[논문]Aβ42로 유도된 알츠하이머 마우스 모델에서 이중 가공 인삼열매 추출물의 학습 및 기억 손실 개선 효과

장수길; 안정원; 조보람; 김현수; 김서진; 성은아; 이도익; 박희용; 진덕희; 주성수

doi:10.9721/kjfst.2019.51.2.160

초록
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AD는 뇌의 신경세포 사멸뿐만 아니라 학습 및 기억능 소실을 초래하는 퇴행성 뇌 질환이며, 기억과 관련된 주요 뇌 구역인 해마(hippocampus)는 콜린성 조절(cholinergic modulation)에 의해 영향을 받는다(Konishi 등, 2015). AD 병인에 대한 다양한 해석과 설명이 있으나 크게는 amyloid cascade hypothesis과 함께 cholinergic hypothesis가 주류를 이루고 있다. 몇몇의 연구에서 ChAT 합성, ACh 분비, nicotin 및 muscarinic 수용체 감소가 AD 뇌의 대뇌피질과 해마에서 관찰되어(Tata 등, 2014) 퇴행성 뇌질환에서의 중요성이 제시되었고, 이를 배경으로 한 acetylcholinesterase inhibitors (AChEI)가 AD 증상 완화의 목적으로 미국 FDA로부터 승인되어 시판되고 있다. 본 연구에서는 인삼의 활성 성분인 진세노사이드가 다량 함유된 PGBC가 $A{\beta}42$로 유도된 치매 모델에서 뇌세포 보호, ACh 분비 증가, 학습력/기억력 증가, ChAT 발현 증가를 확인하여 인삼열매 추출물의 치매 적용 여부를 확인하고자 하였다. 결과에서 언급한 바와 같이 PGBC는 익기 직전의 4년근 인삼 열매에 추출 및 발효 단계를 추가하여 확보된 물질로서, $A{\beta}42$ 섭취, 제거 및 ACh 분비 촉진 활성이 있는 Re, Rd, Rg3 함량이 증가되어(Kim 등, 2014; Jang 등, 2015), PGBC 자체로서 치매 인자에 대한 조절 효능이 예측되었다. 특히, 7증 7포 및 발효과정을 거친 이중가공 인삼 열매 추출물이 비 발효 증포 추출물에 비해 Rg3가 현저히 증가하는 사전 연구결과와 Rg3가 $A{\beta}42$ 제거 활성을 가지는 것으로 확인된 결과를 종합할 때 PGBC 투여가 AD 증상 완화의 조절자 역할을 할 것으로 생각된다(Kim 등, 2013; Jang 등 2015). 본 연구에 따르면, 마우스 치매 모델에 PGBC 처리 시 PAT 및 Morris water-maze test를 통해 대조군 대비 유의한 수준의 인지능력 개선, ACh 합성을 유도하는 ChAT 유전자 발현 증가, ACh 분비량 증가 등이 확인되어 전체적인 인지능 개선에 극적인 영향을 준 것으로 판단된다. 특히 $A{\beta}42$를 뇌 실로 주입(intracranial injection) 하여 나타나는 뇌세포 손상이 PGBC 투여를 통해 보호된 것으로 사료되었으며, 이는 주요 뇌세포 중 하나인 성상세포에서 관찰되는 GFAP 분석을 통해 확인되었다. 뇌 균질액을 이용한 AChE 활성 연구에서도 PGBC가 AChE를 현저하게 저해하는 것으로 확인되어, AD 환자에게 처방이 가능한 2대 의약품 군중 하나인 시냅스 내 신경전달물질 ACh bioavailability 증가 목적의 처방 보조요법 적용이 기대된다(${\check{C}}olovi{\acute{c}}$ 등, 2013). 결론적으로, 본 연구에 사용된 PGBC는 학습 및 기억력을 개선하는 활성물질을 포함하고 있어 1차적인 퇴행성 뇌질환 보조재로서 직간접적인 대증요법 역할과 2차적으로는 뇌 세포 보호를 통한 질병 악화 지연 소재로 개발이 기대되며, 보다 심도 있는 기전연구를 통해 천연물 신소재 개발도 가능할 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study aimed to determine whether double-processed ginseng berry extract (PGBC) could improve learning and memory in an $A\hat{a}42$-induced Alzheimer's mouse model. Passive avoidance test (PAT) and Morris water-maze test (MWMT) were performed after mice were treated with PGBC, follow...

