산수유를 기능성식품 소재로서 이용하기 위하여 산수유 에탄올추출물의 생리활성을 조사하였다. 산수유 에탄올추출물의 수소공여능은 농도 의존적으로 증가되었으며, 300 및 $500{\mu}g/mL$ 농도에서 각각 64, 73%의 활성을 나타내었다. 대식세포 RAW264.7에 산수유 에탄올추출물을 100, 300 및 $500{\mu}g/mL$의 농도로 처리하였을 때 산수유추출물은 농도 의존적으로 NO(nitric oxide)의 생성을 유도하였다. 또한 산수유 에탄올추출물을 유방암세포에 다양한 농도로 처리하여 24, 48, 72시간 반응시킨 결과 농도 및 시간에 의존적으로 유방암세포의 증식을 억제하였으며, $500{\mu}g/mL$ 농도로 72 시간 처리 시 60% 이상의 높은 증식억제율을 보여주었다. 또한, MCF-7 유방암 세포에 bisphenol과 $17{\beta}$-estradiol과 같은 환경호르몬을 $0.1{\mu}M$의 농도로 처리하였을 때 세포의 증식이 유도되었으며, 이 세포에 산수유 에탄올추출물을 농도별로 72시간 처리하였을 때 유방암 세포의 증식이 억제되었다. 따라서 본 연구결과는 산수유의 기능성식품 소재로서의 활용 가능성을 시사한다.
산수유를 기능성식품 소재로서 이용하기 위하여 산수유 에탄올추출물의 생리활성을 조사하였다. 산수유 에탄올추출물의 수소공여능은 농도 의존적으로 증가되었으며, 300 및 $500{\mu}g/mL$ 농도에서 각각 64, 73%의 활성을 나타내었다. 대식세포 RAW264.7에 산수유 에탄올추출물을 100, 300 및 $500{\mu}g/mL$의 농도로 처리하였을 때 산수유추출물은 농도 의존적으로 NO(nitric oxide)의 생성을 유도하였다. 또한 산수유 에탄올추출물을 유방암세포에 다양한 농도로 처리하여 24, 48, 72시간 반응시킨 결과 농도 및 시간에 의존적으로 유방암세포의 증식을 억제하였으며, $500{\mu}g/mL$ 농도로 72 시간 처리 시 60% 이상의 높은 증식억제율을 보여주었다. 또한, MCF-7 유방암 세포에 bisphenol과 $17{\beta}$-estradiol과 같은 환경호르몬을 $0.1{\mu}M$의 농도로 처리하였을 때 세포의 증식이 유도되었으며, 이 세포에 산수유 에탄올추출물을 농도별로 72시간 처리하였을 때 유방암 세포의 증식이 억제되었다. 따라서 본 연구결과는 산수유의 기능성식품 소재로서의 활용 가능성을 시사한다.
In order to use Corni fructus as functional food materials, we investigated the biological activities of ethanol extracts from Corni fructus (EECF). The hydrogen-donating activity of EECF was increased in a dose dependent manner compared with untreated control, and the activities by EECF were 64 and...
In order to use Corni fructus as functional food materials, we investigated the biological activities of ethanol extracts from Corni fructus (EECF). The hydrogen-donating activity of EECF was increased in a dose dependent manner compared with untreated control, and the activities by EECF were 64 and 74% at 300 and $500{\mu}g/mL$ concentration, respectively. The NO productions in the RAW264.7 marcrophage cells treated with EECF were increased in dose dependent manners. EECF significantly inhibited the growth of MCF-7 human breast cancer cells in dose and time dependent manners. EECF of $500{\mu}g/mL$ concentration inhibited the proliferation by over 60% in the MCF-7 cells when treated for 72 hr. Also, the proliferations were increased in the MCF-7 cells cultured in the charcoal-treated FBS (cFBS) medium with environmental hormones such as bisphenol or $17{\beta}$-estradiol of $0.1{\mu}M$ whereas the proliferations were decreased in the MCF-7 cells treated with the environmental hormones after treatment of EEFC for 72 hr. The results suggest that Corni fructus would be used as functional food materials.
