 수상 획분에 0.1 M HC1 을 가하여 pH 3.0으로 조절한 후 EtOAc로 분배하여 EtOAc 가용 산성 획분 (EtOAc-sohible acidic fraction)과 수상획분으로분획하였다.
- GC-MS 분석은 gas chromatograph (Varian STAR 3400CX, USA; Rtx-1 capillary column, 0.32 mmX30 m, Varian, USA) 를 mass spectrometer (Varian SATURN 4D, USA) 에 장착한 기기를 사용하여, ion source temperature 200℃, ionizing voltage 70 eV 조건으로 분석하였다. GC의 injector 온도는 220℃, GC oven의 온도는 처음 2분 동안 100℃로 유지하였고 승온 속도를 5℃/min으로 하여 최종온도가 200℃가 되도록 하였다.
- HPLC는 Senshu pak ODS column (0.8x25 cm, Senshu, Japan)을 이용하여 40% MeOH, 1.5 mL/min (Model 510 solvent delivery system, Waters, USA)로 용출 분획하였으며, 검출기는 UV detector (254 nm, Model 486 Tunable Absorbance Detector, Waters, USA)를 사용하였다.
- Liquid chromatograph-mass spectrometry (LC-MS) LC-MS 분석은 liquid chromatograph (Waters 2690 Separations Module, USA; Nova-pak Cis column, 0.2X15 cm, Millipore, USA)를 Thermabeam mass detector (Waters Integrity system, USA)에 장착한 기기를 사용하여, 이동상은 35% MeOH (0.2 mL/min)을 이용하였으며, Waters 996 photodiode array detector로 검출하였으며, ionizing voltage는 70 eV, ion source temperature는 200℃에서 실시하였다.
- MeOH 추출물을 solvent fractionation, silica gel adsorption column chromatography, Sephadex LH-20 column chromatography, ODS column chromatography 등으로 정제하고 HPLC에 의해 활성물질을 분리하였다. 분리된 두 활성물질은 LC-MS, GC-MS분석에 의해 4-hydroxybenzoic acid와 3-methoxy-4-hydroxybenzoic acid로 동정되었으며 두 물질은 땅콩껍질에 각각 3, 96 ㎎/㎏, 9.
- ODS (20 g, 70 ~ 230 mesh, YMC, Japan)를 H2O:MeOH (3:7, v/v)로 column (1.5x23 cm)에 충진시킨 후, HiO-MeOH 용매계의 MeOH 농도를 30%부터 10%씩 (각 단계별 40 mL) 증가시켜 용출 분획하였다
- Silica gel (23 g, 70 ~230 mesh, column chromatography Merck, Germany)을 EtOAc로 column (1.5 x 30 cm)에 충진시킨 후, EtOAc-MeOH 용매계로 MeOH 농도를 0, 10, 20, 30, 40, 50% (단계별 200 mL씩)까지 증가시키면서 step-wise 방법으로 용출 분획하였다. 또한 silica gel (15 g)을 CHCk으로 column (1.
- 또한, 이들 획분을 대상으로 DPPH 자유라디칼 소거 능을 검정한 결과, EtOAc 가용 산성 획분에 활성을 보였다. 땅콩껍질 MeOH 추출물의 EtOAc 가용 산성 획분에서 항균 및 항산화 활성이 모두 나타나 우선 이 획분에 함유된 활성 본체의 단리를 시도하였다.
- 땅콩껍질을 homogenizer (BM-2 Nissei bio-mixer, Nihonseiki Kaiseiki LTD, Japan)로 마쇄하면서 w-hexane, ethyl acetate (EtOAc), methan이 (MeOH) 등으로 순차 추출하였다. 얻어진 각 추출물은 G3 Glass filter■와 여과지 (Whatman No.
- 땅콩사山 力)四繆也I)껍질의 MeOH 추출물은 항균 및항산화 활성을 보여 땅콩껍질에 함유된 활성물질의 탐색을시도하였다. MeOH 추출물을 solvent fractionation, silica gel adsorption column chromatography, Sephadex LH-20 column chromatography, ODS column chromatography 등으로 정제하고 HPLC에 의해 활성물질을 분리하였다.
