암세포 성장 억제효과가 인정된 산수유methanol 추출물의 chloroform층으로부터 silica gel column과 thin layer chromato-grapies를 이용하여 항암활성물질을 분리하고, IR, mass spectrometer, $^1H-NMR$ 및 $^{13}C-NMRs$을 통해 순수물질을 동정하였다. 이 물질은 triterpenoid로서 $C_{30}H_{48}O_3$의 구조식을 가진 화합물로 분자량이 456인 ursolic acid($3{\beta}$-hydroxyrus-12-ene-28-oic acid)로 동정되었다. 정제된 화합물을 A549 및 MCF-7 암세포주에 48시간동안 처리한 결과 농도 의존적으로 암세포주의 성장을 억제하였으며, 화합물을 처리하지 않은 대조구에 비하여 $30\;{\mu}g/mL$농도로 처리시 40% 이상 그 성장을 억제하였으며, $100\;{\mu}g/mL$농도로 처리시 90% 이상 그 성장을 억제하였다. 정제 화합물을 처리한 암세포를 광학현미경으로 관찰한 결과 뚜렷한 세포수의 감소와 함께 심한 형태학적 변화가 관찰되었다. 암세포 주에 정제시료를 $10\;{\mu}g/mL$농도로 처리하고, 15시간 배양한 후 세포주기를 분석한 결과 sub-G1 phase의 비율이 A549의 경우는 대조구에서 4.0%이었던 것이 11.7%로, MCF-7의 경우는 대조구에서 2.1%이었던 것이 처리구에서는 11.2%로 각각 증가된 것으로 나타나 정제물질은 apoptosis에 의한 세포사멸 유도를 시사하였다.
암세포 성장 억제효과가 인정된 산수유 methanol 추출물의 chloroform층으로부터 silica gel column과 thin layer chromato-grapies를 이용하여 항암활성물질을 분리하고, IR, mass spectrometer, $^1H-NMR$ 및 $^{13}C-NMRs$을 통해 순수물질을 동정하였다. 이 물질은 triterpenoid로서 $C_{30}H_{48}O_3$의 구조식을 가진 화합물로 분자량이 456인 ursolic acid($3{\beta}$-hydroxyrus-12-ene-28-oic acid)로 동정되었다. 정제된 화합물을 A549 및 MCF-7 암세포주에 48시간동안 처리한 결과 농도 의존적으로 암세포주의 성장을 억제하였으며, 화합물을 처리하지 않은 대조구에 비하여 $30\;{\mu}g/mL$농도로 처리시 40% 이상 그 성장을 억제하였으며, $100\;{\mu}g/mL$농도로 처리시 90% 이상 그 성장을 억제하였다. 정제 화합물을 처리한 암세포를 광학현미경으로 관찰한 결과 뚜렷한 세포수의 감소와 함께 심한 형태학적 변화가 관찰되었다. 암세포 주에 정제시료를 $10\;{\mu}g/mL$농도로 처리하고, 15시간 배양한 후 세포주기를 분석한 결과 sub-G1 phase의 비율이 A549의 경우는 대조구에서 4.0%이었던 것이 11.7%로, MCF-7의 경우는 대조구에서 2.1%이었던 것이 처리구에서는 11.2%로 각각 증가된 것으로 나타나 정제물질은 apoptosis에 의한 세포사멸 유도를 시사하였다.
Chloroform layer from methanol extract of Corni fructus (Cornaceae) showed strong antiproliferation effect on human cancer cell lines by SRB assay. Anticarcinogenic-active compound was isolated and purified by silica gel column and thin layer chromatograpies, and identified as ursolic acid ($3{...
Chloroform layer from methanol extract of Corni fructus (Cornaceae) showed strong antiproliferation effect on human cancer cell lines by SRB assay. Anticarcinogenic-active compound was isolated and purified by silica gel column and thin layer chromatograpies, and identified as ursolic acid ($3{\beta}$-hydroxyrus-12-ene-28-oic acid, MW:456) by mass and IR spectrophotometries, and $^1H-and\;^{13}C-NMRs$. The compound inhibited proliferation of A549 (human lung cancer cell line) and MCF-7 (human breast cancer cell line) cells in dose-dependant manner when treated for 48 hr. Inhibition rates of both cells were over 40% and 90% compared with control cells at the $30\;{\mu}g/mL\;and\;100\;{\mu}g/mL$, respectively. Morphology of cells treated with the compound for 15 hr at $10\;{\mu}g/mL$ was distorted with shrinked cell mass, and cell number was lower than that of control cells. Cell cycle analysis showed sub-G1 phase arrest in both cell lines following 15 hr exposure to the compound; % of cell phase increased to 11.7 and 11.2% compared to the control of 4.0% and 2.1% in A549 and MCP-7 cells, respectively.