This study aimed to determine whether double-processed ginseng berry extract (PGBC) could improve learning and memory in an $A\hat{a}42$-induced Alzheimer's mouse model. Passive avoidance test (PAT) and Morris water-maze test (MWMT) were performed after mice were treated with PGBC, followed by acetylcholine (ACh) measurement and glial fibrillary acidic protein (GFAP) detection for brain damage. Furthermore, acetylcholinesterase (AChE) activity and choline acetyltransferase (ChAT) expression were analyzed using Ellman's and qPCR assays, respectively. Results demonstrated that PGBC contained a high amount of ginsenosides (Re, Rd, and Rg3), which are responsible for the clearance of $A{\hat{a}} 42$. They also helped to significantly improve PAT and MWMT performance in the $A{\hat{a}} 42-induced$ Alzheimer's mouse model when compared to the normal group. Interestingly, ACh and ChAT were remarkably upregulated and AChE activities were significantly inhibited, suggesting PGBC to be a palliative adjuvant for treating Alzheimer's disease. Altogether, PGBC was found to play a positive role in improving cognitive abilities. Thus, it could be a new alternative solution for alleviating Alzheimer's disease symptoms.

주제어

표/그림 (15)

그림 Fig. 1. Schematic representation of the extraction of PGBC from steam-dried ginseng berry.
표 Table 1. Test groups for the efficacy evaluation of PGBC and EGCF in Aβ-induced dementia mouse model
표 Table 2. Composition of the control and treatment groups
표 Table 3. Primer sequences used for real-time qPCR
표 Table 4. Profiles of ginsenosides analyzed from pre- and post-fermentation of PGBC (LOD, limit of detection) (μg/mg)
그림 Fig. 2. HPLC chromatogram of PGBC.
그림 Fig. 3. Acetylcholinestrase (AChE) inhibitory activity.
그림 Fig. 4. Passive avoidance performances.
그림 Fig. 5. Morris water-maze performances.
그림 Fig. 6. Effects of PGBC on the brain acetylcholine concentration in Aβ42-challenged mice.
그림 Fig. 7. Cytotoxicity of Aβ42 (7 μM) and PGBC (0.1-500 μg/mL) in F3.ChAT human neural stem cells.
그림 Fig. 8. Cytoprotective effects of PGBC (0.1-50 μg/mL) in the presence of Aβ42 (15 μM) in F3.ChAT human neural stem cells.
그림 Fig. 9. Facilitation of choline acetyltransferase (ChAT) gene expression in F3.ChAT neural stem cells by PGBC and major ginsenosides (Re, Rd and Rg3) contained in PGBC.
그림 Fig. 10. Effects of PGBC and epigallocatechin gallate (EGCG) on the activation of GFAP positive astrocytes (green) in Aβ42- challenged mice.
그림 Fig. 11 Numbers of GFAP positive astrocytes in Aβ42-challenged mice.

AI 본문요약
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문제 정의

최근 연구에 따르면 고온(120℃) 증기로 찌는 경우 Rg3, Rg5 및 Rk1이 수십배 증가하는 것으로 보고되어 항암 효능이 증가하는 것으로 보고되었다(Liu 등, 2000; Xu 등, 2007; Kim 등, 2008). 본 연구에서는 선행연구에서 도출된 특정 가공 과정을 거친(증포 및 발효) 인삼 열매 추출물이 치매 유발 물질에 의한 단기 기능 저하 회복 및 Aβ42 투여 모델에서 인지 기능 개선 효능을 확인하여 인간의 건강한 수명연장을 돕는 미래의 천연소재를 제시하고자 하였다.