In order to use Corni fructus as functional food materials, we investigated the biological activities of ethanol extracts from Corni fructus (EECF). The hydrogen-donating activity of EECF was increased in a dose dependent manner compared with untreated control, and the activities by EECF were 64 and 74% at 300 and $500{\mu}g/mL$ concentration, respectively. The NO productions in the RAW264.7 marcrophage cells treated with EECF were increased in dose dependent manners. EECF significantly inhibited the growth of MCF-7 human breast cancer cells in dose and time dependent manners. EECF of $500{\mu}g/mL$ concentration inhibited the proliferation by over 60% in the MCF-7 cells when treated for 72 hr. Also, the proliferations were increased in the MCF-7 cells cultured in the charcoal-treated FBS (cFBS) medium with environmental hormones such as bisphenol or $17{\beta}$-estradiol of $0.1{\mu}M$ whereas the proliferations were decreased in the MCF-7 cells treated with the environmental hormones after treatment of EEFC for 72 hr. The results suggest that Corni fructus would be used as functional food materials.
Monolayer로 자란 유방암세포를 0.25% trypsin-EDTA를 처리하여 single 세포로 만든 후 최종 세포농도가 1×105cells/mL로 되도록 희석하여 24 well plate에 각 well 당 분주한 다음 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 배양한 후, 산수유 에탄올추출물을 농도별로 첨가하여 24, 48 및 72시간 동안 배양한 후 세포 증식을 SRB(sulforhodamine) 방법(21) 및 세포를 single로 만들어 혈구계산반을 이용하여 세포를 counting 하였다.
Serum의 estrogen 활성을 최소화하기 위해 FBS에 5%charcoal 을 처리하여 55℃에서 30분 동안 교반한 후 3,000rpm, 4℃, 20분 원심분리 하여 상등액을 취하였고, 이를 2회 반복하여 얻은 상등액을 0.45 μL microfilter로 여과하여 cFBS(charcoal treatment FBS)를 얻은 후 -20℃에서 보관하며 실험에 사용하였다(20).
1% 되게 조제하였으며, 시료 1 mL과 5×10-4M DPPH 용액(DPPH 12 mg 100 mL 에탄올에 완전히 용해시킨 후 100 mL의 증류수를 가한 용액) 3 mL를 혼합하고 암실에서 30분 반응한 후 흡광도를 측정하였다. 대조구는 시료 대신 ethanol을 첨가하였으며 수소공여능을 대조구에 대한 흡광도의 감소비율로 나타내었다.
대조구로 사용한 BHT의 농도는 0.1% 되게 조제하였으며, 시료 1 mL과 5×10-4M DPPH 용액(DPPH 12 mg 100 mL 에탄올에 완전히 용해시킨 후 100 mL의 증류수를 가한 용액) 3 mL를 혼합하고 암실에서 30분 반응한 후 흡광도를 측정하였다.
대조구와 실험군의 세포모양 변화를 관찰하기 위해 암세포증식 억제능을 측정하기 전에 광학현미경으로 세포의 형태학적 변화를 관찰하였다
대식세포는 박테리와 같은 항원이 침입하였을 때, 일차적인 면역반응을 담당하는 세포로서, 이러한 박테리아를 사멸시키기 위해 대식세포는 다양한 물질을 분비하며, 이중에서 일산화질소(mitric oxide)가 대표적인 물질로 알려져 있다(22). 따라서 산수유 에탄올추출물이 대식세포의 일산화질소 생산에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위하여 대식세포주인 RAW264.7에 산수유 에탄올추출물을 농도별로 처리하여 48시간 배양한 후, 배양액 중의 대식세포가 생산한 일산화질소로부터 산화된 NO2-를 농도를 측정한 결과는 Fig. 2와 같다. 즉 산수유 에탄올추출물을 1, 10 및 50 μg/mL 농도로 처리한 실험군에서는 NO 생성량이 각각 9.