- 5 x 30 cm)에 충진시킨 후, EtOAc-MeOH 용매계로 MeOH 농도를 0, 10, 20, 30, 40, 50% (단계별 200 mL씩)까지 증가시키면서 step-wise 방법으로 용출 분획하였다. 또한 silica gel (15 g)을 CHCk으로 column (1.3x22.5 cm)에 충진시킨 후, CHCl3-EtOAc 용매계로 EtOAc 농도를 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70% (각 단계별 200 mL)까지 증가시키면서 step-wise 방법으로 용출 분획하였다.
- 또한 정제 과정에서 항산화 활성 검정은 시료를 TLC (Merck, silica gel, 0.25 mm, Germany)로 전개 (benzene:acetone:acetic acid, 90:2:8, v/v)한 다음, 200 DPPH 용액을 spray하여 1 분 이내에 탈색이 되면 양성으로 판정하였다.
- 분리된 두 활성물질의 규명을 위해 LC-MS를 실시하였다.
- 1 mL를 무균적으로 옮겨 잘 혼합한 후 petri dish에 넣고 굳혔다. 여기에 용매에 용해시킨 시료를 적하하여 용매를 제거한 paper disc를 올린 뒤 0.85%의 식염수로 확산시켜 각 균주의 적정온도에서 , 12시간 배양하여 paper disc 주위의 clear zone의 크기 (mm)로 활성의 정도를 측정하였으며 대조 구로 benzoic acid (Hayashi Pure Chemical Industries, Japan) 를 8 mm paper disc당 0, 5 mg을 사용하였다. 정제과정에서는 항균 활성 검정의 지표균으로 S.
- 항균 활성을 갖는 MeOH 추출물을 EtOAc와 buffer 용액 (0.2 M glycine-0.2 M HC1, pH 3.0)으로 수상 획분과 EtOAc 가용 산성 , 중성 획분 (EtOAc-sohible acidic - neutral fraction) 으로 분획하였다. EtOAc 가용 산성 , 증성 획분을 buffer 용액 (0.
대상 데이터
- 배지는 젖산균은 Lactobacilli MRS 배지 (Merck, Germany), S. pyogenes는 Brain Heart Infusion 배지 (Difco, USA), 그 밖의 세균은 nutrient 배지 (Merck), 효모는 YM 배지 (Difco)를사용하였다. 배양온도는 세균의 경우 37℃ 또는 30C에서 16 시간, 효모는 30℃에서 16시간 동안 3회 반복하여 전 배양을행한 후 접종균주로 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 땅콩(4rac/”s hypogaea)껍질은 전라북도고창군 성송면 성송농협 땅콩공장에서 종실을 제거한 다음, 실온에서 건조한 후 시료로 사용하였으며 수분함량은 4.8%이었다.
- 85%의 식염수로 확산시켜 각 균주의 적정온도에서 , 12시간 배양하여 paper disc 주위의 clear zone의 크기 (mm)로 활성의 정도를 측정하였으며 대조 구로 benzoic acid (Hayashi Pure Chemical Industries, Japan) 를 8 mm paper disc당 0, 5 mg을 사용하였다. 정제과정에서는 항균 활성 검정의 지표균으로 S. 血爬如를 사용하였다.
- 항균 활성측정을 위해 사용한 미생물은 8종의 gram 양성 세균 (Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus brevis KCTC 3102, Lactobacillus plantarum KCTC 3104, Leuconostoc mesenteroidis KCTC 3100, Micrococcus luteus ATCC 9341, Staphylococcus aureus KCTC 1927, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Streptococcus pyogenes KCTC 3096)과 3종의 gram 음성세균 (Escherichia coli ATCC 10536, Salmonella typhimurium ATCC 19430, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027) 그리고 2종의 효모 (Saccharomyces cerevisiae IFO 1850, Candida albicans ATCC 10231)을 사용하였다.
이론/모형
- GC의 injector 온도는 220℃, GC oven의 온도는 처음 2분 동안 100℃로 유지하였고 승온 속도를 5℃/min으로 하여 최종온도가 200℃가 되도록 하였다. Trimethylsilyl (TMS) 유도체화는 Park 등(17)의 방법에 의해 분리된 활성획분 10 您에 NaOH로 건조시킨 pyridine과 N, O-bis(trimethylsilyl)acetamide (Fluka, Switzerland) 그리고 trimethylchlorosilane (Fluka, Switzerland)을 10:5:1 (v/v) 로 섞은 시약 20 를 가하여 vortex mixer 로 혼합 후 60 ℃ 의 heating block에서 30분 동안 반응시킨 후 GC-MS 분석용 시료로 하였다 GC-MS 분석용 표준 시약으로 3-methoxy-4-hydroxybenzoic acid (Sigma, USA) 와 4-hydroxybenzoic acid (Junsei, Japan)를사용하였다.
