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문제 정의
- 또한, 이러한 화합물의 천연 소염제로서의 잠재적 생리활성에 대한 일련의 연구들도 일본 과학자들에 의해서 발표된 바 있다(21-22). 이러한 선행연구들을 바탕으로 볼 때, 갈조류에 함유된 성분들을 적절히 이용함으로써 뇌기능을 보호하고 인지능력을 상승시킬 수 있는 잠재력이 큰 것으로 판단되어, 이 연구에서는 표준화된 갈조 추출물로서 식이보조제로 생산되고 있는 "NX42" 성분에 대한 아세틸콜린에스터라제 억제효과, 뇌세포보호효과 및 인지기능 평가를 통하여 이러한 가능성을 검증하고자 하였다.
- 갈조 주줄물의 acetylcholinesterase 억제효과와 신경세포보호 활성이 스트레스 조건에서의 학습능력에 어떤 효과를 미치는지 알아보기 위하여 수중 미로 실험이 수행되었다. 학습기간 5 일간 매일 15회씩의 전기충격을 받은 스트레스군은 플랫폼에도 달하는데 소요되는 시간에 있어서 전기충격을 받지 않은 대조군에 비해 현저한 증가를 보였다(2-5일째, p <0.
제안 방법
- 24시간 후 접시 안의 H2O2 농도는 30|jlM, 각 sample의 농도는 30 μg/mL 되도록 넣어주었다. 20시간 후에 haemacytometer로 세포 수를 세었다. 세포 보호 효과 수치는 reduced(%), 남아있는 세포수기준 =#1-(시약처리 후/시약처리 전)}X100으로 산출하였다.
- 61 g)을 얻었다. Fraction 2와 3을 더하여 NX42에서 Fraction 1을 제외한 나머지 분획으로 하였다(Fraction 4, 8.61 g). NX42와 Fraction 1의 성분조성은 Table 1과 같다.
- 구입하였다. 물과 사료에 대한 접근을 자유롭게 하였으며, 23±10C, 습도 55+5%, 12시간 명암주기를 유지하면서 군당 10 마리씩 3개의 군(대조군, 스트레스군, 스트레스 +NX42군)으로 나누어 사육하였다. 시료용액은 각각 NX42 1%를 증류수에 현탁하여 만들었다.
- 5 cm 아래에 위치시켰다. 수조의 바깥쪽에는 여러가지 종류의 서로 다른 뚜렷한 형태의 도형을 위치시켜 시각적 구분 표시를 삼았다, 각각의 마우스는 5일간 매일 3회의 플랫폼을 찾아가는 학습을 실시하였다. 매 학습시, 마우스는 일정한 시작점에서 수조의 바닥방향을 향하여 놓여졌으며, 숨겨진 플랫폼을 찾아가는데 소요되는 시간이 기록 되었다.
- 시료용액은 각각 NX42 1%를 증류수에 현탁하여 만들었다. 스트레스 +NX42군에는 시료용액을, 대조군 및 스트레스군에는 증류수를 4주간 1일 1회 존데를 사용하여 경구투여 하였으며, 시료 투여량은 100㎎/㎏ 이 되도록 하였다. 학습 기간인 5주째에는 스트레스군과 스트레스 +NX42 군에 하루 15회 의 전기충격 (매회 0.
- 시료투여 시작 5주째에 Morris 수중 미로 실험을 문헌에 의하여 실시 하였다(24). 원형 의 수조(100 cm diameter, 35 cm height)에 23oC의 물을 15 cm 깊이로 담고, 분유를 첨가하여 불투명하게 하였다.
- 시료투여 시작 5주째에 Morris 수중 미로 실험을 문헌에 의하여 실시 하였다(24). 원형 의 수조(100 cm diameter, 35 cm height)에 23oC의 물을 15 cm 깊이로 담고, 분유를 첨가하여 불투명하게 하였다. 한 개의 플랫폼(12 cm diameter, 15 cm height)을 수조를 4등분한 한 분면의 수면 0.