산수유 에탄올추출물이 MCF-7 세포의 증식을 억제하는지를 알아보기 위하여 산수유 에탄올추출물을 300 및 500 μg/mL농도로 처리하고 24시간 배양한 후 세포의 형태학적 변화를 광학현미경으로 대조군과 비교하여 관찰한 결과는 Fig. 5와 같다.
incubator에서 24시간 배양하였다. 상층을 제거한 후 1% cFBS phenol free RPMI1640 배지, 환경호르몬과 산수유 에탄올추출물을 농도별 처리하여 일정시간 동안 배양한 후 SRB 방법으로 그 억제능을 측정하였다.
세포 배양액과 Griess reagent를 동량으로 혼합하여 10분간 반응시킨 후 540 nm에서 microplate-ELISA reader(Titertek Multiscan Plus, Finland)로 흡광도를 측정하여 NaNO2를 32μM까지 2배씩 희석하여 얻은 표준곡선과 비교하여 NO 생성량을 계산하였다.
7세포를 96 well culture plate에 1×105 cells/well로 분주하였다. 세포를 안정화시킨 후 산수유 에탄올추출물을 농도별로 처리하여 48시간 더 배양하고 각 조건에 따른 NO생성 정도를 측정하였다. 반응 종료 후 NO2-(nitrite)의 생성량을 Griess 반응을 이용하여 측정하였다(19).
시료에 대한 수소공여능은 a,a'-diphenyl-β-picrylhydrazine(DPPH)의 환원성을 이용하여 540 nm에서 UV/Visspectrophotometer로 측정하였다(18).
산수유 10 g 당 80% 에탄올 200 mL의 비율로 첨가하여 65℃에서 3시간 동안 3회 열수추출하고 여과하였다. 이 여과액을 회전식감압농축기(EYELA, Rikakikai Co., Japan)로 감압․농축하여 에탄올을 완전히 제거시킨 후 동결건조기를 이용하여 건조한 후 수율을 계산하였다.
즉 bisphenol A와 17β-estradiol을 산수유 에탄올추출물을 처리하기 전에 0.1 μM의 농도로 처리하여 암세포의 증식을 유도한 후 산수유 에탄올추출물을 농도별로 처리하여 72시간 후에 그 활성을 측정하였다.
대상 데이터
본 실험에 사용된 산수유는 2007년 10월에 전남 구례군에 서 수확하여 씨를 제거한 건조과실을 구입하여 분쇄시켜 4℃ 냉동고에 보관하였다.
본 실험에 사용한 인체 유방암 세포주인 MCF-7(breastcarcinoma)를 한국세포주은행(KCLB)에서 분양받아 10%FBS(fetal bovine serum)를 첨가한 RPMI1640 배지를 첨가하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 계대배양하면서 실험에 사용하였다.
데이터처리
Significant differences were compared with control at * p<0.05 by Student t-test.
Significant differences were compared with the control at * p<0.05 by Student t-test.
대조군과 실험군 간의 통계적 유의성에 대한 검증은 Student's t-test를 이용하여, p-value가 0.05 미만일 때 통계적으로 유의성이 있다고 판단하였다
실험결과는 평균과 표준편차로 표시하였으며, 각 실험군을 대조군에 대한 백분율로 나타내었다. 대조군과 실험군 간의 통계적 유의성에 대한 검증은 Student's t-test를 이용하여, p-value가 0.
이론/모형
세포를 안정화시킨 후 산수유 에탄올추출물을 농도별로 처리하여 48시간 더 배양하고 각 조건에 따른 NO생성 정도를 측정하였다. 반응 종료 후 NO2-(nitrite)의 생성량을 Griess 반응을 이용하여 측정하였다(19).세포 배양액과 Griess reagent를 동량으로 혼합하여 10분간 반응시킨 후 540 nm에서 microplate-ELISA reader(Titertek Multiscan Plus, Finland)로 흡광도를 측정하여 NaNO2를 32μM까지 2배씩 희석하여 얻은 표준곡선과 비교하여 NO 생성량을 계산하였다.
성능/효과
Bisphenol A와 17βestradiol에 의해 유방암세포는 대조구에 비하여 2배 정도의 증식을 보였으며, 산수유 에탄올추출물이 첨가된 실험군에서는 앞서 유방암세포주에 대한 산수유추출물 억제 실험의 결과와 마찬가지로 농도에 의존적으로 bisphenol A와 17β-estradiol에 의해 유도되어진 암세포의 증식을 억제하였다.