Chloroform layer from methanol extract of Corni fructus (Cornaceae) showed strong antiproliferation effect on human cancer cell lines by SRB assay. Anticarcinogenic-active compound was isolated and purified by silica gel column and thin layer chromatograpies, and identified as ursolic acid ($3{\beta}$-hydroxyrus-12-ene-28-oic acid, MW:456) by mass and IR spectrophotometries, and $^1H-and\;^{13}C-NMRs$. The compound inhibited proliferation of A549 (human lung cancer cell line) and MCF-7 (human breast cancer cell line) cells in dose-dependant manner when treated for 48 hr. Inhibition rates of both cells were over 40% and 90% compared with control cells at the $30\;{\mu}g/mL\;and\;100\;{\mu}g/mL$, respectively. Morphology of cells treated with the compound for 15 hr at $10\;{\mu}g/mL$ was distorted with shrinked cell mass, and cell number was lower than that of control cells. Cell cycle analysis showed sub-G1 phase arrest in both cell lines following 15 hr exposure to the compound; % of cell phase increased to 11.7 and 11.2% compared to the control of 4.0% and 2.1% in A549 and MCP-7 cells, respectively.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 산수유의 항암효과를 구명하기 위하여 인체 폐암 세포주인 A549와 인체 유방암 세포주인 MCF-7을 대상으로 암세포 성장 억제 효과를 SRB 방법으로 측정하고, 그 활성 성분을 분리 및 동정하였으며, flow cytometry를 이용하여 분리 물질에 의한 cell cycle arrest를 조사하였다.
제안 방법
광학현미경으로 세포를 관찰하기 위해 SRB정량 분석을 하기 전에 대조구와 실험군의 세포모양 변화를 inverted microscope로 관찰하고 사진을 촬영하였다.
이를 증류수에 현탁시킨 후 hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol 및 물로 순차적으로 분획하여 이 중 활성이 강한 분획에 대하여 분리 및 정제하였다. 그 정제물질의 구조분석을 위해 1H-NMR, 13C-NMRe Bruker FT-NMR(500㎒, 125㎒) spectrometer를 이용하였으며, mass spectra는 VG Autospec ultima mass을 이용하였고, IR spectrume MIDAC prs-180 FT-IR spectrometer를 사용하였다.
25% Trypsin-EDTA용액으로 처리하여 single cell로 만든 후 well plate에 seeding한 다음 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 preincubation시킨 후 각 well에 시료를 농도별로 첨가한 다음 다시 48시간 동안 incubation시켰다. 그 후 각 well에 TCA(12%)를 가해 냉장고에서 1시간 동안 충분히 고정시키고, 증류수로 세척하고 나서 각 well에 0.4% SRB용액 100mL을 가하여 상온에서 30분 이상 염색한 후 1% 빙초산으로 세척, 건조시키고 10mM Tris buffer 100μL로 SRB 용액을 충분히 녹인 후 microplate reader(Titertek Multiscan Plus, Finland)로540㎚에서 흡광도를 측정하였다.
6%로 나타났다(Table 1). 이 중 활성이 강한 chloroform frac-tion을 silica gel(230-400 mesh, Merck)을 충진한 column(1.1 × 45.0㎝)에 흡착시키고 ethyl acetate : hexane(1 : 2d1 : 1d1 : 3)을 용매계로 하여 분취하고 TLC로 각 분획물을 전개시켜 6개의 fraction을 얻었다. 이후 활성이 나타난 fraction-4을 hexane : dichloromethane : methanol(15 : 15 : 1) 용매계로 chromatography를 실시하여 각각 30-50mL씩 분취하고 50개의 subfraction으로 나눈 뒤 TLC를 행하여 동일 spot으로 확인되는 subfraction-4를 다시 Hexane : dichloromethane = 2 : 3의 용매계로 re-chromatog-raphy를 실시하여 백색화합물 340㎎을 순수 분리하였다.
5㎏에 10배(w/v)량의 methanol을 혼합하여 80℃ 수욕상에서 3시간 동안 2회 환류 추출한 다음, 그 여액을 rotary evaporator에서 감압 농축시킨 후 동결 건조하여 조추출물 230g을 얻었다. 이를 증류수에 현탁시킨 후 hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol 및 물로 순차적으로 분획하여 이 중 활성이 강한 분획에 대하여 분리 및 정제하였다. 그 정제물질의 구조분석을 위해 1H-NMR, 13C-NMRe Bruker FT-NMR(500㎒, 125㎒) spectrometer를 이용하였으며, mass spectra는 VG Autospec ultima mass을 이용하였고, IR spectrume MIDAC prs-180 FT-IR spectrometer를 사용하였다.
0㎝)에 흡착시키고 ethyl acetate : hexane(1 : 2d1 : 1d1 : 3)을 용매계로 하여 분취하고 TLC로 각 분획물을 전개시켜 6개의 fraction을 얻었다. 이후 활성이 나타난 fraction-4을 hexane : dichloromethane : methanol(15 : 15 : 1) 용매계로 chromatography를 실시하여 각각 30-50mL씩 분취하고 50개의 subfraction으로 나눈 뒤 TLC를 행하여 동일 spot으로 확인되는 subfraction-4를 다시 Hexane : dichloromethane = 2 : 3의 용매계로 re-chromatog-raphy를 실시하여 백색화합물 340㎎을 순수 분리하였다.