- 용액 (100 “M, 44 mg/L) 900 "。와 시료용액 100 ;口 를 test tube에 넣고 voltex에서 혼합한 다음 암소에서 10분간 반응시킨 후 517 nm에서 홉광도를 측정하였으며 비교구로 a -tocopherol (Sigma, USA)을 사용하였으며, DPPH-radical 소거활성은 Sabchez-Moreno 등의 방법(21)으로 구하였다.
- 항균 활성의 검정은 Zaika의 paper disc (, 8 mm, Advantec, Japan)방법(18)으로 측정하였다. Davidson과 Parish의 방법(19)에 의해 45℃로 조절된 멸균 배지 20 mL에 전 배양액 0.
- 항산화 활성검정은 Sakata의 방법(20)으로 l, l, -diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼에 대한 소거능으로 나타냈다. 즉, DPPH (Sigma, USA)를 ethanol (EtOH)에 용해하여 제조한 용액 (100 “M, 44 mg/L) 900 "。와 시료용액 100 ;口 를 test tube에 넣고 voltex에서 혼합한 다음 암소에서 10분간 반응시킨 후 517 nm에서 홉광도를 측정하였으며 비교구로 a -tocopherol (Sigma, USA)을 사용하였으며, DPPH-radical 소거활성은 Sabchez-Moreno 등의 방법(21)으로 구하였다.
성능/효과
- 땅콩껍질 (6.7 kg, 수분함량 4.8%)을 "-hexane, EtOAc, MeOH로 순차 추출하여 얻은 각 추출물을 땅콩껍질 5 g에 상당하는 추출물로 항균 활성을 검정한 결과, MeOH 추출물에 항균 활성을 보였으며 (Table 1), DPPH 용액에 의한 라디칼 소거능을 검정한 결과, 항산화 활성 또한 MeOH 추출물에 나타내 땅콩껍질 MeOH 추출물은 항균 및 항산화 활성 물질을 함유하고 있었다.
- tR 1L61 분에 peak를 갖는 물질의 EI-MS spectrum (Figure 2) 은 M* 이 282(6%)에 그리고 fragment ion이 m/z 267(base peak), 223(32%), 193(15%)에 나타나, 4-hydroxybenzoic acid의 COOH기와 OH기에 TMS가 도입된 TMS ester TMS ether 구조 (Cl3H22O3Si2, M+ 282)로 관측될 뿐만 아니라 GC의 tR (11.61 분) 또한 표준품의 々과 일치하여 활성물질 구조가 4-hydroxybenzoic acid임이 재확인되었다.
- 27분에 main peak를 갖는 두 물질의 혼합물로 존재하였다. 두 물질 모두 항균 활성을 나타내었으나, 항산화 활성은 main peak에서 관측되었다.
- 땅콩껍질에서 얻어진 3 -methoxy-4-hydroxybenzoic acid 와 4-hydroxybenzoic acid를 DPPH 자유라디칼 소거능으로 나타낸 항산화 활성을 검정한 결과, 두 물질etocopherol보다 낮은 활성을 보였다. 즉, 4-hydroxybenzoic acid는 200-400 您/mL 수준에서 거의 항산화 활성을 나타내지 않았으나, 3-methoxy-4-hydroxybenzoic acid는 100 «g/mL에서 10% 정도의 라디칼 소거활성을 갖는 항산화 활성을 보였다(Figure 4).
- 동정된것은 처음으로 사료된다. 땅콩껍질의 MeOH 추출물에서 분리된 4-hydroxybenzoic acid와 3-methoxy-4-hydroxybenzoic acid 는 땅콩껍질 kg 당 각각 3.96 mg, 9.73 mg 이었으나, 분리과정에서의 유실 등을 고려한다면, 땅콩껍질에 함유된 두 물질의 함량은 이보다 더 높은 수준일 것으로 사료된다.
- 1). 또한, 이들 획분을 대상으로 DPPH 자유라디칼 소거 능을 검정한 결과, EtOAc 가용 산성 획분에 활성을 보였다. 땅콩껍질 MeOH 추출물의 EtOAc 가용 산성 획분에서 항균 및 항산화 활성이 모두 나타나 우선 이 획분에 함유된 활성 본체의 단리를 시도하였다.