5와 같다. 대조구 세포는 세포막을 유지하며 plate의 기벽에 부착되어 있었으나 산수유 에탄올추출물을 처리한 실험군은 사멸한 세포가 배양 plat에서 떨어져 배지에 부유하는 것을 관찰할 수 있었고, 대조구에 비하여 세포의 밀도 감소현상과 세포 모양변화가 관찰되어 산수유 에탄올추출물이 MCF-7세포의 증식을 저해함을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 연구 결과에서도 산수유 에탄올추출물이 항산화 활성을 나타내는 것으로 미루어볼 때, 항산화 작용을 일으키는 물질들이 이 추출물에 함유되어 있음을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 연구결과에서도 산수유 에탄올추출물이 유방암세포의 성장을 억제함을 확인할 수 있었으며, 이는 산수유내에 함유된 인체 암세포억제 효능을 가진 ursolic acid와 같은 항암물질 등에 의해 기인되는 것으로 생각된다(17).
3).또한 trypan blue 염색을 통한 결과에서도 시간 및 농도에 의존하여 세포의 증식을 억제하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4). Kim 등(17)의 연구에서 산수유 에탄올추출물은 폐암세포주(A549)와 유방암세포주(MCF-7)의 증식을 유의하게 억제시켰으며, 암세포의 세포주기를 변화시키는 등 항암에 효과가 있다고 보고하였다.
또한 산수유 에탄올추출물을 유방암세포에 다양한 농도로 처리하여 24, 48, 72시간 반응시킨 결과 농도 및 시간에 의존적으로 유방암세포의 증식을 억제하였으며, 500 μg/mL 농도로 72시간 처리 시 60% 이상의 높은 증식억제율을 보여주었다.
또한, MCF-7 유방암 세포에 bisphenol과 17β-estradiol과 같은 환경호르몬을 0.1 μM의 농도로 처리하였을 때 세포의증식이 유도되었으며, 이 세포에 산수유 에탄올추출물을 농도별로 72시간 처리하였을 때 유방암 세포의 증식이 억제되었다.
산수유 에탄올추출물을 100, 300 및 500 μg/mL의 농도로 수소공여능을 측정한 결과 농도 의존적으로 항산화 효과를 나타냈으며, 500 μg/mL 농도의 경우 합성항산화제보다는 효과가 낮았지만, 73% 이상의 항산화 활성을 나타내어 그 효과를 확인할 수 있었다.
즉 산수유 에탄올추출물을 1, 10 및 50 μg/mL 농도로 처리한 실험군에서는 NO 생성량이 각각 9.65, 11.44 및12.34 μM로 나타났다.
즉 산수유에탄올추출물은 대조구에 비하여 시간 및 농도에 의존적으로 암세포의 증식을 억제하였으며, SRB 방법으로 암세포성장억제 효과를 측정한 결과 산수유 에탄올추출물을 처리 후24, 48 및 72시간 배양 시 500 μg/mL 농도에서 유방암세포의 성장 억제율이 각각 44, 52 및 63%으로 나타났다(Fig. 3).
후속연구
따라서 산수유에는 면역능을 증가시킬 수 있는 성분들이 함유되어 있다는 것을 추측할 수 있으나, 앞으로 산수유 에탄올추출물에 함유되어 있는 물질을 분리하여 보다 구체적인 실험을 수행해야 할 것으로 사료된다.
산수유의 화학성분에 관한 연구는 gallic acid, malic acid, tartaric acid, ursolic acid, morroniside, loganin, sweroside등과 같은 배당체, tellimagrandin 1,2, 1,2,3-tri-O-galloylβ-D-glucose, 1,2,6-tri-O-galloyl-β-D-glucose, 1,2,3,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucose, gemin D, 탄닌 성분으로 cornusin A-G, 2,3-di-O-galloyl-D-glucose, 1,7-di-Ogalloyl-D-sedoheptullose 등이 분리 보고되었다(5,6). 산수유에 대한 연구로는 산수유 열매의 렉틴성분(2), 영양성분(7), 산수유 종자의 항당뇨 효과(8), 물 추출물의 항히스타민효과(9), 부종억제효과(10), 납에 의한 조직손상 억제(11), 정자 운동성 증가에 미치는 효과(12), 항균효과(13), 티로시나제 저해작용(14), 항산화(15,16) 및 항암 효과(17) 등이 보고되고 있으나, 아직은 이에 대한 체계적인 연구가 미흡한 실정으로 산수유의 유용성분을 산업적으로 이용하기 위해서는 더욱 많은 연구가 진행되어야 할 것으로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
산수유에탄올추출물의 생리활성을 조사하기 위한 연구 결과는 어떻게 되는가?