항암 활성 분리물질이 암세포주에 있어서 cell cycle의 어느 단계를 지연시키는지를 flow cytometry를 이용하여 비교 분석하였다. 즉, monolayer로 자란 A549 및 MCF-7 세포에 0.
회수한 세포는 eth- anol을 첨가하여 고정한 후 centrifuge 시켜 상층액을 폐기하고 PBS를 첨가하여 교반한 후 다시 centrifuge시켜 세포를 회수하였다. 회수한 세포는 propidium iodide(PI)와 RNAase를 첨가하고, 암소에서 37℃, 30분간 반응시킨 후 flow cytometer (EPICS XL, Backman Couter, USA)를 이용하여 세포의 주기를 분석하였다 (15).
대상 데이터
산수유는 2000년 10월에 전남 구례군 산동면에서 수확하여 씨를 제거한 건조과실을 구입하여 냉장보관하면서 실험에 사용하였다.
이론/모형
본 실험에서는 인체 폐암 세포주인 A549와 인체 유방암 세포주인 MCF-7를 사용하였으며, 세포증식 정도는 SRB assay 법에 따라 측정하였다(13, 14). 즉, monolayer로 배양중인 암세포 주를 0.
성능/효과
1H-NMR에서 0.89, 0.95, 1.00, 1.02, 1.05, 1.23 및 1.24ppm에서 7개의 methyl signal과 2.64 ppm에서 18-H doublet signal과 3.46ppm에서 3번 위치의 oxymethine 수소 및 5.49ppm에서 12번 위치의 methin proton signal을 확인하여 urs-12-en type의 구조임을 알 수 있었으며(Table 2)(23), 13C-NMR (C6D6N)spectrum에서는 515.70, 16.60, 17.55, 21.44, 23.94 및 28.84ppm에서는 methyl carbon signal이 관찰되고, 5125.68, 139.30ppm에 oleafinic carbon signal, 5179.91ppm에 carboxyl carbon signal 이 78.15 ppm에 oxygen bearing carbon signal이 관찰되었다(Table 2). Deft 135o (C6D60spectrum에서는 518.
15 ppm에 oxygen bearing carbon signal이 관찰되었다(Table 2). Deft 135o (C6D60spectrum에서는 518.80, 23.65, 24.94, 28.16, 28.71, 31.10, 33.60, 37.47 및 39.40ppm에서 9개의 carbon이 negative로 나타난 것으로 보아, 9개의 methylene group이 존재함을 알 수 있었다(Fig. 6)(24).
암세포주에 정제시료를 10㎍/mL농도로 처리하고, 15시간 양한 후 P.I.(propidium iodide) staining하여 flow cytometry로세포주기를 분석한 결과 sub-G1 phase의 비율이 A549의 경우는 대조구에서 4.0%이었던 것이 11.7%로, MCF-7의 경우는 대조구에서 2.1%이었던 것이 처리구에서는 11.2%로 각각 증가된것으로 나타나 정제물질은 apoptosis에 의한 세포사멸 유도를 시사하였다(Fig. 3).
50g이었다. 이들 용매 분획물을 A549 및 MCF-7 세포에 첨가하고 48시간 배양한 후 이들의 성장 억제 율을 측정한 결과 hexane 및 chloroform 분획물에서 높게 나타났는데, 500㎍/mL의 처리시 hexane 분획물의 경우는 A549 및 MCF-7 세포에서 각각 54.8 및 75.8%로 나타났고, chloroform 분획물의 경우는 각각 71.0 및 83.6%로 나타났다(Table 1). 이 중 활성이 강한 chloroform frac-tion을 silica gel(230-400 mesh, Merck)을 충진한 column(1.
이상의 각종 spetral data의 검토결과, 이 화합물은 분자 내에 double bond,-OCH- 및 carboxyl group을 각각 1개씩 갖고 있는 triterpenoid로서 C30H48O3의 구조식을 가진 화합물로 분자량이 456인 ursolic acid(3 P-hydroxyrus-12-ene-28-oic acid)로 확정 짓고, ursolic acid 표준품(Sigma)과 co-spot를 실시하여 동일한 Rf치임을 확인하였다(Fig. 7).
1에 나타난 바와 같다. 화합물의 처리 농도가 30㎍/mL(66uM)일 때 2종류의 암세포 모두 60% 이하의 생존율을 나타내었고, 100㎍/mL(219uM) 농도에서는 10% 이하의 생존율을 나타내었다.
후속연구
또한 Hah 등(17)은 비파엽의 ursolic acid가 CBA/J수컷 생쥐의 간암 생성을 억제한다고 보고한 바 있다. 하지만 이들 결과는 A549 세포에 대하여 이미 항암제로 사용되고 있는 Tax이의 ED50이 137ng/mL 이라는 보고(18)와 비교할 때 그 활성이 약하지만 식품 속에 함유된 성분으로서 암세포의 성장을 억제한다는 것은 그 의의가 있는 것으로 사료되며, 이들을 함유한 식품재료를 이용한 기능성 식품의 개발도 가능하리라 생각된다.
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