제안 방법

비교 물질로는 EGCG (100 mg/kg)를 투여하였다. 시험 물질 마지막 투여 일에 동물을 에테르로 흡입 마취시킨 후 stereotaxic frame (Stoelting, IL, USA)에 고정하고, Aβ42 (5 μL, 5 mg/mL)/head로 뇌실 내(AP: −2.0, ML: 2.9, DV: −3.0 mm)로 투여하여 치매를 유발하였다.
인지 기능 결핍 유도를 위해 Aβ42 투여 48시간 후 20분 간격으로 6회의 수동 회피 시험(passive avoidance test, PAT)을, 매일 1회씩 수중 미로 시험(Morris water-maze test, MWMT)을 6일간 실시하여 학습 및 기억력을 평가하였다(Park 등, 2013). PAT(Model ENV-010MD; Med Associates, VT, USA) 실험은 어두운 방과 밝은 방으로 나누어진 수동 회피 상자의 밝은 방에 동물을 위치시키고 동물이 어두운 방으로 이동하면 1 mA로 2초간 전기 충격을 가했다.
재료 및 방법에서 제시된 분석 법에 따라 비 발효(pre-GBC), 발효(post-GBC) 및 혼합 최종 물질(PGBC)에 대한 성분분석을 수행하였다. HPLC를 이용한 진세노사이드 함량 측정 결과 발효 전후의ginsenoside 함량/peak pattern은 Table 4 및 Fig.

대상 데이터

실험동물은 체중 25 g 내외의 6주 령 수컷 마우스(ICR, C57BL/6J, Central Lab. Animal Inc., Seoul, Korea)를 구입하여 7일간 순화 과정을 거친 후 사용하였다. 실험동물은 무작위로 분리시키고 고형 사료와 물을 자유롭게 섭취하도록 하였고 실험 기간 동안 공기가 조절된 semi-SPF 실에서 23±2℃의 온도와 상대습도 55±10%, 환기 횟수 12회/시간, 조명 주기 12시간, 조도 150-300 Lux로 조절되었다.
본 연구의 시료인 인삼 열매는 경기도 연천군 인삼재배지에서 4년 이상의 인삼으로부터 수확하여 세척, 건조 및 증포(4증 4포, 7증 7포)를 시작 물질로 사용하였으며, 인삼 열매 원료의 표준화를 위해 6월 초 과육 내 씨앗이 아물기 전 초록색을 띤 단단한 열매만을 채취하였다. 시험 원료 확보를 위해 4증포 인삼 열매와 7증포 인삼 열매를 동량으로 혼합한 뒤 10배수 용량의 50% 발효 주정(Daehan Ethanol Life, Seoul, Korea)에 침지하여 상온에서 2회 추출하였다.

데이터처리

01 software (GraphPad, San Diego, CA, USA)를 이용하여 통계 처리하였다. 결과는 각 군별 mean±SD로 나타내었고 각 실험 군간 비교는 일원 분산분석(one-way ANOVA)로 분석한 후 Duncan’s multiple range tests로 p<0.05 수준에서 검증하였다.

이론/모형

HPLC 분석은 선행연구에서 표준화한 방법에 따라 수행하였다(Jang 등, 2017). 즉, 진세노사이드 분석을 위해 HPLC (UltiMate 3000 HPLC system, Thermo Fisher Scientific, MA, USA)을 사용하였다.