산수유를 기능성식품 소재로서 이용하기 위하여 산수유에탄올추출물의 생리활성을 조사하였다. 산수유 에탄올추출물의 수소공여능은 농도 의존적으로 증가되었으며, 300및 500 μg/mL 농도에서 각각 64, 73%의 활성을 나타내었다. 대식세포 RAW264.7에 산수유 에탄올추출물을 100, 300 및500 μg/mL의 농도로 처리하였을 때 산수유추출물은 농도 의존적으로 NO(nitric oxide)의 생성을 유도하였다. 또한 산수유 에탄올추출물을 유방암세포에 다양한 농도로 처리하여 24, 48, 72시간 반응시킨 결과 농도 및 시간에 의존적으로 유방암세포의 증식을 억제하였으며, 500 μg/mL 농도로 72시간 처리 시 60% 이상의 높은 증식억제율을 보여주었다. 또한, MCF-7 유방암 세포에 bisphenol과 17β-estradiol과 같은 환경호르몬을 0.1 μM의 농도로 처리하였을 때 세포의증식이 유도되었으며, 이 세포에 산수유 에탄올추출물을 농도별로 72시간 처리하였을 때 유방암 세포의 증식이 억제되었다. 따라서 본 연구결과는 산수유의 기능성식품 소재로서의 활용 가능성을 시사한다.
산수유는 무엇의 치료제로 사용되어 왔는가?
산수유(Corni fructus)는 층층나무과에 속하는 산수유나무(Cornus officinalis)의 과육으로, 가을에 성숙한 붉은색 열매의 씨를 제거한 건조한 과육을 산수유라 하며(2), 예로부터 우리나라를 비롯하여 중국과 일본 등에서 중요한 한약재로 많이 사용되어 왔다(3). 산수유는 그 맛이 시고 성질은 따뜻하며, 다뇨증, 요통, 이명, 폐결핵 등의 치료제로 사용되어 왔으며, 그 과실은 자양, 강장, 음위, 이조에 약효가 있고, 간경화, 신경에 좋고, 이뇨작용, 혈압강하작용, 항암 및 항균작용 등의 약리작용이 있다고 한방자료에 기록되어 있다(4).산수유의 화학성분에 관한 연구는 gallic acid, malic acid, tartaric acid, ursolic acid, morroniside, loganin, sweroside등과 같은 배당체, tellimagrandin 1,2, 1,2,3-tri-O-galloylβ-D-glucose, 1,2,6-tri-O-galloyl-β-D-glucose, 1,2,3,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucose, gemin D, 탄닌 성분으로 cornusin A-G, 2,3-di-O-galloyl-D-glucose, 1,7-di-Ogalloyl-D-sedoheptullose 등이 분리 보고되었다(5,6).
산수유는 무엇인가?
산수유(Corni fructus)는 층층나무과에 속하는 산수유나무(Cornus officinalis)의 과육으로, 가을에 성숙한 붉은색 열매의 씨를 제거한 건조한 과육을 산수유라 하며(2), 예로부터 우리나라를 비롯하여 중국과 일본 등에서 중요한 한약재로 많이 사용되어 왔다(3). 산수유는 그 맛이 시고 성질은 따뜻하며, 다뇨증, 요통, 이명, 폐결핵 등의 치료제로 사용되어 왔으며, 그 과실은 자양, 강장, 음위, 이조에 약효가 있고, 간경화, 신경에 좋고, 이뇨작용, 혈압강하작용, 항암 및 항균작용 등의 약리작용이 있다고 한방자료에 기록되어 있다(4).
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