- 용출 분획한 결과, CHCh-EtOAc (80:20, v/v) 용출 획분 (156 mg)과 CHCl3-EtOAc (70:30, v/v) 용출 획분 (177 mg)은 항산화 및항균 활성을 나타냈다. 보다 극성이 낮은 활성 획분 (156 mg 땅■콩껍질 5, 965 g)을 Sep뵤dex LH-20 column chromatography (bed volume, 250 mL)로 분리한 결과, Ve/Vt (elution volume/bed volume) 0.92~ 1.04의 위치에 용출된 획분에 항산화 및 항균 활성을 보였다. 이 활성 획분 (89.
- MeOH 추출물을 solvent fractionation, silica gel adsorption column chromatography, Sephadex LH-20 column chromatography, ODS column chromatography 등으로 정제하고 HPLC에 의해 활성물질을 분리하였다. 분리된 두 활성물질은 LC-MS, GC-MS분석에 의해 4-hydroxybenzoic acid와 3-methoxy-4-hydroxybenzoic acid로 동정되었으며 두 물질은 땅콩껍질에 각각 3, 96 ㎎/㎏, 9.73 ㎎/㎏정도 함유되어 있었다.
- 상으로 항균 활성을 검정한 결과, EtOAc 가용 산성 획분과 EtOAc 가용 중성 획분 모두 미생물 생육억제 현상을 보였다 (Table 1). 또한, 이들 획분을 대상으로 DPPH 자유라디칼 소거 능을 검정한 결과, EtOAc 가용 산성 획분에 활성을 보였다.
- 3 g /땅콩껍질 6, 020 g)을 EtOAc-MeOH 용매 계의 silica gel adsorption column chromatographyS. 용출 분획한 결과, 100% EtOAc 용출 획분에서 항산화 및 항균 활성이 나타났다. 이활성 획분 (1.
- 5 g/땅콩껍질 6, 004 g)을 CHCls-EtOAc 용매계의 silica gel adsorption column chromatographyS. 용출 분획한 결과, CHCh-EtOAc (80:20, v/v) 용출 획분 (156 mg)과 CHCl3-EtOAc (70:30, v/v) 용출 획분 (177 mg)은 항산화 및항균 활성을 나타냈다. 보다 극성이 낮은 활성 획분 (156 mg 땅■콩껍질 5, 965 g)을 Sep뵤dex LH-20 column chromatography (bed volume, 250 mL)로 분리한 결과, Ve/Vt (elution volume/bed volume) 0.
- 5분과 4, 8분에 peak를 나타냈다. 이를 EI-MS 분석 결과, tR 2.5분의 활성물질은 M*이 138 에 관찰되었으며, fragment ion으로 m/z 121 (base peak), 93(27%), 65(38%)에 이온이 관측되어 GHm의 분자식을갖는 4~hydroxybenzoic acid의 EI-MS spectrum (NIST library, NIST No. 3581)과 일치하였다, 또한 tR 4.8분의 활성물질은 M*이 base peak로서 m/z 168에 관찰되었으며, fragment ion으로 m/z 153(63%), 125(22%), 108(5%), 97(30%)에 이온이 관측되었다 이는 CgHgQ의 분자식을 갖는 3-methoxy-4-hydroxybenzoic acid의 EI-MS spectrum (NIST library, NIST No. 6514)과 일치하였다.
- 이를 확인하고자, ODS-HPLC에서 두 물질의 혼합물질로분리된 tR 4.7~6.5 분의 활성분획의 일부를 TMS유도체로 만든 다음, GC-MS에 의해 분석한 결과, 疏 11.61 분과 tR 14.49 분에 pxak를 나타내는 두 물질만이 존재하는 GC chromatogram 이 관측되었으며 두 물질은 29:기의 존재비를 나타냈다 (Figure 1).
- 항산화 활성을 검정한 결과, 두 물질etocopherol보다 낮은 활성을 보였다. 즉, 4-hydroxybenzoic acid는 200-400 您/mL 수준에서 거의 항산화 활성을 나타내지 않았으나, 3-methoxy-4-hydroxybenzoic acid는 100 «g/mL에서 10% 정도의 라디칼 소거활성을 갖는 항산화 활성을 보였다(Figure 4).
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