- , Vancouver, WA, USA)사로부터 표준화된 갈조 추출물 (NX42)을 제공 받아서 사용하였다. 플로로탄닌 분획을 얻기 위해서 NX42(10g)를 초산에틸(100g)에 혼합하여 환류 조건에서 1시간 동안 추출한 후 여과하였다. 추출을 3회 반복한 후, 여과액을 모두 더하여, 증류수 2L를 사용하여 세척하고, 진공 건조하여 0.
- 스트레스 +NX42군에는 시료용액을, 대조군 및 스트레스군에는 증류수를 4주간 1일 1회 존데를 사용하여 경구투여 하였으며, 시료 투여량은 100㎎/㎏ 이 되도록 하였다. 학습 기간인 5주째에는 스트레스군과 스트레스 +NX42 군에 하루 15회 의 전기충격 (매회 0.6 mA, 5 sec)을 7일간 연속으로 가하였으며, 대조군은 전기충격을 가하지 않았다.
- 01). 학습기간 6일째 되는 날은 플랫폼을 제거하고, 플랫폼이 있었던 분면을 수영하는 시간의 비율을 측정하였다. 스트레스군의 경우, 대조군에 비하여 유의성 있게 짧은 시간 비율(p<0.
- 마우스가 플랫폼을 찾는데 성공하면, 10초간 그대로 있도록 두고, 다음 시도 전까지 충분한 휴식을 위하여 cage로 귀환 시켰다. 학습시작 6일째에는 플랫폼을 제거하고, 총 90초간의 수영시간 동안 플랫폼이 놓여있던 분면을 수영하는 시간의 비율을 측정하였다.
대상 데이터
- PNI(pacific nutritional inc., Vancouver, WA, USA)사로부터 표준화된 갈조 추출물 (NX42)을 제공 받아서 사용하였다. 플로로탄닌 분획을 얻기 위해서 NX42(10g)를 초산에틸(100g)에 혼합하여 환류 조건에서 1시간 동안 추출한 후 여과하였다.
- 세포 배양에 사용한 배지류는 Gibco BRL(USA) 제품을 사용하였다. SK-N-SH 세포는 American Type Culture Collection으로부터 구입하였다.
- 7], Sigma C-5021; ATCh (acetylthiocholine chloride), B-3128; DTNB [5, 5'-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)], D-8130; Fucoidan, F-5631. 세포 배양에 사용한 배지류는 Gibco BRL(USA) 제품을 사용하였다. SK-N-SH 세포는 American Type Culture Collection으로부터 구입하였다.
- 수컷 ICR 마우스(5주령, 18-20g)를 다물사이언스(한국)로부터 구입하였다. 물과 사료에 대한 접근을 자유롭게 하였으며, 23±10C, 습도 55+5%, 12시간 명암주기를 유지하면서 군당 10 마리씩 3개의 군(대조군, 스트레스군, 스트레스 +NX42군)으로 나누어 사육하였다.
- 실험에 사용된 무기염류 및 일반용매 및 효소, 기질 등은 모두 Sigma사로부터 구입하였다: Acetylcholinesterase(AChE) [EC 3.1.1.7], Sigma C-5021; ATCh (acetylthiocholine chloride), B-3128; DTNB [5, 5'-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)], D-8130; Fucoidan, F-5631. 세포 배양에 사용한 배지류는 Gibco BRL(USA) 제품을 사용하였다.
데이터처리
- 모든 데이터는 mean+SEM으로 나타내었으며, 통계분석은 Student's t-test를 사용하였다.
이론/모형
- 효소활성은 25oC에서, Ellman 법(23)을 변형시킨 UV 흡광도 분석법으로 측정하였다. DTNB 용액 (900μL of 5.
성능/효과
- 그러나 NX42를 섭취한 마우스들(스트레스 +NX42군)은 이러한 학습능력 감소에 대한 유의적인 저항을 보였으며, 이는 NX42에 함유된 플로로탄닌 성분들에 의한acetylcholinesterase 의 억제 및 아세틸콜린 농도 상승 효과가 기여하는 것으로 해석된다. NX42를 구성하는 성분 주 플로로탄닌 성분만이 acetyl- cholinesterase 억제활성 및 SK-N-SH 보호활성을 나타내었다. 그러나, 푸코이단 성분이 뇌혈관에 끼치는 영향이 일부 보고되고 있으므로(16-17), in vivo 조건에서는 간접적인 기작을 통하여 뇌 기능의 보호작용에 기여할 가능성도 생각할 수 있다.