성능/효과

다수의 연구에서 AD 진행과 GFAP의 증가 사이에 상호연관성이 있음이 보고되었으며, 아밀로이드 반(amyloid plaque) 근처에서 성상세포의 GFAP 증가가 보고되었다(Serrano-Poza 등, 2013; Simpson 등, 2010). 본 연구에 의하면 Aβ42 치매 유발 군에서 GFAP-positive 성상세포가 다수 확인된 반면, PGBC 및 양성대조군(EGCG) 투여 군에서 GFAP 발현이 크게 감소한 것으로 나타나, PGBC 투여가 뇌 손상을 방지하여 AD 진행을 억제한 것으로 분석되었다(Fig. 10). 또한 동일 면적에 대한 GFAP-positive 성상세포 수의 비교 분석 시 치매 유발 군에서 정상 군 대비 3배 이상 증가하였으나, PGBC 투여 전 용량(100-500 mg/kg)에서 유의한 수준으로 감소함이 확인되었다(Fig.
AD는 Aβ peptides와 tau 단백질이 외에 축적되어 진행성 인지능 쇠퇴를 수반하는 신경퇴행성 뇌질환으로서(Hardy와 Selkoe, 2002; McKhann 등, 1984; Wood 등, 1986) 보다 정교한 AD 개선 효능을 평가하기 위해 Aβ peptides의 뇌내 축적과 인지능 결핍 마우스 모델이 요구된다(Hsiao 등, 1996; Wolf 등, 2016). 본 연구에서는 공간 기억/학습 능을 평가하는 수중 미로 시험 및 공포 학습을 통한 기억 능을 평가하는 수동 회피 시험을 수행하여 분석한 결과 PGBC 투여가 Aβ42로 유발되는 인지능 쇠퇴를 개선하는 것으로 판단되었으며, 이는 PGBC를 투여받은 군의 뇌에서 ACh 농도가 증가에 따른 인지능 개선 효과가 나타난 것으로 사료되었다(Fig. 6).
11). 특히, 식약처로부터 인지능 개선 효능이 인정되어 식약처로부터 건강기능식품으로 인정된 EGCG와 유사한 효능이 확인되어 PGBC가 뇌 손상을 제어하는 우수한 효능을 가지고 있는 것으로 사료되었다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	미국 FDA에 의해 승인된 치매 약물은 어떤 증상을 개선하며 치매의 경과를 늦추는데 주안점을 두고 있는가?	현재 미국 FDA에 의해 승인된 치매 약물은 근치가 아닌 증상 완화를 목적으로 하는 4종 2기전, cholinesterase inhibitor 및 NMDA (N-methyl-D-aspartate) receptor antagonists의 약물이 환자를 대상으로 처방이 되고 있을 뿐이다(Glynn-Servedio와 Ranola, 2017). AD 환자에서 다양한 원인으로부터 초래하는 acetylcholine 합성 감소에 의한 인지능 저하와, glutamate에 의한 NMDA 수용체 과 활성화가 치매증상을 점차 퇴행성으로 유도하기 때문에 현재 시판되는 약제의 대부분이 이러한 증상을 개선하여 치매의 경과를 늦추어 주는데 주안점을 두고 있다(Agatonovic-Kustrin 등, 2018; Francis 등, 2012).
	AD란?	AD는 뇌의 신경세포 사멸뿐만 아니라 학습 및 기억능 소실을 초래하는 퇴행성 뇌 질환이며, 기억과 관련된 주요 뇌 구역인 해마(hippocampus)는 콜린성 조절(cholinergic modulation)에 의해 영향을 받는다(Konishi 등, 2015). AD 병인에 대한 다양한 해석과 설명이 있으나 크게는 amyloid cascade hypothesis과 함께 cholinergic hypothesis가 주류를 이루고 있다.
	UN DESA에 따른 전 세계 치매 추정 인구는?	2017년 유엔 경제 사회 사회국(UN DESA)의 발표에 따르면 2050년까지 60세 이상 전 세계 인구가 20억 명에 도달할 것으로 추정되며, 인구 고령화에 따른 치매환자의 수도 급격히 증가할 것으로 전망하고 있다. 급격한 인구 노령화 국가로 분류되는 우리나라는 2017년 65세 이상 노인인구가 14%를 넘어 이미 고령사회에 진입하였고 노인 인구 20%의 초고령 사회를 눈앞에 두고 있다.

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