- NX42의 acetylcholinesterase 억제효과 NX42의 acetylcholinesterase 억제효과를 측정한 결과, 600-700 μg/mL 의 농도에서 50% 억제율을 나타내었다(Fig. 1). 의약품에 비해 미약한 효과이지만 용량 의존성을 보였다.
- 저해 요인으로 작용했음을 의미한다. 그러나, NX42를 4주간 섭취한 후 전기 충격을 받은 스트레스 +NX42군은 이러한 학습능력 저해요인에 대한 현저한 저항성을 보여, 1일째와 2일째에는 유의성은 없지만 스트레스군에 비하여 다소간 개선된 경향을 보였으며, 3, 4, 5일째에는 유의성 있는 개선을 보였다 p <0.05 또는 0.01). 학습기간 6일째 되는 날은 플랫폼을 제거하고, 플랫폼이 있었던 분면을 수영하는 시간의 비율을 측정하였다.
- 05). 따라서 H2O2 에 의해 유발된 산화스트레스로부터의 NX42의 SK-N-SH 세포 보호효과는 플로로탄닌 성분에 기인하는 것으로 확인되었다.
- 한편, Sanford 등(30)에 의하면 반복되는 전기충격은 마우스에게 공포를 유발하여 REM 수면을 감소시키며, 유전적 특성 및 충격의 경험정도에 따라 그 정도에 차이가 나는 것으로 보고한 바 있다. 따라서 본 연구에서 나타난 바와 같이 전기충격을 받은 마우스들(스트레스군)이 보이는 학습능력의 감소는 REM 수면의 감소와 함께 나타나는 아세틸콜린의 농도 저하에 의한 기억 형성 과정의 방해로 인한 것으로 해석된다. 그러나 NX42를 섭취한 마우스들(스트레스 +NX42군)은 이러한 학습능력 감소에 대한 유의적인 저항을 보였으며, 이는 NX42에 함유된 플로로탄닌 성분들에 의한acetylcholinesterase 의 억제 및 아세틸콜린 농도 상승 효과가 기여하는 것으로 해석된다.
- 주로 플로 로탄닌으로 구성된 Fraction 1 (Table 1)은 현저하게 높은 억제효과(IC50=~50㎍/mL)를 나타내었다 한편, NX42에서 플로로탄닌 성분이 제거된 fraction 4와 푸코이단의 경우, 2mg/mL의 농도까지도 억제효과가 나타나지 않아 IC50 측정이 불가능 하였다. 따라서, NX42의 acetylcholinesterase 억제효과가 전적으로 플로로탄닌 성분에 기인하는 것으로 확인되었다. 플로로탄닌 추출물은 10여종의 dibenzo-1, 4-dioxin 유도체로 구성되어 있는 것으로 알려져 있어(18-22), 개 개의 화합물들을 분리하여 각각의 화합물이 이 억제효과에 기여하는 정도 및 억제 kinetics에 대한 추가적인 연구를 추진 중이다.
- 알아보기 위하여 수중 미로 실험이 수행되었다. 학습기간 5 일간 매일 15회씩의 전기충격을 받은 스트레스군은 플랫폼에도 달하는데 소요되는 시간에 있어서 전기충격을 받지 않은 대조군에 비해 현저한 증가를 보였다(2-5일째, p <0.01)(Fig. 3).
후속연구
- 한편, 푸코이단 성분이 P/L 셀렉틴에 의해 매개되는 백혈구의 내피세포 흡착을 억제함으로써 저산소성 허혈에 기인한 뇌세포의 염증성 파괴를 효과적으로 막아준다는 연구결과가 발표된 바 있으나(16-17), 혈관내피세포나 백혈구가 존재하지 않는 in vitro 산화 파괴 조건에서는 효과를 나타내지 않는 것으로 나타났다. 그러나 in vivo 조건에서는 갈조추출물에 함유된 푸코이단 성분이 항산화 작용을 갖는 플로로탄닌 성분과 함께 협동적으로 뇌세포를 보호하는데 기여할 수 있을 것으로 생각된다.
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